Formation de la triple hélice de l’ADN: Un outil potentiel pour la réparation génétique

Posted on

A. Nayak, P. Khare, M. K. Chourasia, O. Silakari et D. V. Kohli*

Département des Sciences pharmaceutiques, Dr. Hari Singh Gour Vishwavidyalaya, Sagar-470 003, Inde

* Auteur correspondant: D. V. Kohli
Département des Sciences pharmaceutiques, Dr. Hari Singh Gour Vishwavidyalaya, Sagar-470 003, Inde
E-mail:

Date of Submission 25 March 2004
Date of Revision 06 July 2006
Date of Acceptance 05 November 2006
Indian J Pharm Sci, 2006, 68 (6): 697-704

DOI: 10.4103/0250-474X.30999

Abstract

DNA triple helices offer new perspectives towards oligonucleotide-directed gene regulation. Les oligonucléotides formant une triple hélice, qui se lient à l’ADN double brin, présentent un intérêt particulier car ils sont ciblés sur le gène lui-même plutôt que sur son produit d’ARNm (comme dans la stratégie antisens). Cependant, la faible stabilité de certaines de ces structures pourrait limiter leur utilisation dans des conditions physiologiques. Des ligands spécifiques peuvent s’intercaler en triple hélices d’ADN et les stabiliser. Cette revue résume les progrès récents dans ce domaine tout en soulignant les obstacles majeurs qui restent à surmonter, avant que l’application de la technologie triplex à la réparation thérapeutique des gènes puisse être réalisée.

Formation d’une triple hélice (fig. 1) a récemment fait l’objet d’un intérêt considérable en raison de ses applications possibles dans le développement de nouveaux outils de biologie moléculaire ainsi que d’agents thérapeutiques et en raison de la pertinence possible des structures de l’ADN-H dans les systèmes biologiques. Dans les structures intermoléculaires, une séquence oligopyrimidine-oligopurine du duplex d’ADN est liée par un oligonucléotide de troisième brin dans le sillon principal.

Figure

Figure 1 : triple hélice d’ADN

Deux principaux types de triple hélice ont été décrits, en fonction de l’orientation du troisième brin. Les premiers complexes triples hélicoïdaux rapportés impliquaient un troisième brin pyrimidique dont la liaison repose sur des liaisons hydrogène de Hoogsteen entre une paire de bases T-A et la thymine, et entre une paire de bases C-G et une cytosine protonée. L’oligonucléotide contenant du (T, C) se lie parallèlement au brin d’oligopurine dans le motif dit pyrimidine. Une deuxième catégorie d’hélices triples contient des purines dans le troisième brin, qui est orienté antiparallèle au brin oligopurine. Les triplets de base C · G×G et T · A×A sont formés après un schéma de liaison hydrogène inverse de Hoogsteen. Les oligonucléotides contenant T et G peuvent également former des hélices triples dont l’orientation dépend de la séquence de base.

La formation de la triple hélice offre un moyen direct de manipuler sélectivement l’expression des gènes dans les cellules où les triples hélices d’ADN offrent de nouvelles perspectives vers la régulation des gènes dirigée par les oligonucléotides (fig. 2). Les oligonucléotides synthétiques formant une triple hélice (TFOS) se lient avec une affinité et une spécificité élevées au brin de purine dans le sillon principal de la séquence homopurine-homopyrimidine de l’ADN double brin.

Figure

Figure 2: Les TFO empêchent la transcription du gène muté

Les TFO sont de bons candidats pour être utilisés comme agents de liaison à l’ADN spécifiques au site et sont à l’étude pour leur utilisation en tant qu’agents thérapeutiques potentiels. Ils ont été étudiés dans des applications antisens, où ils sont conçus pour cibler les ARNM, des applications antigéniques, où ils contrôlent l’expression des gènes via la formation de triples hélices, et dans des applications ciblant les protéines, où ils sont utilisés comme aptamères.

Les TFO peuvent également être utilisés en thérapie génique où ils ciblent la séquence d’ADN du gène muté pour empêcher sa transcription. On trouve fréquemment des voies riches en purines dans les régions promotrices des gènes et il a été démontré que les OFT dirigés vers ces sites régulateurs réduisent sélectivement la transcription des gènes ciblés, probablement en bloquant la liaison des activateurs transcriptionnels et/ou la formation de complexes d’initiation. La modulation triplex de la transcription a une application potentielle en thérapie car elle peut être utilisée; par exemple, pour réduire les niveaux de protéines considérées comme importantes dans les processus pathologiques. Les TFO peuvent également être utilisés comme outils moléculaires pour étudier l’expression des gènes et ils se sont révélés efficaces dans diverses stratégies de ciblage des gènes dans les cellules vivantes. Les TFO peuvent se lier aux régions polypurine / polypyrimidine de l’ADN d’une manière spécifique à la séquence. La spécificité de cette liaison soulève la possibilité d’utiliser la formation de triplex pour la modification dirigée du génome, dans le but ultime de réparer les défauts génétiques dans les cellules humaines. Plusieurs études ont démontré que le traitement de cellules de mammifères avec des TFOs peut provoquer une réparation et une recombinaison de l’ADN, d’une manière qui peut être exploitée pour introduire des changements de séquence souhaités. Un certain nombre d’études ont été rapportées dans lesquelles des oligonucléotides ont été utilisés comme composés antigéniques dans les cellules.

Formation de l’ADN à triple hélice

La formation de la triple hélice est le résultat de la liaison d’oligoinucléotides avec une grande spécificité de reconnaissance au sillon principal de l’ADN à double hélice en formant des liaisons de type Hoogsteen avec les bases purines des paires de bases Watson-Crick, le composé rationnellement conçu pour la régulation artificielle de l’expression des gènes. La formation de triplex nécessite des ions Mg2+ alors qu’elle est inhibée par les ions K+.

Dans la stratégie de la triple hélice ou de l’antigène, l’oligonucléotide se lie dans le sillon principal de l’ADN double brin via la liaison hydrogène de Hoogsteen pour former une triple hélice. Les TFOS se lient aux séquences homopurine-homopyrimidine dans l’ADN double brin. Il existe quatre motifs structurels pour la formation de triplex qui ont été décrits sur la base de la composition du troisième brin et de son orientation par rapport au brin riche en purines du duplex. Les TFOS à motif purine (ceux qui sont composés de G et A) forment des triplets G * G: C et A * A: T et se lient en orientation antiparallèle par rapport au brin purine du duplex. D’autre part, les TFOS à motifs pyrimidiniques (C/T) forment des triplex en orientation parallèle et généralement uniquement à pH bas du fait de la nécessité de protoner les bases cytosiniques pour former des liaisons de Hoogsteen ; ils forment des triplets C+*G:C et T*A:T. Enfin, les TFOS mixtes purine et pyrimidine se lient en orientation parallèle ou antiparallèle et forment des triplets G*G:C et T*A:T. L’orientation dans laquelle le motif mixte TFOs se lie dépend du nombre d’étapes GpA et ApG dans le tractus homopurinique. L’orientation antiparallèle est favorisée par un plus grand nombre d’étapes, tandis qu’un faible nombre d’étapes favorise l’orientation parallèle.

Une fois que le meilleur motif de liaison à une séquence cible particulière est établi, des problèmes avec les oligonucléotides phosphodiester naturels limitent le succès de l’approche antigénique et les applications thérapeutiques des oligonucléotides en général. Les oligonucléotides avec le squelette phosphodiester naturel sont sensibles aux endo et aux exonucléases. L’activité prédominante qui dégrade les oligonucléotides est l’activité de la 3′-exonucléase, mais une activité de l’endonucléase a également été observée dans certains contextes. Ainsi, pour une application en tant que thérapeutique in vivo, les TFO doivent pouvoir résister à la fois à l’activité de l’exonucléase et de l’endonucléase afin d’atteindre leur cible. Une modification du squelette qui confère une résistance à la nucléase mais permet la liaison à l’ADN double brin avec une affinité élevée est nécessaire pour les applications in vivo des TFOs.

Les oligomères morpholino du phosphorodiamidate sont des oligonucléotides dorsaux modifiés qui ont déjà été étudiés comme agents antisens. Les oligonucléotides morpholino ont un squelette non chargé dans lequel le sucre désoxyribose de l’ADN est remplacé par un cycle à six chaînons et la liaison phosphodiester est remplacée par une liaison phosphorodiamidate (fig. 3). Les oligonucléotides morpholino sont résistants à la dégradation enzymatique et semblent fonctionner comme des agents antisens en arrêtant la traduction ou en interférant avec l’épissage du pré-ARNm plutôt qu’en activant la RNase H. Ils ont été administrés avec succès aux cellules de culture tissulaire par des méthodes qui perturbent physiquement la membrane cellulaire, et une étude comparant plusieurs de ces méthodes a révélé que la charge par grattage était la méthode d’administration la plus efficace; cependant, comme le squelette morpholino n’est pas chargé, les lipides cationiques ne sont pas des médiateurs efficaces de l’absorption des oligonucléotides morpholino dans les cellules. Un rapport récent a démontré la formation de triplex par un morpholino oligonucléotide et, en raison du squelette non ionique, ces études ont montré que le morpholino oligonucléotide était capable de former des triplex en l’absence de magnésium.

Figure

Figure 3: Présentation structurelle de l’ADN phosphodiester et du morpholino

Il a été démontré que les cations jouent un rôle important dans la formation de la triple hélice. Lorsque des oligonucléotides phosphodiester sont utilisés comme TFOs, le magnésium est généralement nécessaire à la formation de triplex avec des TFOs à motifs purine et mixte; il accélère également la réaction et stabilise le triplex formé avec des TFOs à motif pyrimidine. Il a été démontré que d’autres cations divalents fonctionnent de la même capacité que le magnésium en ce qui concerne la formation de triplex. Le magnésium se produit à une concentration de ~ 0,8 mM dans la cellule et de ~ 1,5 mM dans le sang, mais la plupart des réactions triplex in vitro sont effectuées en MgCl2 de 5 à 10 mm. Le potassium se produit dans la cellule à une concentration de ~ 140 mM et à 4 mM dans le sang. Des concentrations élevées de potassium peuvent inhiber la formation de triplex avec des oligonucléotides riches en guanine conçus comme des TFO en favorisant d’autres structures d’ADN secondaires, telles que les dimères et les quadruplex. Il sera nécessaire de surmonter la capacité limitée des phosphodiester TFOs à former un triplex à faible teneur en magnésium et en potassium élevé pour qu’ils soient efficaces dans des conditions physiologiques. Dans une étude récente de morpholino TFOs, la formation de triplex a été démontrée en l’absence de magnésium et en présence de potassium. Ces propriétés font des TFOs morpholino de bons candidats pour une étude plus approfondie en tant que thérapeutiques antigéniques.

Modélisation moléculaire

La structure triplex de l’ADN peut être construite par des techniques de modélisation moléculaire en utilisant des coordonnées qui prennent correctement en compte la conformation en sucre des hélices triples à motifs (T, C). Cette structure est plus proche d’un ADN de forme B tel que rapporté par les études RMN par rapport à la structure proposée, basée sur la diffraction des rayons X des fibres. Le programme JUMNA permet de construire des structures d’ADN en fonction de leurs paramètres hélicoïdaux. Un site d’intercalation peut être facilement créé dans le triplex en doublant le paramètre de montée pour deux triplets de base T · A×T adjacents (montée = 6,8 Å), puis en diminuant le paramètre de torsion entre ces deux triplets de 34° à 16° pour réduire les contraintes de distance de liaison.

En utilisant la modélisation moléculaire, on peut démontrer la possibilité de former une triple hélice parallèle dans laquelle le simple brin interagit avec le duplex intact dans le sillon mineur, via de nouvelles interactions de base.

JUMNA utilise un mélange de coordonnées hélicoïdales et internes (angles de valence et dièdres) pour décrire la flexibilité de l’acide nucléique. Les paramètres hélicoïdaux positionnent chaque nucléotide de monophosphate 3′ par rapport à un système à axe fixe. Les jonctions entre nucléotides successifs sont maintenues avec des contraintes quadratiques sur les distances O5′-C5′. En plus d’un nombre réduit de variables par rapport aux programmes de coordonnées cartésiennes, le choix de variables physiquement significatives permet de grands mouvements conformationnels concertés pendant la minimisation, ainsi qu’un contrôle efficace de la structure et une introduction facile de contraintes ou de contraintes. Les outils disponibles comprennent à la fois la cartographie adiabatique et les recherches combinatoires par rapport aux paramètres structurels choisis. Les particularités du champ de force de flexion incluent la présence d’un terme spécifique pour rendre compte de la dépendance angulaire de la liaison hydrogène et la possibilité d’un criblage d’énergie électrostatique avec une fonction diélectrique sigmoïdale, ε(R) = D-(D-D0) / 2 exp(-RS), où R est la distance entre deux charges. La pente S, la valeur de plateau à grande distance D et la valeur initiale D0 de la fonction sont réglables, avec des valeurs par défaut de 0,16, 80 et 1, respectivement, en utilisant deux hypothèses déjà utilisées pour la construction de la triple hélice à rainure mineure. Tout d’abord, les triplets de base sont retenus pour être coplanaires afin d’éviter toute interaction possible entre triplets interbases. De telles interactions se forment facilement lors de la construction d’hélices étirées mais ne peuvent jouer un rôle dans la reconnaissance ou l’échange de brins, car ces processus sont indépendants de la séquence globale. Il a été vérifié que la structure optimisée du triplex à rainure mineure est indépendante de ces contraintes. La deuxième hypothèse, conforme à la stoechiométrie des complexes RecA/ADN, qui montre trois nucléotides par monomère RecA, est l’utilisation de la symétrie hélicoïdale des trinucléotides. Pour cette raison, les études préliminaires ont été limitées aux séquences à répétition trinucléotidique.

Des contraintes ou contraintes spécifiques sont nécessaires pour la construction et la manipulation de triplex. Il s’agit notamment des contraintes de « plateau » et des contraintes de symétrie trinucléotidique, décrites précédemment. La retenue  » plateau  » maintient la coplanarité des bases formant un triplet, tout en permettant les rotations et les déplacements nécessaires à la commutation des paires de bases. La contrainte de symétrie trinucléotidique implique l’équivalence des variables décrivant chaque groupe successif de trois nucléotides. L’étirement de l’adNDD, de sorte que la torsion diminue et que le sillon mineur s’ouvre, a été précédemment réalisé en limitant la distance entre les atomes terminaux O3′ de l’unité de symétrie trinucléotidique. Cette retenue a été légèrement modifiée car la distance O3 ‘-O3’ peut être modifiée par un déplacement latéral des dorsales lors de l’échange de brins. Dans un travail récent, seule la composante du vecteur O3 ‘-O3’ parallèle à l’axe de l’hélice a été retenue. Les contraintes sur la largeur de la rainure, calibrées à l’aide de calculs électrostatiques numériques de Poisson-Boltzmann, ont été utilisées pour éviter le rétrécissement de la rainure dû à l’absence de molécules de solvant explicites.

La commutation de paires de bases est étudiée par rotation de base, selon l’approche définie par Bernet et al. Il s’agit d’une contrainte appliquée à l’angle θ entre la liaison glycosidique (purine : C1′-N9 ou pyrimidine : C1′-N1) et le vecteur joignant les deux atomes en C1′ d’une paire de bases, projetée sur le plan perpendiculaire à un axe hélicoïdal local. θ a une valeur de 55° dans l’ADN-B canonique. La modélisation de la commutation de paires de bases pour une base choisie implique une variation adiabatique de θ de 65° à 10 ° par pas de 2° tout en maintenant à la fois des contraintes de « plateau » et d’étirement.

Les obstacles et les limitations rencontrés dans la formation de la triple hélice

Les applications biologiques des OPT sont compromises par des considérations biophysiques fondamentales, ainsi que par des limitations imposées par des conditions physiologiques. La formation de triplex implique l’approche et la liaison d’un troisième brin chargé négativement à un duplex à double charge négative. La neutralisation de la répulsion de charge est généralement assurée expérimentalement par des niveaux de Mg ++ (5-10 mM) beaucoup plus élevés que ce que l’on pense être disponible dans les cellules. De plus, la formation de triplex implique des changements conformationnels de la part du troisième brin et une certaine distorsion du duplex sous-jacent. Les triplex à motifs pyrimidiniques sont instables au pH physiologique en raison de la nécessité d’une protonation de la cytosine qui se produit à un pH relativement acide (pKa = 4,5). Ceci est nécessaire pour la deuxième liaison hydrogène de Hoogsteen, bien que la charge positive résultante apporte apparemment la contribution la plus importante à la stabilité du triplex. Les triplex à motifs pyrimidiniques contenant des cytosines adjacentes sont souvent moins stables que ceux contenant des cytosines isolées. Traditionnellement, cela a été attribué aux effets de répulsion charge-charge, bien qu’une étude récente suggère qu’une protonation incomplète des cytosines adjacentes pourrait être le facteur critique. De plus, les troisièmes brins à motif purine (riches en G) peuvent former des tétrades G à des niveaux physiologiques de K +, ce qui inhibe la formation de triplex. Tous ces facteurs imposent des barrières cinétiques à la formation des triplex et réduisent la stabilité des triplex une fois formés (la plupart des triplex, même dans des conditions optimales in vitro, sont moins stables que le duplex sous-jacent.

Stratégies pour contrer les limitations

Le premier problème rencontré dans la stratégie antigénique triple hélicoïdale est l’instabilité du triplex formé par les TFOs dans des conditions physiologiques qui limite par conséquent l’utilisation de cette stratégie très fascinante destinée à la correction génique dans une mesure variable. Par conséquent, diverses approches et stratégies ont été proposées pour conférer une stabilité à la structure triple hélicoïdale formée.

Les hélices triples dirigées par des oligonucléotides peuvent être stabilisées en utilisant des ligands d’acide nucléique qui stabilisent sélectivement les hélices triples. Par exemple, il a été démontré que le bromure d’éthidium lie et stabilise une triple hélice faite de poly(DT) · poly(dA)× poly (DT), qui ne contient que des triplets T·A×T. Cependant, ce composé stabilise mal (voire déstabilise) les triples hélices contenant à la fois des triplets de base T·A×T et C·G×C+, probablement par répulsion électrostatique. Les dérivés du benzopyridoindole ont été les premières molécules rapportées à stabiliser fortement ce dernier type de triple hélice même s’ils ont une préférence pour les étirements T·A×T. Il a également été démontré que plusieurs autres intercalateurs ainsi que divers ligands de rainures mineures de l’ADN se lient à des hélices triples de l’ADN. Par exemple, les hélices triples peuvent être stabilisées par modification chimique d’oligonucléotides tels que, le psoralène attaché aux oligonucléotides a été montré pour améliorer leur activité biologique après irradiation UV. Les intercalateurs stabilisent généralement dans une plus grande mesure des hélices triples contenant des triplets T · A× T, tandis que les liants de sillons mineurs déstabilisent généralement les triplex, sauf dans un cas particulier où la triple hélice implique un brin d’ARN. Comme aucune donnée structurelle n’est disponible sur les complexes triple hélice-ligand, on ne sait pas grand-chose sur les interactions qui dirigent l’intercalation spécifique dans les triples hélices. Il a été démontré que les dérivés de BPI s’intercalent entre des triplets de base T ·A×T par transfert d’énergie de fluorescence d’excitation des triplets de base aux ligands et par dichroïsme linéaire et circulaire. Les oligonucléotides morpholino parallèles à la pyrimidine se sont avérés capables de former un triplex avec une cible duplex. Comme prévu, ce motif a nécessité un pH bas pour la formation de triplex, comme l’exige le phosphodiester à motif parallèle à la pyrimidine TFO. Il peut être possible de surmonter cette dépendance au pH avec des substitutions telles que la 5-méthylcytosine pour les cytosines du TFO.

Une autre approche par laquelle les hélices triples peuvent être stabilisées consiste en des modifications chimiques des oligonucléotides, telles que la fixation covalente d’une molécule d’acridine. Il a été démontré que la substitution de l’acridine augmente fortement l’inhibition du clivage enzymatique de la restrictine et qu’elle n’altère pas non plus la spécificité de la séquence pour la formation de triplex.

Applications de l’ADN à triple Hélice

La formation de triples hélices d’ADN intermoléculaires offre la possibilité de concevoir des composés aux propriétés étendues de reconnaissance de séquences, qui peuvent être utiles comme agents antigéniques ou outils en biologie moléculaire. Au cours de la dernière décennie, une nouvelle approche utilisant des analogues de l’ADN, en tant qu’agents thérapeutiques, est en train d’émerger en chimie médicinale. Ceci est basé sur la régulation de l’expression des gènes des protéines/enzymes liées à la maladie en bloquant leur transcription (antigène) ou leur traduction (antisens) (fig. 4). Il est affecté par la liaison spécifique à la séquence d’oligonucléotides complémentaires à l’ADN duplex via la formation de triplex pour inhiber la production d’ARNm ou interférer dans la traduction de ce dernier en protéines. Étant donné que les oligonucléotides ne pénètrent pas facilement dans les cellules et peuvent être détruits par les nucléases cellulaires, une variété d’analogues chimiquement modifiés d’oligonucléotides sont en cours de conception, de synthèse et d’évaluation en vue de leur développement en tant qu’agents thérapeutiques.

Figure

Figure 4: Principes des thérapies antigéniques et antisens

La reconnaissance spécifique des régions homopurine-homo pyrimidine dans l’ADN duplex par des oligonucléotides triplex (TFOS) fournit une stratégie attrayante pour la manipulation génétique, dans le but ultime de réparer les défauts génétiques dans les cellules humaines. La capacité de cibler les mutations peut s’avérer utile, comme outil d’étude de la réparation de l’ADN et comme technique de thérapie génique et de génie génétique.

Des outils efficaces basés sur des hélices triples ont été développés pour diverses applications biochimiques telles que le développement de nucléases artificielles hautement spécifiques. La stratégie antigénique reste l’un des domaines d’application triplex les plus fascinants pour contrôler sélectivement l’expression génique (tableau 1). Le ciblage des séquences génomiques s’est avéré être un concept précieux sur un nombre encore limité d’études ; la mutagenèse locale est à cet égard une application intéressante des oligonucléotides triplex, sur des cultures cellulaires.

Target gene Cell line Oligomersize, andmodifications
Transfected genes CAT gene/ IL ?2Rpromoter
CAT gene/(6-16)
IRECAT gene/tkpromoter
PRE upstream
Endogenous genes
IL-2R
c-myc
SV 40 T Ag
Antivirals
SV 40
HIV-1		 HSB2 cells (T-cell) HeLacells
cv-1 cells
Human lymphocytes
HeLacells
Tsa 8 cells
CV-1 MT4		 15-mer acridine orpsoralenlinked
21-mer
38-mer
colesterol
28-mer
27-mer
15,20-mer
PNAs 8-mer, acridine
31,38-mers

Table 1: Les études sur les acides nucléiques antigéniques au sein des cellules Eucaryotiques80

Les stratégies antigéniques se concentrent principalement sur le ciblage des gènes par recombinaison homologue ou par oligodésoxynucléotides formant une triple hélice. Pour de nombreuses raisons techniques, y compris l’accessibilité très limitée des gènes au sein de la structure chromosomique fortement condensée au paludisme et enveloppée de protéines, l’application clinique de ces méthodes n’a pas progressé rapidement. Kielkopf et al ont récemment décrit une approche alternative, utilisant des polyamides qui peuvent diffuser dans le noyau et reconnaître des séquences d’ADN spécifiques. Bien que très excitante, cette méthodologie en est encore à ses balbutiements et son utilité clinique ultime reste inconnue.

Applications thérapeutiques de la technologie des antigènes

L’ADN à triple hélice a attiré l’attention en raison de l’application potentielle de TFOs comme agents thérapeutiques, pour des applications telles que le ciblage de gènes intracellulaires, en tant que solutions chimiques rationnelles pour la reconnaissance spécifique de séquence d’un duplex d’ADN et l’identification des gènes responsables de la croissance cellulaire et de la transformation maligne. Avec ces connaissances est venu un désir naturel de traduire ces informations en nouvelles stratégies thérapeutiques spécifiques pour le traitement du cancer, des maladies cardiovasculaires et d’autres maladies courantes de l’humanité (tableau 2). Le développement récent d’un inhibiteur biochimique relativement spécifique de la protéine tyrosine kinase bcr / abl chez les patients atteints de leucémie myéloïde chronique est un exemple étonnant de cette quête. Pour les thérapies visant directement le remplacement, la réparation ou la désactivation des gènes responsables de la maladie, les progrès ont été beaucoup plus lents et un succès équivalent à l’inhibiteur biochimique bcr / abl n’a pas encore été atteint. Les raisons en sont complexes et varient selon le type de thérapie génique utilisée.

Disease Cause
Cancer
Viral infection
Endocrinological
Bacterial
Neurological
Autoimmune
Parasite		 Uncontrolledcellgrowthfrommutationalactivation and activation of oncogenes
Replication of virus in host cellse.g., HIV,HSC, influenza
Abnormallevels of-renin, angiotensinaseorvasopressin precursor (highbloodpressure)-transforminggrowth factor(kidneyfailure)-growth hormone(acromegaly)-gastrins (ulcers)
Antibioticresistant tuberculosis, mycoplasmas-blocking of 3’terminus of16s RNA
Lesins in β-amyloid gene (Alzhiemer’sdisease)
Inadvertantproduction of antibodiesagainst normal tissues (degradation of
host tissue -arthritis, myasthenia
gravis), blocking β-cell, Igcellor T-cell
receptor genes byantisense
Haempolymeraseproduction (malaria­blockingexpressions of haempolymerase), maladie du sommeil (trypansome)

Tableau 2:Certaines maladies pouvant être traitées par des thérapies à base d’ADN

Stephenson et Zamecnik ont montré qu’un oligonucléotide d’ADN court (13nt) inverse complémentaire en séquence (antisens) au virus du sarcome de Rous pouvait inhiber la réplication virale en culture. L’une des propriétés les plus importantes des oligonucléotides antisens et antigéniques dans leur utilisation en tant que thérapeutiques est leur résistance aux nucléases. Les oligonucléotides de phosphorothioate sont le type d’oligonucléotides le plus courant ayant une résistance aux nucléases relativement élevée et ont été introduits sur le marché comme médicaments contre la rétinite induite par le cytomégalovirus. Les oligonucléotides avec un résidu d’acide nucléique 2′-O, 4′-C-éthylène (ENA) en deuxième position à partir de l’extrémité 3′ présentent une résistance nucléasique beaucoup plus élevée que ceux avec un résidu d’acide nucléique verrouillé (LNA) à la même position.

Bien que Kurreck et al aient rapporté que les oligonucléotides de LNA étaient stables dans le sérum humain, les oligonucléotides d’ENA partiellement modifiés étaient beaucoup plus résistants aux nucléases que les oligonucléotides de LNA dans le plasma de rat. De plus, les oligonucléotides modifiés de manière contiguë avec des résidus ENA à l’extrémité 3′ et 5′ présentent plus de stabilité que ceux partiellement modifiés. Ainsi, les oligonucléotides ENA ont un potentiel élevé en tant qu’agents antisens et antigènes utilisables in vivo. La formation de triplex spécifique à la séquence peut être appliquée pour le ciblage génique, le silençage génique et la mutagenèse.

Perspectives d’avenir

Les oligonucléotides peuvent se lier spécifiquement à un gène cible d’intérêt par la formation d’une triple hélice. Les oligonucléotides formant des triplex sont actuellement conçus pour se lier au gène HER-2 (récepteur du facteur de croissance épidermique humain 2) / neu, un gène qui est surexprimé dans une grande variété de tumeurs humaines, y compris le cancer du poumon non à petites cellules, le cancer du sein, le cancer de l’ovaire et les tumeurs gastro-intestinales. Cette stratégie sera largement applicable pour prévenir l’expression de nombreux oncogènes ou d’autres gènes liés au cancer. Ces oligonucléotides « antigènes » sont maintenant utilisés pour délivrer des agents alkylants d’ADN à des bases spécifiques du promoteur et de la séquence codante HER-2/neu, afin d’empêcher l’initiation et l’élongation de la transcription. En particulier, des oligonucléotides formant des triplex ont été utilisés pour délivrer de la moutarde azotée, telle que le chlorambucil, à une base de guanine spécifique dans le gène HER-2 /neu pour empêcher l’expression du gène. La stratégie anticancéreuse spécifique à la cible impliquant des oligonucléotides antigéniques couplés à des médicaments actifs de l’ADN s’avérera une étape importante dans un avenir proche.

  1. Thuong, T.-N. et Hélène, C., Angew. Chem. Int., 1993, 32, 666
  2. Mirkin, S.M. et Frank-Kamenetskii, MD, Annu. Rév. Biophys.Biomol. Structure., 1994, 23, 541.
  3. Patrizia, A., Paola B.A., Jean-Louis, M., Thérèse G., Claude H. andJian-Sheng S., Nucl. Acide. Rés., 2002, 30, 5407.
  4. Sun, J. S. et Hélène, C., Curr. Opin. Structure. Biol., 1994, 3, 345.
  5. Le Doan, T., Perrouault, L., Praseuth, D., Habhoub, N., Decout, J.L., Thuong, N.T., Lhomme, J. et Hélène, C., Nucl. Acide. Rés., 1987,15, 7749.
  6. Moser, H.E. et Dervan, P.B., Science, 1987, 238, 645.
  7. Beal, P.A. et Dervan, P.B., Science, 1991, 251, 1360.
  8. Pilch, D.S., Levenson, C. et Shafer, R.H., Biochimie, 1991, 30,6081.
  9. DeBizemont, T., Duval-Valentin, G., Sun, J.S., Bisagni, E., Garestier, T. et Hélène, C., Nucl. Acide. Rés., 1996, 24, 1136.
  10. McGuffie, E.M. et Catapano, C.V., Nucl. Acide. Rés., 2002, 30,12, 2701.
  11. Basye, J., Trent, J.O., Gao, D. et Ebbinghaus, S.W., Nucl. Acide.Rés., 2001, 29, 4873.
  12. Hélène, C. et Toulme, J.J., Biochem. Biophys. Acta., 1990,1049, 99.
  13. Hélène, C., Eur. J. Cancer, 1994, 30, 1721.
  14. Stein, C.A. et Cheng, Y.C., Science, 1993, 261, 1004.
  15. Wagner, R.W., Nature, 1994, 372, 333.
  16. Praseuth, D., Guieysse, A.L., Hélène, C., Biochem. Biophys.Acta., 1999, 1489, 181.
  17. Sun, J.S., DeBizemont, T., Duval-Valentin, G., Montenay-Garestier, T. et Hélène, C., C.R. Acad. Sci., 1991, 313, 585.
  18. Gamper, H.B.J., Kutyavin, I.V., Rhinehart, R.L., Lokhov, S.G., Reed, M.W. et Meyer, R.B., Biochemistry, 1997, 36, 14816.
  19. Eder, P.s., DeVine, R.J., Dagle, J.M. et Walder, J.A., AntisenseRes. Dev., 1991, 1, 141.
  20. Fisher, T.L., Terhorst, T., Cao, X. et Wagner, R.W., Nucl. Acide.Rés., 1993, 21, 3857.
  21. Stein, D., Foster, E., Huang, S. B., eller AcidDrugDev., 1997, 7, 151.
  22. Summerton, St AcidDrugDev., 1997, 7, 63.
  23. Summerton, Antis AcidDrugDev., 1997, 7, 187.
  24. Hudziak, R. M., Barofsk. AcidDrugDev., 1996, 6,267.
  25. Ghosh, C., Stein, D., eller, 2000, 313, 135.
  26. Giles, R.V., Spiller, D.G., Clark, R.E. and Tidd, D.M., AntisenseNucl. AcidDrugDev., 1999, 9, 213.
  27. Ghosh, C. and Iversen, P.L., AntisenseNucl. AcidDrugDev.,2000, 10, 263.
  28. Lacroix, L., Arimondo, P.B., Takasugi, M., Helene, C. and Mergny,J.L., Biochem. Biophys. Res. Commun., 2000, 270, 363.
  29. Rougee, M., Faucon, B., Mergny, J.L., Barcelo, F., Giovannangeli, C.,Garestier, T. and Helene, C., Biochemistry, 1992, 31, 9269.
  30. Maher, L.J., Dervan, P.B. and Wold, B.J., Biochemistry, 1990, 29,8820.
  31. Singleton, S.F. and Dervan, P.B., Biochimie, 1993, 32, 13171.
  32. Blume, S.W., Lebowitz, J., Zacharias, W., Guarcello, V., Mayfield, C.A., Ebbinghaus, S.W., Bates, P., Jones, D.E., Trent, J. andVigneswaran, N., Nucl. Acide. Rés., 1999, 27, 695.
  33. Darnell, J., Lodish, H. et Baltimore, D., In; Molecular CellBiologiScientific American Books, New York, 1990, 531.
  34. Suda, T., Mishima, Y., Asakura, H. et Kominami, R., Nucl. Acide.Rés., 1995, 23, 3771.
  35. Olivas, W.M. et Maher, L.J., Nucl. Acide. Rés., 1995, 23, 1936.
  36. Svinarchuk, F., Cherny, D., Debin, A., Delain, E. et Malvy, C., Nucl.Acide. Rés., 1996, 24, 3858.
  37. Faruqi, A.F., Krawczyk, S.H., Matteucci, MD et Glazer, P.M., Nucl. Acide. Rés., 1997, 25, 633.
  38. Blume, S.W., Guarcello, V., Zacharias, W. et Miller, D.M., Nucl.Acide. Rés., 1997, 25, 617.
  39. Ouali, M., Letellier, R., Adnet, F., Liquier, J., Sun, J.S., Lavery, R. Ettaillandier, E., Biochimie, 1993, 32, 2098.
  40. Macaya, R.F., Schultze, P. et Feigon, J., J. Amer. Chem. Soc.,1992, 114, 781.
  41. Radhakrishnan, I. et Patel, D.J., Biochimie, 1994, 33, 11405.
  42. Arnott, S., Bond, P.J., Selsing, E. et Smith, P.J.C., Nucl. Acide.Rés., 1976, 3, 2459.
  43. Lavery, R. et Sklenar, H., J. Biomol. Structure. Dyn., 1988, 6, 63.
  44. Bertucat, G., Lavery, R. et Prevost, C., J. Biomol. Structure. Dyn.,1998, 16, 535.
  45. Lavery, R., Peyrard, M., Eds. In; Excitation non linéaire inBiomolécules, Springer-Verlag, Editions de Physique, Berlin et New York, 1995, 57.
  46. Hingerty, B.E., Richtie, R.H., Ferrell, T.L. et Turner, J.E., Biopolymers, 1985, 24, 427.
  47. Bernet, J., Zakrzewska, K. et Lavery, R., J. Mol. Structure.Théochem., 1997, 398-399, 473.
  48. Pesco, J., Salmon, J.M., Vigo, J. et Viallet, P., Anal. Biochem.,2001, 290, 221.
  49. Gilbert, D.E. et Feigon, J., Curr. Opin. Structure. Biol., 1990, 9, 305.
  50. 50. Shimizu, M., Konishi, A., Shimada, Y., Inoue, H., et Ohtsuka, E., FEBS. Lett., 1992, 302, 155.
  51. Asensio, J.L., Carr, R., Brown, T. et Lane, A.N., J. Amer.Chem. Soc., 1999, 121, 11063.
  52. Asensio, J.L., Lane, A.N., Dhesi, J., Bergqvist, S. et Brown, T., J.Mol. Biol., 1998, 275, 811.
  53. Volker, J. et Klump, H.H., Biochimie., 1994,33, 13502 .
  54. Sugimoto, N., Wu, P., Hara, H. et Kawamoto, Y., Biochimie.,2001, 40, 9396.
  55. Arimondo, P.B., Garestier, T., Helene, C. et Sun, J.S., Nucl. Acides., 2001, 29, 15.
  56. Michael, M., Seidman, M.M. et Peter, M.G., J. Clin.Investir., 2003,112, 487.
  57. Panas Scaria, P.V. et Shafer, R.H., J. Biol. Chem., 1991, 266,5417.
  58. Mergny, J.L., Collier, D., Rougee, M., Montenay-Garestier, T. andHelene, C., Nucl. Acide. Rés., 1991, 19, 1521.
  59. 59. Mergny, J.L., Duval-Valentin, G., Nguyen, C.H., Perrouault, L., Faucon, B., Rougee, M., Montenay-Garestier, T., Bisagni, E. andHelene, C., Science, 1992, 256, 1681.
  60. Lee, J.S., Latimer, L.J.P. et Hampel, K.J., Biochimie, 1993, 32,5591.
  61. Park, Y.W. et Breslauer, K.J., Proc. Natl. Acad. Sci. États-Unis, 1992, 89, 6653.
  62. Durand, M., Thuong, N.T. et Maurizot, J.C., J. Biol. Chem., 1992,267, 24394.
  63. Durand, M., Thuong, N.T. et Maurizot, J.C., J. Biomol. Structure.Dyn., 1994, 11, 1191.
  64. Kulka, M., Smith, C.C., Aurélien, L., Meade, K., Miller, P. et Ts’o, P.O.P., Proc. Natl. Acad. Sci. États-Unis, 1989, 86, 6868.
  65. Chang, E.H., Miller, P.s., Cushman, C., Devdas, K., Pirolo, K. F., Ts’Op.O.P. et Yu, Z. P., Biochimie, 1991, 30, 8283.
  66. Pilch, D.S. et Breslauer, K.J., Proc. Natl. Acad. Sci. États-Unis, 1994, 91, 9332.
  67. Pilch, D.S., Waring, M.J., Sun, J.S., Rougee, M., Nguyen, C.H., BisagniE., Garestier, T. et Helene, C., J. Mol. Biol., 1993, 232, 926.
  68. Kim, S.K., Sun, J.S., Garestier, T., Helene, C., Bisagni, E., Rodger, A. et Norden, B., Biopolymers, 1997, 42, 101.
  69. Lin, S.B., Kao, C.F., Lee, S.C. et Kan, L.S., Médicaments anticancéreux., 1994, 9, 1.
  70. Grigoriev, M., Praseuth, D., Robin, P., Hemar, A., Saison-Behmoaras, T., Dautry-Varsat, A., Thuong, N.T. et Helen, C., Proc. Natl.Acad. Sci. États-Unis, 1991, 88, 3389.
  71. Grigoriev, M., Praseuth, D., Robin, P., Hemar, A., Saison-Behmoaras, T., Dautry-Varsat, A., Thuong, N.T., Helen, C. et Harel-Bellan, A., Proc. Natl. Acad. Sci. États-Unis, 1992, 267, 3389.
  72. Gowers, D.M. et Fox, K.R., Nucl. Acide. Rés., 1999, 27, 1569.
  73. 73. Nagatsugi, F., Sasaki, S., Miller, P.s. et Seidman, M.M., Nucl.Acide. Rés., 2003, 15, 31.
  74. Melton, D.W., BioEssays, 1994, 16, 633.
  75. Hélène, C., Cancer, 1994, 30, 1721.
  76. Majumdar, A., Khorlin, A. et Dyatkina, N., Nat. Genet., 1998, 20,212.
  77. Kielkopf, C.L., Baird, E.E. et Dervan, P.B., Nat. Structure. Biol.,1998, 5, 104.
  78. Alan, M. et Gewirtz, M.D., J. Clin. Oncol., 2000, 18, 1809.
  79. Rao, N.R. et Nalluri, B.N., Ind. J. Pharm. Edu., 2003, 37, 132.
  80. Varmus, H.E., I. Biosci. Rép., 1990,10,413.
  81. Fearon, E.R. et Dang, C.V., Biol actuel., 1999, 9, R62.
  82. Hahn, W.C., Counter, C.M. et Lundberg, A.S., Nature, 1999, 400,464.
  83. Druker, B.J. et Lydon, N.b., J. Clin. Investir., 2000, 105, 3.
  84. Stephenson, M.L. et Zamecnik, P.C., Proc. Natl. Acad. Sci.U.S. A., 1978, 75, 285.
  85. engrenage de la pharmacocinétique.,2002, 41, 255.
  86. Morita, K., Hasegaw Med. Chem.Lett., 2002, 12, 73.
  87. Kurreck, Acide Nu.Rés., 2002, 30, 1911.
  88. Koizumi, M., Morita, K., Daigo, M., Tsutsumi, S., Abe, K., Obika, S. et Imanishi, T., Nucl. Acide. Rés., 2003, 31, 3267.

Laisser un commentaire

Votre adresse e-mail ne sera pas publiée.