Medicina experimental y terapéutica

Introducción

El asma bronquial es una enfermedad inflamatoria crónica por vía aérea que afecta a muchas células inflamatorias y mediadores. Células T, particularmente T helper (Th)1 y Th2. desempeñan un papel crucial en la reducción de la inflamación de las vías respiratorias en pacientes asmáticos (1). Las respuestas inmunitarias complicadas son capaces de inducir deficiencia de Th1 e hiperactividad de Th2, lo que resulta en un desequilibrio de Th1/Th2. Este desequilibrio promueve la esecreción de inmunoglobulina (Ig) y sensibiliza a los mastocitos y los eosinófilos a través de la secreción alterada de citocinas y causa inflamación alérgica y respuesta de la vía aérea a las vías respiratorias (2,3).El interferón (IFN)-γ y la interleucina (IL)-4 son citocinas típicas ofTh1 y Th2, respectivamente.

En pacientes asmáticos, la inflamación persistente por vía aérea se inicia mediante células presentadoras de antígenos (APC), que integran varios alérgenos en una señal para las células T y preparan las respuestas inmunitarias subsiguientes (4,5).La activación de las células T requiere señales que se inician a través del complejo TCR y el grupo de diferenciación (CD)28. Las células dendríticas maduras (MDC) expresan altos niveles de moléculas coestimuladoras CD80 y CD86, que proporcionan la señal que se requiere para activar, expandir y diferenciar las células T mediante la interacción con CD28 (6). Estudios previos han demostrado que los niveles de CD80 y CD86 son elevados en pacientes hospitalizados con asma (7,8).

En estudios previos que investigaban modelos asmáticos, se ha demostrado que los MDC inducen polarización Th2, aumentan la secreción de IL-4, disminuyen la producción de IFN-γ e inducen inflamación eosinofílica (9,10). Sin embargo, faltan estudios que investiguen los efectos de la caída de CD80 y CD86 en los CCd sobre la diferenciación y la secreción de citoquinas por células T auxiliares en modelos de asma con murinas.

En el presente estudio, las señales de activación coestimulatoria de células T fueron bloqueadas por la supresión de la expresión de células CD80 y CD86 en células D utilizando ARN de interferencia pequeño (siRNA), y se evaluaron los efectos de la caída de CD80 y CD86 en los niveles de expresión de las citocinas típicas Th1/Th2 IFN-γ e IL-4. Por lo tanto, se investigó el potencial de CD80 y CD86 como blancos para la aplicación de la interferencia del ARN (ARNi) en la orientación terapéutica del asma.

Materiales y métodos

Animales

Un total de 20 ratones gradeBALB/c sanos y libres de patógenos específicos (6-8 semanas; peso medio, 18±2 g) se compraron en el Centro de Animales Experimentales de la Universidad Sun Yat-Sen(Guangzhou, China). Los experimentos se realizaron de acuerdo con los protocolos aprobados por el Comité de Estudios en Animales de la Universidad Sun Yat-SenUniversity.

Modelos de asma

Un total de 20 ratones se asignaron aleatoriamente a dos grupos: i) el grupo asmático y ii) el control normal group.In en el grupo asmático, cada ratón fue sensibilizado a la ovoalbúmina( óvulos; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.) por vía intraperitoneal los días 1, 14 y 21 con ÓVULOS de 100 µg que se emulsionaron en alumbre de 20 mg(Guangzhou Chemical Reagent Co., Guangzhou, China). Posteriormente, los ratones fueron expuestos a un desafío de aerosol de óvulos al 5% durante 30 minutos/día en recipientes herméticos (con dimensiones de 50×50×50 cm) los días 28-34. En el grupo control normal, los ratones se sensibilizaron y desafiaron como antes con una cantidad equivalente de solución salina en lugar de la solución de proteína de óvulos. A las 24 h del último desafío, se sacrificaron ratones mediante un procedimiento aprobado de dislocación cervical realizado por personal capacitado y totalmente capacitado. Los hongos se retiraron y luego se fijaron en etanol al 10% durante 24 h.Las muestras se deshidrataron, se incrustaron en parafina y se teñieron con hematoxilina y eosina como se describió anteriormente (11). Los cambios patológicos en los tejidos bronquiales y de lung se evaluaron con un microscopio de luz Nikon Eclipse Ti (Nikon Corporation, Tokio, Japón).

Separación de DCDS derivados de médula ósea

Todos los ratones fueron sacrificados por dislocación cervical 24h después del desafío final. La médula ósea se lavó de los huesos y las tibias con un medio de cultivo RPMI-1640 (Gibco; ThermoFisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA). Tras la centrifugación a 250 × g durante 5 min, las células se trataron con tampón de lisis de glóbulos rojos (GR) (CWBio Co., Ltd., Beijing, China), lavado con solución salina tamponada con fosfato (PBS), centrifugado a 250 × g durante 5 minutos y cultivado en RPMI-1640, complementado con factor estimulante de colonias de macrófagos de granulocitos recombinantes (rmGM-CSF;Peprotech, Inc., Rocky Hill, Nueva Jersey, EE.UU.; 10 ng / ml) y rmIL-4(Peprotech; 10 ng/ml) se utilizaron a su vez. Después de 6 días de cultivo, se añadió 1 µg/ml de lipopolisacárido (LPS; Sigma-Aldrich) y se recolectaron los MDC no adherentes el día 7. Los DCs se teñieron a 4°C o 30 min con isotiocianato de fluoresceína (FITC) conjugado anti-CD11c (5 µg/ml; 11-0114), ficoeritrina (PE) conjugada de hámster anti-CD80 (5 µg/ml; 12-0801), ANTI-CD86 de rata conjugada FITC (5 µg/ml; 11-0862) y anti-complejo de histocompatibilidad mayor (MHC) II (5 µg/ml; 12-5322; alleBioscience, Inc., San Diego, CA, EE. UU.), y posteriormente se analizaron mediante citometría de flujo (BD FACSVerse; BDBiociencias, Franklin Lakes, NJ, EE. UU.) para determinar la tasa de expresión positiva de la expresión de antígenos marcados.

siRNA y transfección

Las secuencias específicas de siRNA (Tabla I) dirigidas a CD80 y CD86 se diseñaron y seleccionaron de acuerdo con los métodos de Gu et al(12). Todos los siRNA se adquirieron de Shanghai GenePharma Co., Ltd. (Shanghai, China). El paso de transfección se realizó de acuerdo con el protocolo del fabricante para Lipofectamina 2000 (Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, Inc.).Brevemente, se cultivaron DCs en una placa de cultivo de tejido de 24 pocillos a una densidad de 1×105 células/pocillo el día anterior a la transfección. Para preparar complejos lipídicos siRNA, 3 µl de lipofectamina 2000 se introdujo en 50 µl de Opti-MEM (Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc.)a temperatura ambiente durante 5 min, y 12 µl del siRNA indicado se combinaron en la actualidad con 50 µl de Opti-MEM. Posteriormente, la lipofectamina 2000 diluida y el siRNA se mezclaron e incubaron durante otros 20 minutos a temperatura ambiente para la formación de complejos.Posteriormente, el complejo se incubó con el DCs en una placa de 24 pocillos a 37°C en un CO2 humidificado al 5% en atmósfera de aire durante 6 h. Cuando se realizó la cotransfección, se agregaron cantidades equivalentes de ARN CD80:Lipofectamina 2000 y ARN CD86:Lipofectamina 2000 a cada pocillo. Se utilizó el ARNip revuelto FAM como control negativo para determinar la eficiencia de la transfección. Se establecieron tres grupos de SCd transfectados: En el grupo no siRNA, solo se añadió lipofectamina 2000, sin que se añadiera ningún siRNA a los SCd. En el grupo siRNA, los MDC se transfectaban por SIRNA específicos de CD80 y CD86. En el grupo de ARN negativos, los MDC se transfectaron por ARN-FAM no específico no objetivo, que no tiene homología con los ARN objetivo.Los experimentos se realizaron por triplicado para cada muestra.La eficacia de la transfección se determinó mediante microscopía fluorescente (Nikon Eclipse Ti, Nikon Corporation) y citometría de flujo detectada.

Reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa de transcripción inversa (RT-qPCR)

Para evaluar los niveles de expresión del ARNm CD80 y CD86, tras la transfección, se realizó RT-qPCR. Las secuencias de imprimación (Tabla II) fueron diseñadas de acuerdo con GenBank y sintetizadas por DaAn Gene Co., Ltd. de Sun Yat-SenUniversity (Guangzhou, China). A las 24 h post-transfección, se extrajo el ARNr total de 1×106 DCs utilizando reactivo TRIzol (Invitrogen;Thermo Fisher Scientific, Inc.) y transcrito inversamente y amplificado utilizando QuantiTect SYBR Green RT-PCR kit (Qiagen GmbH, Hilden, Alemania) en un LightCycler 480 de Roche (Roche Diagnostics,Basilea, Suiza). Las amplificaciones se llevaron a cabo de acuerdo con el protocolo del fabricante para el QuantiTect SYBR Green RT-PCRkit (Takala, Japón). Las condiciones de amplificación fueron de 40 ciclos de 93 ° C por 3 min, 93 ° C por 30 seg, 55°C por 45 seg y 72°C por 45 seg. Cada muestra se administró a cada uno de los tres pocillos. Relativegene expression levels were calculated using the quantificationcycle (Cq) method with normalization to glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase (GAPDH) as the reference gene using 2−∆∆Cq(13).

Citometría de flujo

Para detectar las tasas de expresión positivas de CD80 y CD86 en el DCs después de la transfección, se realizó una citometría de flujo en la puerta MHC II / CD11c para CD80 y CD86. Seis horas después de la transfección, los DCs se lavaron dos veces con PBS y se incubaron con anticuerpos marcados con fluorescencia a 4°C durante 30 min.Posteriormente, las células se lavaron de nuevo con PBS y se fijaron con 10 g/l de paraformaldehído. Se utilizaron los siguientes anticuerpos monoclonalanticuerpos anti-ratón: PE-anti-MHC II, FITC-anti-CD11c, PE-anti-CD80 y FITC-anti-CD86, como se mencionó anteriormente. Todos los análisis citométricos de flujo se realizaron utilizando controles isotípicos de IgG.

Separación de células T

Los bazos se extirparon después de que los ratones hubieran sido anestesiados por dislocación cervical. Las células T se separaron utilizando un Medio de Separación de Linfocitos de la casa de acuerdo con el protocolo del fabricante (Dakewe Biotech Co., Ltd., China). La densidad celular se ajustó a 1×109/l antes del procesamiento posterior.

Reacción mixta de linfocitos(RML)

Las células DCs (1×104/pocillo) derivadas de médula ósea murina asmática y las células T sanas (1×105/pocillo) se cultivaron conjuntamente en placas de 96 pocillos en una proporción de 1:10. Los sistemas de cocultivo se dividieron en tres grupos: i) El grupo no siRNA, ii) el grupo siRNA, yii) el grupo siRNA negativo, con DCs de los grupos correspondientes como se describió anteriormente. A continuación, se añadieron óvulos a cada pocillo a una concentración afinal de 10 mg/l en un volumen total de 200 µl. Las células se incubaron a 37°C en una atmósfera de CO2 humidificado al 5% en el aire durante 72 h.

Ensayos de inmunoabsorción enzimática(ELISAs)

Después de 3 días de cocultivo, se recogió el sobrenadante. Los niveles de IFN-γ e IL-4 se analizaron utilizando un kit de ELISA específico para IFN-γ e IL-4 (Dakewe Biotech Co., Ltd.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los valores de absorbancia se leyeron a 450 nm utilizando un Multiskan MK3 (Thermo Fisher Scientific, Inc.).

Análisis estadístico

Los análisis estadísticos se realizaron con SPSSsoftware, versión 13.0 (SPSS, Inc., Chicago, IL, USA). Los datos se presentan como media ± desviación estándar (DE). Los exámenes se realizaron por triplicado para cada ratón. Las comparaciones estadísticas entre grupos se realizaron utilizando el análisis de varianza unidireccional,y las comparaciones dentro de un grupo se realizaron utilizando la prueba de Student. Las diferencias entre los grupos se consideraron estadísticamente significativas cuando P< 0,05.Resultados

Modelo asmático

Los 20 ratones BALB / c sanos con FPS se asignaron a los grupos asmático y control normal, con 10 ratones en cada uno. Todos los medicamentos se evaluaron en el análisis final sin pérdidas animales experimentadas. De acuerdo con la patología del tejido pulmonar, las secciones pulmonares de los ratones inmunizados con óvulos mostraron una inflamación clara de las vías respiratorias con infiltrados peribronquiolares y perivasculares. Estos infiltrados consistieron predominantemente en eosinófilos y linfocitos, y las secciones mostraron engrosamiento de la mucosa bronquial y del músculo liso,aumento de la secreción de moco, desprendimiento de células epiteliales de las vías respiratorias, tenosis de las vías aéreas y células inflamatorias dispersas en el intersticio pulmonar. No se observaron cambios patológicos significativos en las secciones de la columna vertebral del grupo control normal. Los datos histopatológicos representativos se muestran en la Fig.1.

Expresión de moléculas de superficie celular por CMDC

Los niveles de expresión de CD11c, CD80 y CD86 en las superficies de CD se detectaron mediante clasificación celular activada por fluorescencia(FACS). Los MDC del grupo asmático expresaron CD11c a un nivel comparable con el del grupo control normal; no se encontró diferencia significativa entre los dos grupos (P>0,05). Sin embargo, en comparación con el grupo control normal, el grupo asmático mostró niveles de expresión de CD80 y CD86 significativamente más altos(P<0,05; Fig. 2).

Transfección de MDC

Las construcciones SIRNA específicas de CD80 y CD86 se transfirieron con éxito a los MDC. Los MDC transfectados se observaron bajo un microscopio de fluorescencia 6 h después de la transfección.La eficacia de transfección del siRNA detectado por FACS fue de ~75%(Fig. 3).

ARNm y expresión proteica de CD80 y CD86 por MDC después de la transfección

Los niveles de ARNm y expresión proteica de CD80 y CD86 en los MDC transfectados se detectaron mediante RT-qPCR y análisis FAC a las 24 y 72 h, respectivamente, después de la transfección. Los niveles de expresión de ARNm CD80 y CD86 detectados por RT-qPCR indicaron que los niveles de expresión de ARNm CD80 en los grupos de ARNr no siRNA, ARNr siRNA y ARNr negativo fueron de 2,09±0,46, 0,60±0,17 y 2,04±0,93,respectivamente,y los niveles de expresión de ARNm CD86 fueron de 3,58±0,20, 0,91±0,48 y 2,83±0,83, respectivamente. Los datos proporcionados por FACSindicaron que las tasas de expresión de proteína CD80 positiva en los grupos no siRNA, siRNA y siRNA negativo fueron de 82,45±15,80, 30,79±7,07 y 81,83±10,07%, respectivamente, y las tasas de expresión de proteína CD86 fueron de 89,45±10,22, 27,29±6,99 y 87,66±11.74%, respectivamente. El nivel de expresión del ARNm y las tasas de expresión de proteínas positivas mostraron resultados comparables. No hubo significación significativa entre el grupo no siRNA y el grupo de siRNA negativo (P>0,05). La expresión de CD80 y CD86 a los niveles de ARNr y proteínas en el grupo siRNA disminuyó significativamente en comparación con la de los grupos no siRNA y siRNA negativo(P<0,05; Figs. 4 y 5). Esto demuestra que la interferencia dirigida a siRNA puede suprimir significativamente los niveles de expresión de ARNm y proteínas CD80 y CD86.

Secreción de IFN-γ e IL-4 por células T cultivadas con MDC

Después de 72 h de cocultivo, se detectaron los niveles de IFN-γ e IL-4 en el sobrenadante del sistema de cocultivo de mDC y células T mediante ELISA. Expresión de IFN-γ fue significativamente mayor en el siRNA grupo (132.73±25.04 pg/ml), en comparación con thenon-siRNA y negativo siRNA grupos (72.56±26.30 y 80.21±24.42 pg/ml, respectivamente; P<0.05), mientras que no significativo differenceswere detectado entre los no-siRNA y negativo siRNA grupos(P>0.05). La IL-4 niveles de expresión se redujo significativamente en el siRNA grupo (93.04±23.13 pg/ml), en comparación con los no-siRNAand negativo siRNA grupos (150.69±29.50 y 163.19±25.36 pg/ml,respectivamente; P<0,05), mientras que no hay diferencias significativas weredetected entre la no-siRNA y negativo siRNA grupos(P>0.05; Fig. 6).

Discusión

El asma bronquial es una enfermedad inflamatoria crónica por vía aérea que afecta a una variedad de células inflamatorias, incluyendo mastocitos, eosinófilos, linfocitos y otros componentes celulares (14-17).El desequilibrio Th1/Th2 es un factor clave que contribuye a la gravedad del asma(18). Los APC, incluidos los DC, los macrófagos y las células B (19), desempeñan un papel crucial en la estimulación de las células T (3). Entre ellos, el DC es el CAP más poderoso, contribuyendo a las respuestas inmunitarias primarias y secundarias, incluida la inmunidad alérgica. Los DC maduros (MDC) con altos niveles de expresión de las moléculas coestimuladoras CD80 y CD86 pueden activar las células T, mientras que las células dendríticas inmaduras (IDC) con un bajo nivel de expresión de CD80 y CD86 suprimen la respuesta de las células T e inducen tolerancia inmunitaria (20,21). Se ha demostrado que los pacientes asmáticos con DCsin son hiperactivos(22).

CD80 y CD86 son dos tipos de proteínas que se expresan en la superficie del APC, y que trabajan en conjunto para proporcionar señales ecoestimulantes necesarias para la activación y supervivencia de las células T. Estudios previos han demostrado que los niveles de expresión de las moléculas coestimulantes CD80 y CD86 en la superficie de los mDC están estrechamente asociados con la reacción de las células Th2 y la inflamación de las vías respiratorias(23,24). En pacientes asmáticos, los MDC que expresan CD80 y CD86 pueden estimular la activación de linfocitos T colaboradores CD4+naïve para diferenciarse hacia las células Th2,lo que resulta en un desequilibrio Th1/Th2. Después de eso, la creación inadecuada de citoquinas Th1 como IFN-γ, junto con el aumento de la creación de citoquinas Th2 como IL-4 e IL-5, causan inflamación esosinofílica e inflamación alérgica de las vías respiratorias(10,24,25). Se requieren dos señales para la promoción de la activación de células Th2(26-28). La primera señal es la formación de complejos antigen-MHC en la superficie de mDC que se unen específicamente con el complejo receptor de células T-CD3 en las superficies de células T, y la segunda señal es la expresión de moléculas co-estimuladoras y la activación funcional en las superficies de mDC que se unen específicamente a receptores en células T naïve; las dos señales forman un camino co-estimulador (29). También se ha sugerido que existe una tercera señal (30), ya que ciertas moléculas celulares producidas por DCs, como la linfopoyetina estromal tímica (TSLP), afectan la dirección de la diferenciación de células Th. Sin embargo, entre todas las señales mencionadas, la ruta coestimuladora CD80/CD86-CD28 es la más clásica e importante. Investigaciones previas han indicado que la vía coestimuladora CD80/CD86-CD28 puede ser un objetivo eficaz para el tratamiento del asma al demostrar que el bloqueo de la vía coestimuladora CD80/CD86 mediante enfoques de anticuerpos monoclonales puede inhibir la inflamación en ratones asmáticos (25). Además, la supresión de la vía coestimuladora CD80/CD86 mediante oligonucleótidos antisentidos puede suprimir la hiperactividad de las vías respiratorias (31).

El ARNI es un fenómeno de silenciamiento génico en el que los ARN de doble cadena específicos endógenos o exógenos desencadenan la degradación del ARNm homólogo e inducen la pérdida de fenotipos funcionales correspondientes. Desde que la técnica fue descubierta por primera vez en 1998 por Fire et al (32), la técnica ha experimentado un mayor desarrollo para alcanzar un alto grado de especificidad y eficiencia. La aplicación terapéutica de la tecnología de la RNA es un tema que ha estado atrayendo altos niveles de interés en la investigación médica y clínica básica en los últimos años.La capacidad del ARNi para inhibir la expresión génica virulenta se ha utilizado ampliamente para tratar una variedad de enfermedades (33-35).Además, varios estudios han informado que los ARNI pueden utilizarse INDC para diagnosticar y tratar el asma bronquial (36-39).Darcan-Nicolaisen et al (40)descubrieron que los dos signos principales de asma alérgica en el modelo de ratón de asma inducida por la onda, que son la inflamación de las vías respiratorias y la hiperactividad, se mejoraron significativamente mediante el silenciamiento del transductor de señal y activador de la transcripción 6 (STAT6) en las células epiteliales aéreas mediante la administración de gotas nasales siRNA.Moriwaki et al(41)demostraron que el silenciamiento del gen de señalización de citoquinas 3 (SOCS3) mediado por siRNA podría suprimir la reactividad de las vías respiratorias y la infiltración eosinofílica inducida por estimulación alergénica en ratones asmáticos. Zheng et al (42) encontraron que la aplicación de siRNA era posible para inhibir la expresión génica de la proteína quinasa de tirosina (TPK) en los DCs de ratones asmáticos, reprimiendo la capacidad funcional de los DCS como células presentadoras de antígenos, inhibiendo así la activación y diferenciación de las células T. Sin embargo, faltan estudios relativos a los efectos de la caída de CD80 y CD86 mediados por siRNA en CCd en la diferenciación de células T en ratones asmáticos. En el presente estudio, el ARNm CD80 y CD86 y la expresión de proteínas en el DCs derivado de la médula ósea murina disminuyeron con éxito con el siRNA dirigido a CD80 y CD86, que verificó la eficiencia del ARNi.

En el presente estudio, se utilizó un modelo de ratón asmático que se estableció de acuerdo con métodos previamente informados(43). Los resultados indicaron que los MDC obtenidos del grupo asmático mostraron niveles de expresión de CD80 y CD86 aumentados, lo que implica que la capacidad de CD80/CD86 puede aumentar en pacientes asmáticos. Tras la transfección de los CDM con ARNip dirigidos a CD80 y CD86, los niveles de expresión de ARNr y las tasas de expresión proteica positiva de CD80 y CD86 disminuyeron significativamente, confirmando el efecto inhibitorio que el enfoque de ARNip tuvo sobre las moléculas coestimuladoras CD80 y CD86 en los niveles transcripcional y de traducción. En el sobrenadante del cocultivo de MDC y células T,el ARNi indujo un aumento en la expresión de IFN-γ y una reducción de los niveles de IL-4, lo que indica que la disminución de la expresión de las moléculas ecoestimuladoras CD80 y CD86 en MDC debilitó la vía coestimuladora CECD80/CD86-CD28 en ratones asmáticos. El ARNi también afectó la expresión de citocinas Th1/Th2, indicando que el desequilibrio Th1/Th2 original fue alterado y, en consecuencia, se indujo tolerancia inmunitaria. Estos hallazgos indican que CD80 y CD86 pueden ser objetivos potenciales para la aplicación de ARNi en el tratamiento del asma,y proporcionan una nueva vía para la terapia génica del asma.

Agradecimientos

Este estudio fue apoyado por una Beca de Proyectos Abiertos del Laboratorio Estatal Clave de Enfermedades Respiratorias (Guangzhou,China) (subvención no. 2007DA80154F1107).

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