Investigador principal: Zuben E. Sauna, PhD
Oficina / División / Laboratorio: OTAT / DPPT/HB
Descripción general
Un problema importante de las terapias basadas en proteínas es su inmunogenicidad, es decir, su tendencia a desencadenar una respuesta inmune no deseada contra sí mismos. Una forma de respuesta inmunitaria es la activación de las células B, que producen anticuerpos que se unen a las proteínas y reducen o eliminan sus efectos terapéuticos. Estos anticuerpos también pueden causar complicaciones que pueden poner en peligro la vida. Por lo tanto, una parte crítica de la determinación de la seguridad clínica y la eficacia de los productos terapéuticos basados en proteínas es medir su tendencia a desencadenar la formación de anticuerpos.La respuesta inmunitaria a los tratamientos basados en proteínas también involucra a las células T, que ayudan a activar las células B para que produzcan anticuerpos, incluidos los que bloquean los tratamientos con proteínas. Esto sucede si la proteína natural producida por el cuerpo es defectuosa de alguna manera. En ese caso, las células T responden a una proteína artificial normal terapéutica como si fuera extraña, ya que es diferente de la proteína natural defectuosa. Un desajuste de respuesta de células T como este a veces ocurre en el caso de la proteína FVIII, una proteína que es crítica para la capacidad del cuerpo de formar coágulos de sangre para detener el sangrado. Las personas que no tienen cantidades suficientes de FVIII, o cuyo FVIII es defectuoso de alguna manera, sufren de hemofilia A, una enfermedad en la que la coagulación de la sangre es defectuosa y conduce a un sangrado excesivo. El problema del FVIII defectuoso tiene una base genética. Aunque no hay cura para la hemofilia A, la infusión de la proteína terapéutica FVIII ha sido uno de los ejemplos más exitosos de manejo de una enfermedad crónica. Desafortunadamente, el desarrollo de anticuerpos anti-fármacos contra el FVIII infundido es un impedimento significativo para esta estrategia. El tratamiento de los pacientes que desarrollan una respuesta inmunitaria es más complejo, menos eficaz y extremadamente costoso. Ahora parece que las variaciones individuales en la tendencia a desarrollar anticuerpos anti-drogas también pueden basarse en diferencias genéticas. Esto se refleja en la observación clínica de que las personas con hemofilia A de ascendencia africana negra tienen el doble de probabilidades que los pacientes de ascendencia caucásica europea de producir anticuerpos contra las proteínas del factor VIII administradas como terapia de reemplazo.Una estrategia para prevenir los desajustes entre el FVIII natural y el FVIII de reemplazo es diseñar proteínas de FVIII modificadas genéticamente para que no desencadenen reacciones inmunitarias. Pero hay tantas diferencias entre los sistemas inmunitarios de las personas que no es probable que los investigadores puedan diseñar una proteína FVIII que sea segura para todos ellos. Por lo tanto, proponemos adoptar un enfoque personalizado para predecir y evitar las respuestas inmunitarias a las proteínas FVIII. Nuestro objetivo a largo plazo es desarrollar un enfoque basado en genes para identificar a las personas cuyo sistema inmunológico es probable que reaccione a versiones específicas de proteínas terapéuticas modificadas genéticamente para que estos pacientes puedan ser tratados con versiones de estas proteínas que tienen menos probabilidades de causar respuestas inmunitarias.También estamos abordando el problema de las diferencias en las estructuras tridimensionales de los fármacos proteicos y las proteínas naturales que activan las células B para producir anticuerpos contra las proteínas terapéuticas. El método actual para predecir si ciertas partes de tales proteínas desencadenarán la formación de anticuerpos es desafiante y costoso. Por lo tanto, estamos utilizando pequeñas piezas de moléculas similares al ADN llamadas aptámeros para sondear las proteínas y determinar sus formas exactas. Los aptámeros están hechos de cadenas de moléculas llamadas ácidos nucleicos que se pliegan en formas específicas que dependen de los ácidos nucleicos presentes y del orden en que ocurren en el aptámero. Por lo tanto, al identificar qué aptámero se une firmemente a una parte específica de una molécula, podemos predecir la forma de esa parte de la molécula, algo así como predecir la forma de una cerradura al conocer la forma de la llave que encaja en ella.Ahora estamos usando esta técnica para determinar las formas del FVIII y la parte de la toxina del ántrax llamada antígeno protector. Si un aptámero pierde su capacidad de unirse al FVIII, por ejemplo, eso indicaría que parte de esta proteína de coagulación sanguínea ha cambiado de forma, aumentando la probabilidad de que desencadene una reacción inmune que reduzca su actividad terapéutica. Estamos utilizando este enfoque para determinar si las proteínas terapéuticas tienen formas que desencadenarán la producción de anticuerpos. Y estamos colaborando con el Centro de Evaluación e Investigación de Medicamentos para adaptar esta tecnología a fin de analizar nuevos productos proteicos desarrollados como copias de medicamentos proteicos aprobados (biosimilares) existentes para garantizar que sean seguros y eficaces.
Descripción científica
1) Predicción de la interacción de epítopos de células T con antígenos específicos de MHC Clase II.
El factor VIII (FVIII) es un componente esencial de la cascada de coagulación y los individuos con deficiencia de factores de coagulación presentan trastornos hemorrágicos de por vida. El desarrollo de inmunogenicidad frente a versiones terapéuticas (infundidas) de FVIII es un impedimento significativo para el tratamiento exitoso de hemofílicos.Aproximadamente el 50% de los casos de hemofilia A son causados por una inversión de los exones 1-22 del gen F, lo que resulta en la producción de un polipéptido que representa esos exones, pero no 23-26. Sin embargo, hay un gen anidado dentro del promotor F8 que traduce exones 23-26. Sin embargo, la inversión de 1-22 significa que los péptidos superpuestos generados a partir de esta proteína no incluyen la unión entre 1-22 y 23-26. Si bien los péptidos de la proteína FVIII infundida que cubren esta unión serían extraños para el sistema inmunitario del paciente, generalmente no son inmunogénicos. Más bien, la inmunogenicidad debida a las diferencias entre el FVIII endógeno y el FVIII infundido probablemente se deba a una variedad de hechos, especialmente polimorfismos de nucleótido único (SNP), pero también mutaciones y eliminaciones sin sentido, y mutaciones sin sentido, así como inversiones, por lo tanto, la solución ideal (pero no probable) al problema de inmunogenicidad del FVIII infundido sería diseñar reemplazos de FVIII que coincidan con el haplotipo y el tipo HLA de cada paciente para evitar desencadenar una respuesta inmunitaria. Si bien diseñar estos productos biológicos para que coincidan con cada paciente no es práctico, podría ser posible en los casos en que haya diferencias claras y significativas entre poblaciones específicas (por ejemplo, entre las de ascendencia caucásica europea y negra africana). En tales casos, sería conveniente adaptar los diseños del FVIII endógeno a cada grupo para garantizar que una población no obtenga una parte desproporcionada de los beneficios de una única versión del FVIII, mientras que la otra población soporta una parte desproporcionada de los riesgos del mismo FVIII infundido.La tecnología actual permite la identificación de fondos de haplotipos para el FVIII, así como el desarrollo de al menos una serie limitada de medicamentos con factor VIII personalizados. Por lo tanto, nuestro objetivo a corto plazo es determinar: 1) la distribución cuantitativa de diferentes haplotipos (SNP) en individuos de ascendencia europea-caucásica y Negra-africana; 2) la distribución de antígenos MHC de Clase II en estas poblaciones; 3) la composición del FVIII utilizado como fármacos; y 4) la mutación, deleción o inversión causante de enfermedad en el gen F8 (FVIII) de pacientes individuales. Utilizaremos estos datos para predecir la inmunogenicidad de productos individuales con FVIII en diferentes poblaciones y/o pacientes individuales.
2) Desarrollo de aptámeros como herramienta para la investigación de epítopos conformacionales de proteínas y fármacos.Los aptámeros, ácidos nucleicos capaces de formar conformaciones complejas, son herramientas potenciales para mapear la conformación de proteínas, la identificación y la predicción de sitios inmunogénicos, y para eludir la inmunogenicidad. Nuestro laboratorio está desarrollando aptámeros de ADN monocatenario a factor VIII humano recombinante.Diseñamos una biblioteca de ADN ingenua para generar aptámeros utilizando regiones definidas de 5 y 3 para PCR flanqueando una región aleatoria de 60 bases. La biblioteca de ADN ingenua fue desnaturalizada y se permitió que los segmentos de ADNss se plegaran en formas únicas de 3 dimensiones. (Las 60 bases aleatorias teóricamente resultarían en 460 conformadores únicos. Incubamos el conjunto de ADNss plegados con FVIII y, a través de ciclos iterativos SELEX (evolución sistemática de ligandos por enriquecimiento exponencial), pudimos seleccionar aptámeros de unión a proteínas.Nuestro laboratorio seleccionó una muestra de aptámeros individuales en los ciclos 3, 5 y 8 y los clonó y secuenció. Estamos utilizando estos clones para caracterizar los aptámeros a través del análisis de la estructura 3D prevista, las propiedades de unión y el efecto sobre la actividad del FVIII. Además, estamos haciendo comparaciones in silico de estos clones para seguir la evolución de los aptámeros.3) Uso de diversas técnicas analíticas para evaluar las características proteicas que pueden correlacionarse con la inmunogenicidad.En colaboración con los Dres. Mansoor Khan y Rakhi Shah (División de Calidad de Producto, CDER) analizaremos las interacciones de excipientes de fármacos utilizando métodos térmicos (calorimetría de barrido diferencial, microcalorimetría, análisis termogravimétrico), técnicas espectroscópicas (infrarrojo por transformada de Fourier, infrarrojo cercano, Raman), cristalografía (difracción de rayos X) y resonancia magnética nuclear.4) Caracterización de anticuerpos sensibles a la conformación.Un método alternativo al estudio de epítopos conformacionales de proteínas terapéuticamente importantes es desarrollar y caracterizar anticuerpos que sean sensibles a los cambios conformacionales. En colaboración con el Dr. Chava Kimchi-Sarfaty (CBER) caracterizamos varios anticuerpos que son sensibles a la conformación de la metaloproteasa de zinc ADAMTS13, una proteína de múltiples dominios que escinde el factor de von Willebrand y está implicada en la púrpura trombocitopénica trombótica. Nuestros resultados sugieren que estos anticuerpos podrían ser reactivos útiles para distinguir ADAMTS funcionales y no funcionales13, y para analizar transiciones conformacionales durante el ciclo catalítico.
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