Las RNasas son como los superhéroes malos entre las enzimas de laboratorio. Son omnipotentes, destructivos y aparentemente indestructibles.
Esto se debe a que fueron creados por señores malvados, con el único propósito de hacer la vida difícil para los valientes científicos que luchan todos los días para producir preparaciones de ARN intactas de alta calidad.
Ok, estoy bromeando sobre la parte de overlords. Pero, ¿por qué los RNases tienen todos esos superpoderes de todos modos? ¿Y qué puedes hacer para derrotarlos? Averigüémoslo.
Las superpotencias de las RNasas, explicadas.
Las RNasas son omnipotentes
Esto es cierto. Las RNasas se encuentran en todos los tipos de células y organismos, desde procariotas hasta eucariotas. es decir, están en todas partes. Esta es una de las principales razones por las que son un problema en el laboratorio. Están flotando en el aire, en cada superficie de su cuerpo. Lo que significa que contaminan cualquier cosa que el aire o cualquier superficie de su cuerpo haya tocado. Que es básicamente todo. Además, la RNasa A en particular se adsorbe muy fuertemente al vidrio, lo que hace que sea aún más difícil eliminarla de sus botellas, etc.
Las RNasas son altamente destructivas
Las RNasas generalmente tienen una actividad específica muy alta hacia su sustrato (ARN). Esto significa que la menor cantidad de RNasa puede rasgar fácilmente sus preciados preparados de ARN. Por cierto, esta es también una de las razones por las que una RNasa (RNasa A) fue la primera enzima en deducir su mecanismo de catálisis (Findlay et al 1962).
Las RNasas son aparentemente indestructibles
Muestran una recuperación similar a un Fénix después del autoclave
La sabiduría convencional dice que si autoclavas RNasas, se desnaturalizan, pero luego se renaturalizan y vuelven a ganar función parcial después del enfriamiento. Esta increíble fortaleza legendaria es posible gracias a una serie de enlaces intramoleculares de disulfuro que mantienen la estructura intacta, incluso después de que se rompan los enlaces de hidrógeno que normalmente mantienen la estructura de la proteína 3D en su lugar. Como todas las fábulas, esto es cierto hasta cierto punto. Pero sigue leyendo y descubriremos que esta superpotencia en particular ha sido promocionada por los spin doctors de RNase Baddies Inc.
Incluso EDTA no puede detenerlos!
A diferencia de otras nucleasas, muchas RNasas no requieren iones metálicos para la catálisis, ya que utilizan el grupo hidroxilo de 2 primos del sustrato de ARN como especie reactiva, por lo que simplemente agregar TE no las inhibe, como lo haría para las nucleasas masticadoras de ADN.
Cómo derrotar a las RNasas malvadas
No te preocupes, colega científico. Las RNasas pueden ser enemigos formidables, pero tienen debilidades que podemos explotar.
Las nasas H
dependen de los residuos de histidina en su sitio activo para la catálisis. Por lo tanto, el pirocarbonato de dietilo (DEPC), que es un agente alquilante específico de histidina, puede inactivarlos. El autoclave eliminará el DEPC para evitar que alcalinice cualquier otra proteína que haya en usted o en sus muestras.
El autoclave funciona, hasta cierto punto
La legendaria indestructibilidad de las RNasas frente al autoclave es verdadera en el núcleo, pero también muy exagerada, como mencioné anteriormente. Un pequeño estudio de Ambion mostró que las RNasas (o al menos la RNasa A) no son completamente resistentes al autoclave. Más bien, su actividad es diezmada por el autoclave, pero una pequeña porción de la actividad de la RNasa permanece después del autoclave.
Pero, por supuesto, una pequeña cantidad de RNasa todavía tiene mucho poder de masticación de ARN. Esto significa que el autoclave de rutina como parte de sus procedimientos de descontaminación de la RNasa ciertamente vale la pena, es solo que no puede confiar en él para eliminar toda la actividad.
No pueden soportar el calor (seco)
Mientras que el calor húmedo (autoclave) destruye parcialmente las RNasas, no hay esperanza de que resistan el calor seco. El calor seco oxida las RNasas, cualquier otra proteína, sin importar cuán robustas sean. Así que para limpiar su cristalería, un par de horas a 180 grados debería bastar.
Guerra química
Para limpiar superficies, las RNasas, tan robustas como son, no pueden soportar cosas como peróxido de hidrógeno, ácidos/bases fuertes, Trizol, etc. Todos estos se usan comúnmente para deshacerse de incluso las RNasas más resistentes.
Kriptonita para RNasas: Inhibidores
Quizás la mejor arma que tenemos en nuestro arsenal contra las RNasas son los inhibidores de la RNasa. Con mayor frecuencia, los inhibidores comerciales de la RNasa son versiones de los inhibidores de la ribonucleasa placentaria (IR). Como alguien que pasa un año tratando de perfeccionar las hibridaciones in situ de ARN sin la ayuda de un inhibidor de la RNasa (¡debido a una falsa economía de mi jefe!), sé lo buena que es esta kriptonita de RNasa. Un microlitro de RI y de repente mis experimentos comenzaron a funcionar.
Digo que esta es la mejor arma en nuestro arsenal contra las RNasas porque a diferencia de todas las otras soluciones enumeradas anteriormente, los inhibidores de la RNasa son específicos, por lo que puede (generalmente) colocarlos justo donde cuenta en su flujo de trabajo y obtener la protección que necesita de los malvados. NO se quede sin este material si está trabajando con ARN.
¿Esto te ha ayudado? Entonces, por favor, comparta con su red.