Frontiers in Pharmacology

Introduction

Les protéines membranaires participent aux événements physiologiques fondamentaux dans tous les systèmes biologiques, des bactéries aux humains. >50% des médicaments commercialisés ciblent les protéines membranaires, alors que le ciblage pharmacologique de nombreuses autres protéines membranaires est considéré comme potentiellement bénéfique dans de nombreuses applications biomédicales (Overington et al., 2006; Yıldırım et coll., 2007; Arinaminpathy et coll., 2009). Cependant, les mécanismes moléculaires sous-jacents à leur fonction et à leur régulation restent largement inconnus en raison du manque d’informations structurelles. En effet, alors que les protéines membranaires représentent environ 26% du protéome humain, leurs structures ne représentent que ∼2% des structures de la Banque de données sur les protéines (Fagerberg et al., 2010; Pandey et coll., 2016). Plusieurs obstacles entravent l’étude structurelle des protéines membranaires, nécessitant le développement de technologies de pointe pour élucider leurs architectures moléculaires (Pandey et al., 2016; Masson et coll., 2017; Hagn et coll., 2018; Ravula et Ramamoorthy, 2019; Redhair et al., 2019). Les principaux obstacles sont que leur surexpression et leur purification et leurs études structurales par la plupart des techniques (par exemple, la cristallographie aux rayons X) restent limitées dans de nombreux cas. Ces obstacles entravent par conséquent le développement rationnel de candidats médicaments ciblant les protéines membranaires liées à la maladie (Vinothkumar et Henderson, 2010; Lounnas et al., 2013; Marciano et coll., 2014).

Les transporteurs secondaires sont des protéines liées à la membrane qui catalysent sélectivement le mouvement de solutés peu perméables (p. ex., ions, neurotransmetteurs, médicaments) à travers la membrane cellulaire, soutenant diverses fonctions cellulaires dans la santé et la maladie. Les transporteurs secondaires respectent le paradigme d’accès alternatif, selon lequel la poche de liaison au ligand protéique devient alternativement accessible sur les côtés opposés de la membrane en adoptant successivement les états face vers l’intérieur (IF) et face vers l’extérieur (OF) (Jardetzky, 1966; Forrest et al., 2011). Des percées récentes dans la biologie structurale des protéines membranaires ont fourni une multitude de structures de transporteurs liés à la membrane dans différents états conformationnels (Drew et Boudker, 2016; Bai et al., 2017), fournissant des informations sur leurs mécanismes de transport et de reconnaissance des solutés. Cependant, ils fournissent des instantanés statiques d’un processus en plusieurs étapes (Seeger, 2018). Ainsi, il existe un besoin croissant de développer de nouvelles approches pour étudier la dynamique des protéines membranaires (Konermann et al., 2011; Smith et coll., 2012; Sim et coll., 2017; Mandala et coll., 2018; Burke, 2019). Celles-ci comprennent une combinaison de simulations de dynamique moléculaire (MD) (Roux et al., 2011; Zdravkovic et coll., 2012; Zhekova et coll., 2016; Zhekova et coll., 2017; Harpole et Delemotte, 2018) avec des techniques expérimentales avancées, y compris des techniques spectroscopiques et la microscopie électronique cryogénique à une particule (Smith et al., 2012; Pandey et coll., 2016; Castell et coll., 2018; Hagn et coll., 2018; Ravula et Ramamoorthy, 2019; Sun et Gennis, 2019).

La spectrométrie de masse échangeuse d’hydrogène-deutérium (HDX-MS) a attiré l’attention ces dernières années pour l’étude de la dynamique des protéines membranaires, même si elle est utilisée depuis des décennies pour caractériser les protéines solubles (Konermann et al., 2011; Vadas et coll., 2017). HDX-MS surveille l’échange en fonction du temps du solvant D2O avec les hydrogènes d’amide du squelette des protéines dans des conditions natives. Le taux de change du deutérium dépend de l’accessibilité du solvant, de la structure secondaire et de la rigidité structurelle (Konermann et al., 2011). Couplé à la digestion protéolytique et à la séparation des peptides, HDX-MS permet la quantification des taux de change dans des segments protéiques courts, jusqu’à la résolution d’un seul résidu. Deux avantages majeurs de HDX-MS sont que de petites quantités de protéines (< 0,1 mg) sont nécessaires pour l’analyse et que le marquage chimique des protéines n’est pas nécessaire, ce qui évite les perturbations structurelles indésirables. Ici, nous résumons les progrès récents et les applications dans l’utilisation de HDX-MS pour l’étude de la dynamique structurelle des transporteurs.

Principes de spectrométrie de masse d’échange Hydrogène-Deutérium

Les principes HDX-MS sont brièvement et qualitativement décrits ci-dessous, afin de permettre une discussion de ses applications pour l’étude des transporteurs. Pour des explications approfondies, plusieurs excellents articles de revue sont disponibles (Konermann et al., 2011; Rand et coll., 2014; Engen et Pays de Galles, 2015; Masson et al., 2017; Oganesyan et coll., 2018; Masson et coll., 2019; Redhair et coll., 2019).

Dans les expériences HDX, le deutérium échange avec des hydrogènes de protéines labiles de manière dépendante du temps après dilution des protéines dans un tampon D2O (Masson et al., 2017) (Figure 1). HDX-MS surveille principalement l’échange d’hydrogènes amides dorsaux car i) à pH neutre, ils sont échangés à des taux qui peuvent être détectés à l’aide de HDX-MS (secondes à jours) et ii) leur échange peut être efficacement éteint (Marcsisin et Engen, 2010; Gallagher et Hudgens, 2016). Le taux HDX dépend de plusieurs paramètres. Les hydrogènes amides peuvent présenter un  » état fermé », issu de la participation à des liaisons hydrogène stables dans des structures secondaires ou de l’inaccessibilité des solvants, qui ne permet pas leur échange avec le deutérium solvant, ou un  » état ouvert » où l’abstraction de protons, l’étape de limitation de vitesse de HDX, peut se produire (Oganesyan et al., 2018). De plus, la réaction a une constante de vitesse chimique intrinsèque, qui dépend du pH, de la température et de l’environnement du résidu (Oganesyan et al., 2018).

La transition entre les états fermé et ouvert se produit par des événements de déroulement locaux. Dans des conditions natives, dans lesquelles les protéines sont bien repliées, le taux de HDX dépend principalement du taux de transition vers l’état fermé (Weis et al., 2006). Si la région protéique dépliée revient à l’état fermé à un rythme beaucoup plus lent que le taux d’échange chimique, une cinétique EX1 est observée, ce qui entraîne une absorption de deutérium corrélée dans les résidus voisins. Il en résulte deux populations : une à faible m/z et une à haute m/z, reflétant des peptides provenant de molécules protéiques qui n’ont pas et qui ont subi d’échange, respectivement. Avec le temps, la population m / z élevée devient plus importante au détriment de la population m / z faible. La cinétique EX1 est considérée comme rare dans les protéines repliées dans des conditions natives, mais peut être induite, par exemple, par l’ajout de dénaturants (Weis et al., 2006; Oganesyan et coll., 2018). Si la protéine revient à l’état fermé à un taux beaucoup plus rapide que le taux d’échange chimique, une cinétique EX2 est observée. Ici, l’échange dépend de la transition des résidus individuels entre l’état ouvert et fermé, se produisant de manière non corrélée. Ainsi, avec le temps, une seule population avec des valeurs m/z en augmentation progressive est observée (Weis et al., 2006).

Après deutération, la réaction est éteinte à des moments prédéfinis en changeant le pH de neutre (7) à pHmin (2,5-3), ce qui entraîne une réduction d’environ 10 000 fois de HDX (Konermann et al., 2011; Masson et coll., 2017; Oganesyan et coll., 2018); et en réduisant la température de 25 à 0 ° C, entraînant une diminution d’environ 14 fois de HDX (Englander, 2006; Oganesyan et al., 2018). Ensuite, la protéine est digérée à l’aide d’une protéase et les peptides sont séparés par chromatographie analytique en phase inverse. Actuellement, le goulot d’étranglement technique majeur des expériences HDX-MS réside dans l’obtention d’une couverture de séquence élevée, limitée par la résistance aux enzymes digestives et par les conditions protéolytiques. Enfin, les peptides élués sont identifiés par MS et le degré de HDX est calculé sur la base des valeurs m/z obtenues. Les détails expérimentaux et les pièges de la digestion des protéines, de la séparation des peptides et de l’identification de la SEP dépassent le cadre de cette revue (Konermann et al., 2011; Masson et coll., 2017; Masson et coll., 2019).

Études de spectrométrie de masse des protéines membranaires par échange hydrogène-Deutérium

Malgré le partage du paradigme d’accès alternatif, les changements conformationnels induits par le ligand diffèrent entre les transporteurs en raison des différences dans les interactions ligand-protéine. Par exemple, les symporteurs (co-transportant deux ligands ou plus) peuvent faire la transition entre les états IF et DES états sans ligands liés, alors que la liaison aux ligands est obligatoire pour l’échange entre les états IF et DES états dans les anti-transporteurs (échange de ligands de part et d’autre de la membrane) (Forrest et al., 2011; Drew et Boudker, 2016; Bai et al., 2017).

En général, il est difficile de détecter les changements dynamiques induits par les ligands locaux dans les protéines. Par exemple, les structures cristallines des protéines membranaires sous les formes sans ligand et liées au ligand sont souvent indisponibles, ce qui empêche la détection de changements conformationnels induits par le ligand, même pour des protéines ayant des structures connues. De plus, les instantanés structuraux à haute résolution de l’apo et des états liés au ligand peuvent ne pas résoudre les différences conformationnelles significatives. Cependant, de petits changements conformationnels induits par les ligands peuvent être détectés à l’aide de HDX-MS dans des sous-domaines protéiques spécifiques dans des conditions natives en mesurant l’absorption différentielle de deutérium (ΔHDX) en présence et en l’absence de ligands. Cette capacité de HDX-MS offre des opportunités uniques pour résoudre les problèmes les plus difficiles à élucider les mécanismes des interactions ligand-protéine et protéine-protéine (Rand et al., 2014; Masson et coll., 2019; Redhair et coll., 2019), tel que examiné ici pour un certain nombre de protéines de transport récemment étudiées.

Transitions conformationnelles Sous-jacentes à l’Accès alternatif : Les protéines Na+/H+Antiporter

Nha régulent le pH, le volume et le volume cellulaires dans tous les règnes de la vie (Padan et Landau, 2016). Le principal modèle structurel utilisé pour étudier les orthologues Nha est Escherichia coli NhaA, pour lequel une structure cristallographique de l’état inactif à pH acide est disponible (Hunte et al., 2005). Pour étudier la dynamique structurale du NhaA sous pH physiologique, HDX-MS a récemment été utilisé (Eisinger et al., 2017). Crucial pour les informations obtenues dans cette étude, HDX-MS fournit des données dynamiques globales, contrairement aux méthodes basées sur un étiquetage spécifique au site, qui ne détectent que les mouvements de régions protéiques prédéfinies.

Dans cette étude, une couverture de séquence exceptionnellement élevée de 88,5% a été obtenue pour le NhaA dans le détergent, fournissant des informations sur le mécanisme sous-jacent à l’accès alternatif lors de la liaison au ligand. En comparant les motifs HDX entre le Nha lié à l’apo et au substrat, un motif récurrent de changement HDX a été observé dans plusieurs hélices, où une augmentation de l’absorption de deutérium à une extrémité s’accompagnait d’une diminution de l’absorption de deutérium à l’autre extrémité. L’absorption au milieu des hélices était en grande partie inchangée.

Sur la base du modèle observé de changement HDX, bien que ne fournissant pas directement d’informations spatiales, il a été suggéré que la translation des hélices transmembranaires par rapport à la membrane se produit, comme en témoignent les changements HDX réciproques observés pour les deux terminaisons au sein d’hélices transmembranaires spécifiques. Ce modèle est cohérent avec le mécanisme d’accès alternatif « en ascenseur », impliquant une translation verticale des hélices transmembranaires pendant le cycle de transport (Ryan et Vandenberg, 2016). En résumé, HDX-MS a fourni de nouvelles informations sur les transitions structurelles impliquées dans l’accès alternatif, inaccessibles par les structures précédemment résolues du NhaA inactif.

Effet des Interactions Protéines-Lipides sur les Paysages de conformation des Transporteurs

La plupart des transporteurs secondaires appartiennent à la superfamille majeure des facilitateurs (MFS), partageant une architecture conservée malgré leurs fonctions diverses (Radestock et Forrest, 2011). Bien que les structures cristallines des membres MFS soient disponibles, elles ont fourni peu d’informations sur les interactions protéines-lipides et leur effet sur l’équilibre entre les états OF et IF. Ainsi, Martens et al. simulations MD combinées avec HDX-MS pour étudier les effets de l’environnement lipidique sur trois transporteurs bien caractérisés: le transporteur de lactose perméase, le transporteur de xylose et l’antiporter de glycérol-3-phosphate (Martens et al., 2018).

Tout d’abord, une mutation connue pour déplacer l’équilibre vers le OF-state a été introduite au niveau du vestibule extracellulaire de tous les transporteurs (Kumar et al., 2014). La comparaison des transporteurs WT et mutés à l’aide de HDX-MS a révélé que la méthode détecte le changement conformationnel, les régions du vestibule extracellulaire prenant plus de deutérium chez les mutants par rapport au WT, alors que l’inverse se produit pour les résidus au vestibule intracellulaire. Ensuite, les transporteurs ont été reconstitués en nanodisques composés de phosphatidylglycérol, de tétraoleyl cardiolipine et de phosphatidylcholine ou de phosphatidyléthanolamine. Fait intéressant, la présence de phosphatidyléthanolamine a déplacé l’équilibre vers l’état IF. Par la suite, des simulations MD des transporteurs dans des bicouches lipidiques identiques à la composition des nanodisques ont prédit des interactions directes entre le groupe de tête de phosphatidyléthanolamine chargé et un réseau cytoplasmique conservé de résidus chargés, stabilisant l’état de (Doki et al., 2013). La mutation des résidus chargés a aboli l’effet de la phosphatidyléthanolamine, suggérant fortement que des interactions spécifiques phosphatidyléthanolamine-protéine contrôlent l’équilibre intrinsèque des transporteurs. Cette étude est un exemple frappant de combinaison de méthodes expérimentales et informatiques afin d’identifier des interactions protéines-lipides subtiles mais fonctionnellement significatives.

Déroulement de l’hélice Pendant le transport: Études sur le LeuT

Le LeuT est un homologue procaryote de la famille des symporteurs neurotransmetteurs/Na+ (NSS), qui comprend des cibles médicamenteuses importantes telles que les transporteurs de la sérotonine, de la dopamine et de la noradrénaline (Kristensen et al., 2011). LeuT a été largement étudié et ses structures cristallographiques le long du cycle de transport sont disponibles (Focke et al., 2013). Ces structures suggèrent que des réarrangements structurels à grande échelle sont nécessaires lors d’un accès alternatif (Krishnamurthy et Gouaux, 2012). Cependant, le paysage conformationnel permettant la transition entre le FI et les États reste insaisissable et controversé.

Pour étudier la transition entre les différents états, le LeuT solubilisé dans un détergent a été étudié dans des conditions favorables aux états IF ou OF (Merkle et al., 2018). Étonnamment, de nombreux peptides, principalement du côté intracellulaire du transporteur, présentaient une cinétique EX1. Ceci est plutôt inhabituel dans les protéines pliées dans des conditions natives et considéré comme reflétant un déploiement à longue durée de vie des éléments de structure secondaires. Sur la base de la distribution spatiale des peptides présentant une cinétique EX1, ainsi que des structures cristallographiques disponibles, il a été proposé que des hélices spécifiques subissent un déroulement partiel lors d’un accès alternatif et que ces changements conformationnels contribuent également à la libération du substrat. Cette étude met en évidence l’importance fonctionnelle des changements conformationnels lents (échelle de temps en secondes) qui peuvent être bien résolus en utilisant HDX-MS, contrairement à d’autres méthodes expérimentales ou informatiques (par exemple, MD).

Spectrométrie de masse d’échange Hydrogène-Deutérium des Protéines Membranaires dans les Nanodisques lipidiques

Les interactions des protéines membranaires avec les lipides environnants peuvent moduler considérablement leur fonction (Vadas et al., 2017). En effet, l’activité des membres eucaryotes du SSN dépend de manière significative d’interactions lipidiques-protéines spécifiques qui modulent la dynamique des protéines et par conséquent, les interactions du substrat (Divito et Amara, 2009). Par conséquent, Adhikary et al. LeuT étudié reconstitué en nanodisques bicouches de phospholipides (Adhikary et al., 2017). En utilisant cette approche, le LeuT a été étudié dans des conditions favorables au SI et AUX conformations. La comparaison des modèles HDX entre ces états a révélé des modifications spécifiques dans des régions précédemment impliquées dans le cycle de transport, reflétant des changements structurels significatifs sur le plan fonctionnel. Fait intéressant, les données HDX-MS, cohérentes avec les études biophysiques et informatiques précédentes, ont soutenu un angle d’inclinaison plus petit pour la première hélice transmembranaire dans la conformation IF par rapport à celui observé dans les structures cristallines. Cette différence a été attribuée à l’environnement lipidique, puisque la structure cristalline a été obtenue dans un détergent avec une quantité infime de lipides. Pour résumer, HDX-MS fournit une plate-forme flexible pour étudier les protéines membranaires dans différents environnements hydrophobes et dans des conditions qui favorisent des états conformationnels spécifiques, sans avoir besoin d’un étiquetage spécifique au site.

Interactions ioniques Avec plusieurs Sites : L’échangeur Na+/Ca2+

NCX participe à l’homéostasie cellulaire du Ca2+ en extrudant le Ca2+ des cellules contre son gradient électrochimique (Blaustein et Lederer, 1999). Échanges NCX 3Na +: 1Ca2+, où Na + et Ca2+ sont transportés par étapes distinctes (Khananshvili, 1990). De manière surprenante, la structure cristalline du NCX de Methanocaldococcus jannaschii (NCX_Mj) a révélé quatre sites de liaison ionique, occupés simultanément par trois ions Na+ sur des sites appelés Sint, Smid, Sext et un ion Ca2+ sur un site appelé SCa (Liao et al., 2012). Comme ce mode de liaison était incompatible avec les études précédentes, des simulations MD et des analyses de flux d’ions de mutants ont été effectuées, suggérant que les ions Na+ occupent Sint, SCa et Sext, alors que Ca2+ occupe SCa (Marinelli et al., 2014; Giladi et coll., 2016b; Giladi et coll., 2017; van Dijk et coll., 2018). Ainsi, les ions Na+ et Ca2+ sont liés de manière mutuellement exclusive le long du cycle de transport.

Pour établir expérimentalement l’affectation des sites de liaison ionique, nous avons comparé l’état apo avec les états liés aux ions de NCX_Mj en utilisant HDX-MS (Giladi et al., 2016a; Giladi et coll., 2017). Malgré une faible couverture de séquence, notre analyse a inclus 10 résidus de coordination ionique sur 12. Nous avons détecté une diminution de l’absorption de deutérium dépendante de Na+ à Sint, SCa et Sext, mais pas Smid, alors qu’en présence de Ca2+, la diminution de l’absorption de deutérium était principalement observée à SCa. Ceci est cohérent avec les prédictions faites par les simulations MD et les analyses mutationnelles prévoyant l’occupation de Smid par une molécule d’eau mais pas par Na+ ou Ca2+ à l’état fondamental (Marinelli et al., 2014; Giladi et coll., 2016a; Giladi et coll., 2017; van Dijk et coll., 2018). Notamment, des études cristallographiques ultérieures ont validé l’affectation de nos sites de liaison (Liao et al., 2016). Ainsi, HDX-MS a corroboré le mode de liaison ionique suggéré par les études informatiques et fonctionnelles.

Sélectivité ionique d’un mutant NCX transportant Li+

L’échangeur mitochondrial Na+/Ca2+ (NCLX) présente une sélectivité ionique exceptionnelle, échangeant Ca2+ avec Na+ ou Li+, alors que les NCX ne transportent pas Li+ (Palty et al., 2010). Bien que la pertinence physiologique de cette sélectivité ionique reste déroutante, il est à noter que 9 résidus de coordination ionique (sur 12) dans NCLX diffèrent de ceux dans NCXs et d’autres membres de la superfamille des antiporteurs Ca2+/cation. Pour comprendre comment ces différences affectent la reconnaissance et le transport de la liaison ionique, nous avons effectué un remplacement structural des résidus de coordination ionique dans NCX_Mj pour imiter les sites de liaison NCLX (Refaeli et al., 2016). De manière frappante, la construction nouvellement conçue (appelée NCLX_Mj) médiate Na+/ Ca2+ et Li+/Ca2+ avec des valeurs Km comparables (Refaeli et al., 2016).

Ensuite, nous avons cherché à déterminer si les sites de liaison ionique dans NCLX_Mj rappellent ceux de NCX_Mj (Giladi et al., 2019). Les analyses HDX-MS des changements conformationnels induits par les ions ont révélé que SCa lie Na+, Li+ ou Ca2+, alors qu’un ou plusieurs sites Na+/Li+ supplémentaires de NCLX_Mj sont incompatibles avec les sites Na+ originaux (Sext et Sint) attribués à NCX_Mj. Ces résultats suggèrent que NCLX_Mj peut transporter des ions avec une stoechiométrie électroneutrale de 2Na+: 1Ca2+ ou 2Li+: 1Ca2+. En accord avec les données HDX-MS, le serrage de tension accélère les taux de change Na+/ Ca2+ dans les protéoliposomes reconstitués par NCX_Mj (grâce à une stoechiométrie de 3Na+:1Ca2+), alors qu’elle n’a pas d’effet appréciable sur les taux de change Na+/Ca2+ ou Li+/Ca2+ dans NCLX_Mj (Giladi et al., 2019).

Nos études ont démontré l’utilité de HDX-MS pour identifier et valider les sites de liaison dans les transporteurs d’ions, où des différences relativement faibles dans les signaux ΔHDX induits par les ions fournissent des informations importantes sur la sélectivité des ions et les changements conformationnels se produisant lors de la liaison aux ions à des sites distincts. Ainsi, combiné aux simulations MD et à la cristallographie aux rayons X, le HDX-MS est particulièrement intéressant pour élucider les déterminants structurels de la sélectivité ionique et des changements conformationnels induits par les ions dans les systèmes de transport ionique comprenant de multiples sites de liaison ionique.

Conclusions

Au cours des dernières décennies, la biologie structurale a énormément contribué à notre compréhension de la fonction des protéines membranaires, principalement en fournissant des instantanés statiques d’états discrets en haute résolution. Pour déchiffrer pleinement les relations structure-fonction sous-jacentes au processus complexe du transport des solutés, un nombre croissant de méthodes expérimentales et informatiques ont été développées pour combler le fossé entre ces instantanés statiques et déterminer les paysages conformationnels sous-jacents. HDX-MS est de plus en plus utilisé pour étudier les protéines membranaires intactes dans diverses conditions quasi natives, offrant de nouvelles opportunités pour étudier les interactions membrane-protéine, la reconnaissance du substrat et les transitions conformationnelles liées au transport. Les développements futurs dans l’automatisation de l’instrumentation et de l’analyse des données pourraient permettre l’utilisation de HDX-MS à haut débit, exploitant pleinement son utilisation potentielle dans la recherche fondamentale et les applications biomédicales telles que la conception de médicaments.

Contributions des auteurs

MG et DK ont examiné la littérature et rédigé le manuscrit.

Financement

Ce travail a été soutenu par la Fondation Israélienne pour la Science (Subvention #1351/18) (D.K) et par la Fondation israélienne pour la Recherche sur le cancer (Subvention #19202) (MG). Le soutien financier du prix Shmuel Shalit à DK est remercié.

Conflit d’intérêts

Les auteurs déclarent que la recherche a été menée en l’absence de relations commerciales ou financières pouvant être interprétées comme un conflit d’intérêts potentiel.