Experimental
Etiquetado de RuBisCo:
Aedans(454): donante F(58): aceptador
Estudios de unión:
Términos:
Bala ADP: Complejo GroEL unido a GroES y ADP
ApoGroEL: Just GroEL comlex (utilizado en estudios previos de unión del sustrato de RuBisCo)
Lin et al. se determinó que:
1. Hubo una diferencia en la unión del TRASTE sobre el sustrato al anillo trans de bala ADP vs. anillo apoGroEL.
– Esto fue evidente por el enfriamiento de la fluorescencia del donante (B.)
– Esto indica una diferencia en la conformación del sustrato proteico.
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2. Se encontró un despliegue «pasivo» de proteínas de sustrato unidas al anillo de apoGroEL.
– Sin embargo, este despliegue ocurrió mucho más lento que el ciclo de reacción funcional de GroEL.
3. Hay menos despliegue «pasivo» del sustrato unido al trans-anillo de bala ADP.
– Confirmó esto con estudios de digestión de proteasas.
– Sin embargo, este es el complejo más relevante fisiológicamente.
– Entonces, ¿es este un nivel de máxima efectividad, o solo el primer paso en el ciclo de reacción?
Para probar la relevancia fisiológica, agregaron ATP a la Reacción de Bala ADP y monitorearon el TRASTE
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Al agregar ATP, encontraron que: – Una expansión inicial de conformación rápida y forzada del sustrato – y luego una fase de compactación más lenta – Evidente en la figura b |
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-La figura c indica que la cinética de la fase de compactación depende de la concentración de GroES, lo que significa que depende del mecanismo de retención del complejo.
– Mientras que la fase de expansión es independiente de la concentración de GroES.
Concluyó que hay dos fases de despliegue:
– Despliegue pasivo lento debido a la unión del sustrato al anillo trans de la Cámara de GroEL(del primer experimento de unión)
– Despliegue rápido impulsado por ATP debido al cambio de conformación de la cámara de GroEL.
El despliegue rápido no depende de los GroES:
– Un exceso de una variante de GroEL de un solo anillo, SR1 se utilizó como trampa de GroES.
– SR1 es incapaz de unirse al sustrato y catalizar una reacción de despliegue,pero es capaz de unirse y secuestrar GroES para determinar la dependencia de la reacción en el secuestro del sustrato.
– Determinaron que el despliegue rápido monitorizado por TRASTE se produjo sin la tapa de GroES presente, y la fase de compactación posterior no lo hizo.
– Esto indica que la fase de expansión rápida depende del cambio de conformación del GroEL inducido por la unión de ATP.
Así .. ¿es necesario desplegar el sustrato para un plegado productivo?
– ¿Es este un paso esencial e importante para el mecanismo de plegado de GroEL/GroES?Encontraron que la fracción de RuBisCo no nativo que emerge en el estado nativo es proporcional a la extensión del despliegue.
– Para examinar esto , querían medir el despliegue lento y pasivo del sustrato debido a la unión de GroEL sola(no dependiente de ATP
)
– Nuevamente utilizaron la unión SR1 al sustrato, esta vez no como atrapada, sino como un sitio de unión de despliegue pasivo para el sustrato.
– El tiempo de incubación con SR1 se correlaciona con la cantidad de desdoblamiento, ya que el desdoblamiento se debe SOLO a la unión del sustrato.
– Determinaron que hay una correlación entre la cantidad de despliegue a la proteína nativa.
– Por lo tanto, el despliegue forzado de GroEL/GroES es una forma eficiente de promover el mecanismo de despliegue necesario para el plegado adecuado de proteínas.
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