Plásmidos 101: Biotinilación

La biotina y su socio de unión avidina se usan comúnmente hoy en día en biología molecular para una variedad de técnicas y protocolos diferentes. En este post discutiremos el papel natural de la biotina, la biotinilación, el descubrimiento de la interacción biotina-avidina y los usos de la biotinilación en biología molecular.

Aprenda sobre la biotinilación in vivo de proteínas de fusión bacteriana

La biotina es una vitamina esencial para la vida

Aunque la biotina es más conocida por su papel en la biología molecular, la biotina (Vitamina H o Vitamina B7) es primero una coenzima esencial que es requerida por todos los organismos para la vida. La biotina solo es sintetizada por las plantas, la mayoría de las bacterias y algunos hongos, por lo que los mamíferos deben obtener la vitamina a través de fuentes externas. Los seres humanos absorben la mayor parte de la biotina que necesitan en el intestino delgado de la microflora que reside allí.

La biotina es un cofactor que, en su forma activa, se une covalentemente al sitio activo de enzimas metabólicas clave, incluidas la biotina carboxilasa y las descarboxilasas. Estas enzimas catalizan la transferencia de grupos carboxilos a ácidos orgánicos para producir metabolitos celulares importantes. La biotina actúa como un portador carboxilo de un compuesto al otro. Estas enzimas dependientes de biotina son esenciales para procesos como la gluconeogénesis, la lipogénesis, el metabolismo de aminoácidos y la transducción de energía.

La biotinilación es el proceso general por el cual se agrega biotina a una proteína o macromolécula. La biotina se puede añadir enzimática o químicamente. La biotinilación enzimática ocurre naturalmente en las células y es el proceso por el cual la biotina se une covalentemente a una lisina específica en el sitio activo de una enzima recién sintetizada. La proteína ligasa de biotina (BPL) es responsable de esta modificación proteica post-traslacional altamente específica. La mayoría de los organismos tienen menos de cinco enzimas en todo el proteoma que están biotiniladas. En E. coli, por ejemplo, la BPL, BirA, es responsable de biotinilar solo una lisina en todo el organismo en la proteína portadora de carboxilo de biotina (BCCP).

Descubrimiento de la interacción biotina-avidina

A finales de la década de 1930 se observó que los animales alimentados con una dieta principalmente de claras de huevo desarrollarían lesiones en la piel y otros problemas de salud terribles. Esta enfermedad se denominó «lesión de la clara de huevo» y se determinó que se debía a una deficiencia de vitamina H, más tarde renombrada Vitamina B7/biotina. La lesión de la clara de huevo plagaría a estos animales incluso si su dieta se complementara con biotina. Por lo tanto, algo en la clara de huevo estaba secuestrando la biotina para que no fuera absorbida. En 1940 Esmond E. Snell fue capaz de purificar la proteína responsable de la unión a la biotina, la avidina. Avidina fue nombrada acertadamente por el huevo de pollo,»Aviar», del que fue purificado. Snell confirmó más tarde que la avidina fue de hecho el culpable en la lesión de la clara de huevo al alimentar a ratas con avidina purificada(Kresege et al., 2004). La avidina es una glicoproteína que consta de cuatro subunidades idénticas que pueden unirse a una molécula de biotina.

La biotina y la avidina tienen una afinidad extremadamente fuerte entre sí. En realidad, el enlace entre ellos es una de las interacciones proteína-ligando no covalentes más fuertes que se encuentran en la naturaleza. Una vez que se forma la unión, no se ve afectada por los cambios en el pH, la temperatura o los disolventes orgánicos.

Usos de la biotina en biología molecular

La biotina es una molécula relativamente pequeña y soluble en agua que no interfiere con las macromoléculas a las que se agrega. La biotina también tiene una cadena lateral expuesta que se puede manipular fácilmente para hacer especies reactivas sin afectar el sitio de unión de avidina. Con todas estas características, no es sorprendente que los científicos comenzaran a explotar la biotina y su fuerte interacción con avidina para fines de biología molecular y biotecnología.

Una vez que un polipéptido está biotinilado (más sobre esto a continuación), puede incubarse o coexpresarse con avidina o una proteína estructuralmente similar que se descubrió en la década de 1960, la estrepavidina. El complejo Biotina-avidina se puede usar y/o manipular para el propósito previsto de un científico. Dos de los usos más comunes de la biotinilación en el laboratorio son la purificación de proteínas y los experimentos de inmunoprecipitación. Las proteínas o complejos biotinilados se pueden purificar fácilmente utilizando columnas o perlas recubiertas con avidina.

La interacción biotina-avidina también se ha adaptado para su uso en inmunohistoquímica y etiquetado de anticuerpos. En estos experimentos, la biotina se agrega a un anticuerpo primario o secundario que se dirige a la proteína de interés o al anticuerpo primario, respectivamente. La avidina unida a un reportero se agrega a la reacción para facilitar la detección. Los múltiples sitios de unión de biotina que se encuentran en avidina también son ideales para la amplificación de la señal durante estos experimentos. Durante la detección, se puede agregar a la muestra una enzima reportera biotinilada que está preincubada con avidina libre. Cualquier sitio libre de unión a biotina en este complejo puede unirse a su anticuerpo biotinilado. Esto crea una gran red de complejos de biotina-avidina unidos a la proteína de interés que conduce a la amplificación de la señal del reportero y a una detección más fácil. Esta estrategia se conoce como inmunohistoquímica (IHC) del Complejo Avidina-Biotina (ABC). Para obtener más información sobre ABC e IHC, consulte la guía de Thermo Fisher Scientific.

Hay una serie de otras aplicaciones de biología molecular para la biotina y la avidina. Una breve lista de algunas otras aplicaciones comunes y enlaces a documentos y páginas web relevantes se enumeran a continuación.

1. EMSA (Electrophoretic Mobility Shift Assays)
2. ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay)
3. Southern/Northern Blotting
4. Cell surface labelling
5. Attaching polypeptides to a substrate
6. Flow cytometry/fluorescence-activated cell sorting (FACS)
7. In situ hybridization

Methods for biotinylating your macromolecule of interest

To utilize the natural binding of biotina y avidina, macromoléculas de interés, primero deben biotinilarse. Los científicos han desarrollado varios métodos para biotinilar químicamente macromoléculas de interés tanto in vitro como in vivo.

Reactivos de biotinilación:

La cadena lateral expuesta de biotina se puede enlazar con grupos funcionales de aminoácidos in vivo a través de productos químicos especializados (reactivos de biotinilación). Hay una variedad de reactivos de biotinilación disponibles que difieren en los grupos funcionales o residuos a los que se dirigen, así como en su solubilidad, y por lo tanto, diferentes reactivos son útiles para la biotinilación en diferentes microambiente. También hay reactivos de biotinilación reversibles y dividibles para ayudar con la elución específica de proteínas biotiniladas. Para obtener ayuda para determinar qué reactivo de biotinilación usar, consulte la Herramienta de Selección de reactivos de Biotinilación de Thermo Fisher Scientific.

Las proteínas AviTag y BirA:

también pueden biotinilarse explotando la especificidad de la E.coli BPL, BirA. Si recuerda, BirA biotinila solo una lisina en todo el proteoma de E. coli. Usando este conocimiento, los científicos identificaron la secuencia de 13 aminoácidos requerida para el reconocimiento de BirA y la biotinilación. Esta secuencia de 13 aminoácidos se denomina AviTag. Usando AviTag, uno puede etiquetar una proteína de interés con biotina simplemente creando una fusión en la que AviTag se agrega al extremo N o C de la proteína. Se ha demostrado que BirA biotinila eficazmente las proteínas que expresan AviTag en bacterias, levaduras, insectos y células de mamíferos. Echa un vistazo a Kay et al., 2009 for methods on biotinylating proteins with BirA.

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Etiquetado de oligonucleótidos:

La biotina se puede añadir a cualquiera de los terminales de una secuencia de ADN durante una Reacción en Cadena de la polimerasa (PCR) mediante el uso de una imprimación biotinilada. La biotina también se puede incorporar enzimáticamente durante la PCR utilizando un dUTP marcado con biotina. Hay varios tipos de etiquetas de biotina que se pueden agregar a un oligonucleótido dependiendo de su aplicación posterior. Los oligonucleótidos marcados con biotina se pueden usar en una multitud de aplicaciones que incluyen, entre otras, hibridación in situ, secamiento (Norte y Sur) y unión por afinidad.

Fotobiotinilación:

La fotobiotina se puede utilizar para etiquetar de forma no selectiva el ADN y el ARN. El acetato de fotobiotina consiste en una molécula de biotina unida a un grupo de arilazidas fotorreactivas. Bajo una fuerte luz visible, el grupo arilazida se vuelve reactivo y forma un enlace con los ácidos nucleicos cercanos (McInnes et al., 1990). La fotobiotinilación a veces es más fácil y menos costosa que otros métodos enzimáticos. Los científicos han utilizado comúnmente este método para unir proteínas o polipéptidos a un sustrato sólido (Holden y Cremer, 2003).

1. Chapman-Smith, A., & Cronan, J. E. «Molecular Biology of Biotina Attachment to Proteins; Symposium: Nutrition, Biochemistry and Molecular Biology of Biotina» J. Nutr, 129 (2009a): 477-484. PubMed PMID: 10064313.

2. Chapman-Smith, A., & Cronan, J. E. «La biotinilación enzimática de proteínas: Una modificación post-traduccional de especificidad excepcional.»Tendencias en Ciencias Bioquímicas, 24.9 (1999b): 359–363. PubMed PMID: 10470036.

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5. Kay, B., Thai, S., & Volgina, V. » Biotinilación de Proteínas de alto rendimiento.»Methods Mol Biol, 498 (2009): 185-196. PubMed PMID: 18988027. PubMed Central PMCID: PMC3223083.

6. McInnes, J. L., Forster, A.C., Skingle, D. C., & Symons, R. H. » Preparación y usos de la fotobiotina.»Methods in Enzymology 184 (1990): 588-600. PubMed PMID: 2388593

7. Holden, M. A., & Cremer, P. S. » Modelado activado por luz de moléculas marcadas con tinte en superficies.»Journal of the American Chemical Society 125.27( 2003): 8074-8075. PubMed PMID: 12837056.

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11. Liou, Y.-R., Wang, Y.-H., Lee, C.-Y., & Li, P.-C. «Clasificación Celular Activada Por Flotabilidad Utilizando Microburbujas De Albúmina Biotiniladas Específicas.»PLoS ONE 10.5 (2015). PubMed PMID: 25993512. PubMed Central PMCID: PMC4439073.

12. Ludwig, L. B., Hughes, B. J., & Schwartz, S.A. «Sondas biotiniladas en el ensayo de desplazamiento de movilidad electroforética para examinar interacciones específicas de dsDNA, ssDNA o ARN–proteína.»Nucleic Acids Research, 23.18( 1995): 3792-3793. PubMed PMID: 7479014. PubMed Central PMCID: PMC307283.

13. Howarth, M., & Ting, A. Y. » Obtención de imágenes de proteínas en células vivas de mamíferos con biotina ligasa y estreptavidina monovalente.»Nature Protocols 3.3( 2008): 534-545. PubMed PMID: 18323822. PubMed Central PMCID: PMC2671200.

14. Bloch, B. » Biotinylated probes for in situ hybridization histochemistry: use for mRNA detection.»The Journal of Histochemistry and Cytochemistry : Official Journal of the Histochemistry Society, 41.12( 1993): 1751-1754.PubMed PMID: 8245422.

Recursos adicionales en el blog de Addgene

• Biotinilación in vivo de proteínas de fusión bacteriana
• Aprenda cómo se usa la biotina en bioides divididos: Un método mejorado para estudiar las interacciones proteína-proteína
• Aprenda cómo se puede usar la biotina con CRISPR