4.3 BSABS de cruce de BBB diseñados con anticuerpos de un solo dominio
Los sdAbs son pequeños fragmentos de anticuerpos monoméricos de unión a antígenos (15 kDa) que proporcionan varias ventajas sobre otros fragmentos de anticuerpos como «bloques de construcción» para bsAbs. Se producen en la naturaleza como la porción de unión a antígenos de anticuerpos de cadena pesada en especies de camélidos (llamadas VHH) y peces cartilaginosos (llamados VNAR) o pueden generarse a partir de IgGs convencionales mediante la obtención o ingeniería de dominios de VH o VL estables monoméricos (Hamers-Casterman et al., 1993; Hussack et al., 2012; Kim et al., 2014; Nuttall, 2012; Ward, Güssow, Griffiths, Jones, & Winter, 1989). Las SDAB son altamente estables y compactas y pueden acceder a epítopos empotrados en proteínas, como cavidades receptoras o sitios activos de enzimas, que a menudo están «ocultos» de las IGG convencionales y pueden lograr afinidades de unión al objetivo comparables a las de los anticuerpos convencionales (Lauwereys et al., 1998; Staus et al., 2014). Estas unidades monoméricas de unión a antígenos no se emparejan con cadenas ligeras, lo que las convierte en excelentes bloques de construcción para BSAB heterodimerizados, ya que evitan dificultades de emparejamiento incorrecto de cadenas ligeras (Hamers-Casterman et al., 1993; Saerens, Ghassabeh, & Muyldermans, 2008). BSAB heterodiméricos se pueden crear con uno o ambos «brazos» siendo sdAb, siendo este último similar en estructura a los anticuerpos de cadena pesada de camélidos (Fig. 3E). sdAbs también se puede utilizar en varias fusiones mono, bi o tetravalentes con anticuerpos terapéuticos convencionales o FAB (Fig. 3E), lo que generalmente resulta en moléculas más pequeñas y menos complejas, en comparación con las generadas con SCFV o Fabs como bloques de construcción, que tienden a comportarse biofísicamente bien y ser fáciles de producir (Holliger & Hudson, 2005). La humanización de VHH, así como la ingeniería de sdAbs, están bien descritas, lo que permite generar fácilmente sdAbs humanos(izados) con afinidad óptima al objetivo y propiedades biofísicas excepcionales (Vincke et al., 2009).
Para evaluar el uso potencial del camélido VHH FC5 como portador de BBB dentro de anticuerpos biespecíficos dirigidos al SNC, se diseñaron y evaluaron in vitro e in vivo fusiones monovalentes y bivalentes (terminales N y C) de FC5 con Fc humano (Farrington et al., 2014). La afinidad de unión aparente (Kdapp) a la BEC de rata de la fusión bivalente FC5Fc fue de 75 nM, mientras que la unión monovalente FC5Fc estaba en el rango micromolar. Los análisis de las tasas de transmigración aparentes (Papp) a través de un modelo BBB in vitro, la exposición aparente al SNC derivada de la farmacocinética sérica/LCR de los constructos de anticuerpos administrados sistémicamente y las respuestas farmacológicas provocadas por péptidos neuroactivos impermeables BBB conjugados químicamente en el modelo de dolor Hargreaves, proporcionaron pruebas de un mayor transporte BBB de estas moléculas de anticuerpos grandes (75 kDa) mediadas por FC5: (1) los valores de Papp in vitro fueron de ~ 200 cm/min para moléculas de fusión Fc mono y bivalentes N-terminales (FC5Fc) en comparación con 4-8 cm/min para el control VHH A20.Fusiones 1Fc o EG2Fc; 2) la exposición aparente al SNC de la fusión FC5Fc fue 30 veces mayor en comparación con las fusiones Fc-anticuerpos del dominio de control; 3) la potencia farmacológica sistémica de los conjugados FC5Fc con neuropéptidos dalargina o galanina en el modelo de dolor inflamatorio de Hargreaves fue hasta 60 veces mayor en comparación con los conjugados monoméricos FC5–neuropéptidos. Este resultado se atribuyó a la larga semivida circulatoria (~96 h) de FC5Fc en comparación con los conjugados de neuropéptidos FC5; (4) varios conjugados de neuropéptidos VHH–Fc de control no mostraron eficacia sistémica; (5) la fusión de FC5 con el terminal C de Fc resultó en una capacidad de cruce BBB atenuada. En contraste con los anticuerpos portadores de BBB dirigidos a TfR, las proteínas de fusión FC5Fc mono y bivalentes mostraron una tasa similar de transcitosis in vitro, perfiles farmacocinéticos plasmáticos/LCR similares y una potencia sistémica similar en el modelo farmacodinámico in vivo, a pesar de las diferencias en afinidad de unión aparente y valencia (Farrington et al., 2014). Estos estudios demostraron que el anticuerpo FC5 de un solo dominio cruzado de BBB puede usarse como portador de BBB de plataforma tanto en «medio anticuerpos» heterodimerizados como en la fusión bi o tetravalente más fácilmente escalable a IgGs convencionales (Farrington et al., 2014).
Otra ventaja potencial de los VHH como portadores de BBB es su resistencia natural a desafíos biofísicos extremos, como la temperatura y el pH, así como a la degradación de la proteasa (Kim et al., 2014), a menudo se encuentra en varios compartimentos endocíticos durante la transcitosis. Las fusiones FC5 y FC5Fc se internalizan en BEC a través de vesículas recubiertas de clatrina, y se clasifican en endosomas tempranos. Curiosamente, también se encontró que FC5 estimula la excreción de microvesículas extracelulares (exosomas) de BEC (Haqqani, Caram-Salas, et al., 2013; Haqqani, Delaney, et al., 2013) en el que se detectaron tanto FC5 como niveles elevados de su supuesto receptor Cdc50A mediante Western blot y espectrometría de masas dirigida. Este estudio sugirió que los exosomas desprendidos pueden ser la vesícula final de la vía RMT liberada de la superficie abluminal que transporta el complejo receptor-anticuerpo (se muestra esquemáticamente en la Fig. 4). La vía RMT y la formación de exosomas comparten algunas similitudes notables. Como se señaló en el primer descubrimiento de exosomas, un anticuerpo anti-TfR fue rastreado por microscopía electrónica en reticulocitos (Théry, 2011) desde la superficie de las células, en fosas recubiertas de clatrina, dentro de los primeros endosomas, en la superficie de las vesículas internas de los endosomas multivesiculares y, finalmente, en los exosomas liberados después de la fusión de los endosomas multivesiculares con la membrana plasmática (Fig. 4). La RMT parece desplegarse de manera similar y se ha demostrado que las microvesículas extracelulares BEC contienen varios receptores conocidos por transportar macromoléculas a través de la BBB a través de la RMT, incluyendo TfR, LRPs, LDLR e IR (Haqqani, Delaney, et al., 2013).
De los estudios descritos, debe ser evidente que el grupo portador de BBB del bsAb dirigido al SNC requiere una optimización cuidadosa para cada receptor RMT. A continuación se analizan consideraciones importantes en el diseño de BSAB dirigidos al SNC, en vista de las «lecciones aprendidas» del desarrollo de BSAB TfR-BACE1 y de nuestro propio trabajo con FC5 como anticuerpo portador de BBB.