- Resumen
- 1. Introducción
- 2. Métodos
- 2.1. Materiales
- 2.2. Conejos y Preparación de tejidos
- 2.3. Evaluación histológica del cartílago
- 2.4. Ensayo TUNEL
- 2.5. PCR cuantitativa fluorescente
- 2.6. Análisis estadístico
- 3. Resultados
- 3.1. La Degeneración Histológica Inducida por el TLC en Conejos Se Redujo mediante DHJST
- 3.2. El DHJST inhibió la apoptosis de las células del cartílago
- 3.3. La inhibición de la Expresión de VEGF y HIF-1α en Células de Cartílago Se Asocia con DHJST Ejerce un Efecto Terapéutico
- 4. Discusión
- 5. Conclusiones
- Financiación
Resumen
Du-Huo-Ji-Sheng-Tang (DHJST) es una medicina herbal tradicional china utilizada para tratar la osteoartritis. En el presente estudio, se investigó el efecto terapéutico del DHJST sobre la degradación del cartílago en un modelo de osteoartritis de conejo. En las articulaciones de la rodilla de conejos, se realizó una transección del ligamento cruzado anterior (ACLT) para inducir osteoartritis experimental. Al final de la sexta semana, 30 conejos con TLC se dividieron en seis grupos, grupo control, grupo DHJST y grupo Osaminetacina (AOS), que se siguieron durante otras 4 semanas. Los otros tres grupos de conejos con TLC no fueron tratados con DHJST o AOS, que se sacrificaron después de 6 semanas y sirvieron como controles de punto de tiempo de 6 semanas. Los resultados indicaron que al final de la sexta semana después de la cirugía, hubo una degeneración histológica significativa en el grupo control en comparación con el grupo normal. En el grupo de control, la puntuación media de la degeneración histológica aumentó aún más a la 10a semana, y la puntuación media de la degeneración histológica fue significativamente menor en el grupo de DHJST en comparación con el grupo de control. Para investigar el mecanismo potencial, se detectó el nivel de expresión de VEGF e HIF-1α. La expresión del ARNm VEGF y el ARNm HIF-1α son bajos en el grupo normal, mientras que las actividades aumentan gradualmente en el grupo control. Sin embargo, en comparación con el grupo del mismo modelo de punto de tiempo, la actividad de VEGF y HIF-1α disminuyó significativamente en el grupo DHJST. En conclusión, el DHJST ejerce un efecto terapéutico significativo en conejos con osteoartritis, y los mecanismos están asociados con la inhibición de la expresión de VEGF e HIF-1α.
1. Introducción
La osteoartritis (OA) es una enfermedad progresiva y debilitante que puede tardar años en manifestarse clínicamente en los individuos afectados. El envejecimiento del cartílago y la senescencia de los condrocitos desempeñan un papel importante en la patogénesis y el desarrollo de la osteogénesis imperfecta. Durante el desarrollo de OA, a menudo hay un aumento focal en la muerte celular. Muchos informes revelaron que la senescencia de los condrocitos contribuye al riesgo de degeneración del cartílago al disminuir la capacidad de los condrocitos para mantener y reparar el tejido del cartílago articular . Dado que se teoriza que cada condrocito es responsable del mantenimiento de la matriz extracelular que lo rodea, y que las moléculas de matriz producidas en una región del tejido tienen una capacidad muy limitada para atravesar el tejido, la pérdida focal de células viables podría ser parcialmente responsable de la incapacidad de los tejidos para reparar daños menores .
Actualmente, no existe una cura para la OA, y los tratamientos disponibles solo ralentizan la progresión de la enfermedad . Durante los últimos 20 años, la Medicina Tradicional China (MTC) ha experimentado un avance significativo contra la osteoartritis, por ejemplo, en la mejora de los hallazgos clínicos de los pacientes, la inhibición de la reacción inflamatoria y la degeneración del cartílago . El estudio in vivo e in vitro también mostró que la fórmula de hierbas chinas es de múltiples acciones integrales contra el OA . Du-Huo-Ji-Sheng-Tang, que se compone de Radix Angelicae Pubescentis, Herba Taxilli, Herba Taxilli, Radix Acanthopanacis Bidentatae, Herba Asari, Radix Gentianae Macrophyllae, Cortex Cinnamomi y Poria, se ha utilizado ampliamente para tratar el AA. Puede mejorar los síntomas clínicos, la función de la rodilla y la calidad de vida de los pacientes . Con base en nuestro conocimiento sobre la patogénesis de la osteogénesis imperfecta en la MTC, investigamos el efecto de la DHJST en la prevención de la degeneración del cartílago de la osteogénesis imperfecta en conejos y observamos sus mecanismos.
2. Métodos
2.1. Materiales
El sistema de detección de apoptosis colorimétrica sin salida (ensayo TUNEL) se obtuvo de Nanjing Jiancheng Biotech Company (China). El kit de extracción de ARN total Trizol, el marcador molecular de ADN, la Premezcla SYBR EX TaqTM y el kit de tiempo Real Perfecto se compraron en the Invitrogen Co. (USA). Hierbas en DJST (compuesto por Radix Angelicae Pubescentis, Herba Taxilli, Herba Taxilli, Radix Acanthopanacis Bidentatae, Herba Asari, Radix Gentianae Macrophyllae, Cortex Cinnamomi y Poria, proporcionado por Shanghai Huayu Chinese Herbs Co. Ltd., China) fueron acreditados por un farmacognosista de acuerdo con los protocolos estándar, preparados por el Hospital Municipal de Shanghai de Medicina Tradicional China, los componentes se mezclaron en orden con la proporción de 2 : 1 : 1 : 1 : 0.2 : 1 : 0.3 : 1 (peso seco), los medicamentos se extrajeron con métodos estándar de acuerdo con la Farmacopea China (Farmacopea y Comité de China, 2000). Estos medicamentos crudos se empaparon en agua destilada y se hervieron durante 30 minutos dos veces, y la solución del medicamento se filtró a través de una malla, luego el filtrado se concentró a 4 g mL−1 mediante una bomba de vacío y luego se almacenó a -20°C hasta su uso. Osaminetacina (AOS), cada comprimido contiene 25 mg de indometacina y 75 mg de aminoglucosa (suministrados por Hebei Jizhong Pharmaceutical Co. Ltd., China), se utilizó como medicamento de control positivo.
2.2. Conejos y Preparación de tejidos
Conejos blancos neozelandeses de cuarenta y ocho meses de edad fueron suministrados por el Centro de Animales Experimentales a la Academia China de Ciencias. Treinta conejos se sometieron a una transección unilateral del ligamento cruzado anterior (LCA) bajo anestesia general. Los conejos normales no se sometieron a un procedimiento.
Al final de la sexta semana, los 30 conejos con TLC se dividieron en seis grupos, grupo control, grupo DHJST y grupo AOS, los cuales fueron seguidos por otras 4 semanas. Los otros tres grupos de conejos con TLC no fueron tratados con DHJST o AOS, que se sacrificaron después de 6 semanas y sirvieron como controles de punto de tiempo de 6 semanas. Las decocciones se administraron por vía oral a la dosis 0.923 g (kg−1·d−1) durante 4 semanas, a los conejos del grupo AOS se les administró AOS 0,09 g (kg−1·d−1) durante un período de 4 semanas, al grupo de control modelo y al grupo normal se les administró oralmente con el mismo volumen de solución salina fisiológica.
Se sacrificaron conejos para el muestreo. El protocolo recibió la aprobación del comité de Experimentos con Animales del Centro Médico Universitario de Shanghai (China). Se extirpó la tibia del conejo y el cartílago articular de la tibia se almacenó inmediatamente a -80 ° C. Las tibias se diseccionaron cuidadosamente y se eliminaron del músculo adyacente y se fijaron inmediatamente en formalina al 10% durante 24 horas. Posteriormente, las tibias se descalcificaron durante 4 semanas en ácido etilendiamina tetraacético de 100 g/L, se lavaron en PBS, se deshidrataron a través de una serie de etanol y se incrustaron en parafina de manera estandarizada para garantizar una orientación adecuada. Se cortaron secciones de tejido de parafina (7 µm) de forma estandarizada. Las secciones se desparafinizaron para análisis histoquímicos.
2.3. Evaluación histológica del cartílago
Se realizó una evaluación histológica de las articulaciones femorotibiales de conejos en el grupo DHJST, el grupo AOS y el grupo control. Las secciones fueron teñidas con Safranina O-fast green. Estas secciones histológicas de cada sitio se evaluaron utilizando un sistema de clasificación de Mankin modificado (Tabla 1) por dos patólogos veterinarios independientes certificados por la junta.
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2.4. Ensayo TUNEL
La apoptosis inducida por H2O2 se detectó mediante la realización del ensayo de etiquetado final de nick dUTP mediado por desoxinucleotidetil transferasa terminal (TUNEL) utilizando un kit Apo-DirectTM (CalBiochem, San Diego, CA). TUNEL se realizó de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Brevemente, después de pretratamientos y exposición al H2O2, las células se recolectaron, lavaron, fijaron, permeabilizaron y etiquetaron para roturas de hebras de ADN, luego se analizaron en un citómetro de flujo de élite Coulter Epics (Beckman-Coulter, Miami, EE. Todos los ensayos se realizaron por triplicado.
2.5. PCR cuantitativa fluorescente
El ARN total se extrajo de 50 mg de cartílago en tibia articular utilizando reactivo Trizol. La síntesis de ADNc se realizó utilizando 4 µg de ARN total por muestra con cebadores aleatorios y reactivos contenidos en el kit de síntesis de ADNc de la primera hebra de Revert Aid. Se utilizaron dos micro litros (2 µL) de cada muestra para PCR en tiempo real en un sistema Rotor-Gen 2000 (Australia). La cuantificación relativa se calculó utilizando el umbral de ciclo delta () cuantificación relativa. Se determinó el ciclo umbral () para el control endógeno del ARNm CAPDH y las señales diana, y se calculó la cuantificación relativa del ARN mediante el método comparativo, donde las secuencias
de cebadores utilizados para el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) son: 5′-TGCCCACCGAGGAGTTCA-3(hacia adelante) y 5′-GGCCCTGGTGGAGGTTTGAT-3(inverso) (longitud del producto: 75 pb).Las secuencias de cebadores utilizados para el factor-1α inducible a hipoxia(HIF-1α) son: 5′-CAGTGCAAAAGACAGGTGGAAG-3(hacia adelante) y 5′-CCCTGTATGGTGGTGATGTTGT-3 (hacia atrás) (longitud del producto: 107 pb).Las secuencias de cebadores utilizados para GAPDH son: 5 ‘- CCGAGGGCCCACTAAAGG-3(hacia adelante) y 5’-GCTGTTGAAGTCACAGGAGACAA-3 (hacia atrás) (longitud del producto: 88 pb).
2.6. Análisis estadístico
Todos los resultados se expresaron como media y desviación estándar (DE). Los datos de medición se analizaron mediante un análisis de varianzas unidireccional (ANOVA, SPSS 11.0). Los datos de rango se analizaron con ridit. El resultado de P < .05 se consideró estadísticamente significativo.
3. Resultados
3.1. La Degeneración Histológica Inducida por el TLC en Conejos Se Redujo mediante DHJST
En la Figura 1 se muestran secciones histológicas representativas. Al final de la semana 10, observamos una integridad normal de la superficie articular en el grupo normal (Figura 1(a)). En el grupo control, con un aumento de la degeneración, hubo una pérdida de la tinción verde O-fast de Safranina que acompañó la formación de hendiduras que se extendieron hasta las zonas medias y profundas (Figura 1(b)), y en el grupo DHJST, se perdió con fibrilación leve temprana, y se observó una pérdida de la tinción verde O-fast de Safranina junto con la agrupación de condrocitos (Figura 1(c)). Grupo AOS, con pérdida de la tinción verde O-fast de Safranina, estos cambios fueron similares al grupo DHJST (Figura 1 (d)). Al final de la sexta semana después de la cirugía, hubo diferencias histológicas significativas en el grupo control en comparación con el grupo normal (P < .01). En el grupo control, la puntuación media de la tinción verde Safranina O-fast fue mayor a la 10a semana en comparación con la de la 6a semana (P < .01) (gráfico 2 a)). Al 10 de fin de semana, hubo diferencias significativas en la puntuación de Mankin entre el grupo control y el grupo DHJST, hubo una puntuación media significativamente menor para la tinción verde de Safranina O-fast en el grupo DHJST en comparación con el grupo control (P < .01) (Figura 2 (b)), y no hay diferencias estadísticamente significativas en la puntuación de Mankin entre el grupo DHJST y el grupo OSA (P >.05).
(a)
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Histological examination of cartilage (Safranin O-fast green staining, ×100).
(a)
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The influence of DHJST on histological parameters and apoptotic of chondrocytes. Los resultados se presentaron como medias ± DE (n = 5 por grupo) en cada columna. * P <.01 frente al grupo de control de osteoartritis a la 6a semana, * * P < .01, en comparación con los del grupo de control de osteoartritis.
3.2. El DHJST inhibió la apoptosis de las células del cartílago
Al final de la sexta semana después de la cirugía, el índice de células de apoptosis en el grupo control en comparación con el grupo normal fueron diferencias significativas (P < .01). En el grupo control, el índice de células de apoptosis todavía estaba muy aumentado (de media ± DE 0,35 ± 0,13 en la sexta semana a 0,62 ± 0,10 en la décima semana; P < .01) (figura 2 c)). Al final de la 10a semana, en comparación con el grupo DHJST, el índice de células de apoptosis aumenta notablemente en el grupo control (P < .01) (gráfico 2 d)). No hubo diferencias significativas en el índice de células de apoptosis entre el grupo AOS y el grupo DHJST (P >.05).
3.3. La inhibición de la Expresión de VEGF y HIF-1α en Células de Cartílago Se Asocia con DHJST Ejerce un Efecto Terapéutico
La PCR cuantitativa fluorescente indicó que la expresión de mRNA de VEGF y mRNA de HIF-1α son bajas en el grupo normal; mientras que las actividades aumentan gradual y significativamente en el grupo control en comparación con el grupo normal (P < .01); En el grupo control, la HIF-1α en los condrocitos articulares comienza a aumentar a la sexta semana después de la cirugía, y aumenta a la décima semana en comparación con la de la sexta semana (media ± DE 94,21 ± 20.12 en la sexta semana, y 160,35 ± 72,27 en la décima semana; P < .05) (Cuadro 2). Al 10º fin de semana, la expresión de ARNm VEGF y ARNm HIF-1α en el grupo DHJST disminuyó significativamente en comparación con la del grupo control después de la administración (P < .01). Aunque el nivel de ARNm de VEGF y ARNm de HIF-1α en el grupo de AOS tendió a reducirse en 4 semanas de tratamiento con AOS en comparación con el del grupo control, no hubo diferencia significativa (Tabla 3).
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| Valores medios ± SD fueron obtenidos a partir de cada grupo de los 5 animales. * P <.05 en comparación con los animales del grupo de control en la sexta semana. * * P <.01 en comparación con los animales del grupo de control en el mismo grupo de control temporal. |
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| Values as means ± SD. †P > .05 compared with control group animals. ** P < .01 compared with control group animals. |
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4. Discusión
El modelo ACLT es uno de los modelos experimentales de AA más utilizados. El TLCA de conejo se está utilizando cada vez más en estudios de OA porque la aparición de la enfermedad es rápida. El uso de modelos experimentales de LCA es de particular relevancia clínica, ya que la ruptura del LCA ocurre en humanos y también conduce al desarrollo de OA. El estudio indica que existe una gran cantidad de apoptosis de condrocitos durante la etapa progresiva de la OA en conejos inducidos por cirugía. La apoptosis de condrocitos es uno de los cambios característicos del cartílago de OA. La apoptosis patológica bajo la condición de estimulación dañina podría resultar en la liberación de quimiotaxis o factores inflamatorios, lo que a su vez agrava la lesión del cartílago y activa el dolor . Por lo tanto, la inhibición de la apoptosis de condrocitos podría ser una estrategia importante contra los cambios degenerativos en las articulaciones de rodilla de conejos. El índice de apoptosis de condrocitos en el grupo DHJST disminuye significativamente en comparación con el del grupo modelo, lo que sugiere que la inhibición de la apoptosis de condrocitos podría ser uno de los mecanismos importantes de DHJST contra los cambios degenerativos.
Estudios previos han demostrado la naturaleza hipóxica del microambiente de los condrocitos articulares. Curiosamente, las articulaciones osteoartríticas mostraron una mayor disminución de los niveles de oxígeno, papel de la hipoxia durante la patogénesis de la osteoartritis . Un estudio reciente describió que en los condrocitos articulares el estrés catabólico y el hipóxico son inductores fuertes del factor de transcripción HIF-1, que es el principal regulador de la adaptación celular a niveles bajos de oxígeno. El HIF-1 es de importancia fundamental para la supervivencia y la detención del crecimiento de los condrocitos durante el desarrollo del cartílago, así como para la generación de energía y la síntesis de matrices de condrocitos en cartílagos sanos y osteoartríticos. En el cartílago osteoartrítico, los niveles de proteína de HIF-1 aumentan significativamente y su actividad se correlaciona con la gravedad de los cambios degenerativos del cartílago . El presente trabajo documenta la importancia del factor de transcripción HIF-1α para mantener la integridad del cartílago articular hipóxico. Los niveles excedentes de HIF-1α coincidieron con un aumento de la apoptosis de los condrocitos articulares y condujeron a cambios degenerativos en las articulaciones de la rodilla de los conejos. Después de la administración de DHJST, la expresión de HIF-1α disminuye, en comparación con la del grupo modelo. Los resultados muestran que la acción de DHJST sobre la función reguladora de los condrocitos, podría a través de la actividad inhibidora de HIF-1α.
Es interesante que la diferencia de expresión de VEGF e HIF-1α entre el grupo DHJST y el grupo AOS es significativa después de la administración. Varios estudios han demostrado que ciertos medicamentos antiinflamatorios no esteroideos, como la indometacina, causan efectos antiinflamatorios independientes de la actividad de HIF-1α, porque la indometacina no inhibió la fosfatidilinositol 3-quinasa o la vía extracelular de quinasa regulada por señales/proteína quinasa activada por mitógenos, así como la actividad de Erk . Por el contrario, la indometacina es capaz de activar el receptor γ activado por proliferadores de peroxisomas, que no es sensible al salicilato de sodio ni a la aspirina. La inhibición de la fosfatidilinositol 3-quinasa o de la vía Erk está relacionada con la inhibición de HIF-1α y factores angiogénicos .
La hipoxia y varios factores de crecimiento/citoquinas mejoran la expresión de VEGF . El VEGF no solo es uno de los factores de angiogénesis más importantes, sino que también está involucrado en los procesos inflamatorios en el AA y contribuye a síntomas como el dolor y la hinchazón al dirigirse a las membranas sinoviales , las respuestas inflamatorias crónicas a menudo se asocian con la producción de factores angiogénicos que inducen la proliferación vascular, y en la artritis reumatoide el VEGF se expresa altamente en las células sinoviales . Dado que la sobrecarga mecánica es uno de los factores causantes del AA, estudiamos su efecto sobre la expresión de VEGF en el cartílago de conejo, ya que la expresión de VEGF disminuye después de la administración de DHJST, el resultado indica que DHJST puede proteger el cartílago articular mediante la supresión de la expresión de VEGF en los condrocitos (Figura 3).
Hipotético de los mecanismos de protección de DHJST en la degradación del cartílago.
5. Conclusiones
Hasta el momento, se desconocen los ingredientes bioactivos del DHJST, pero nuestro estudio indica que el DHJST ejerce un efecto terapéutico significativo sobre la OA en conejos, a través de mecanismos de inhibición de la apoptosis de los condrocitos y de regulación de la expresión de VEGF, HIF-1α en los condrocitos. Esto proporciona evidencia científica para que la clínica aplique DHJST en el tratamiento de la osteoartritis.
Financiación
La Fundación de Ciencias Naturales de Shanghai (número de subvención: 08JC1418800).