A CD47 és HER2 kettős blokádja kiküszöböli a radiorezisztens emlőrákos sejteket

sejtvonalak

emberi emlőrák MCF-7, MDA-MB-231, BT474, BT549, SKBR3 sejtvonalak, glioblastoma U251 és vastagbélrák HCT116 sejtvonalakat vásároltak az ATCC-től. Az MCF-7, az MDA-MB-231, a BT474, a BT549 és az U251 sejteket 10% FBS-sel kiegészített DMEM táptalajban, az SKBR3 sejteket pedig 10% FBS-sel kiegészített RPMI-1640 táptalajban tartottuk fenn. A HCT116 sejteket McCoy 5a Táptalajában tartottuk fenn 10% FBS-sel. A radiorezisztens MCF7 / C6 és MDA-MB-231/C5 sejtvonalakat, amelyeket az mcf7 és MDA-MB-231 sejtek túlélő frakcióiból klónoztak ismételt besugárzás után; a HER2-overexpresszáló emlőrákos őssejteket (HER2+/CD44+/CD24−/alacsony BCSC-k) izoláltuk az MCF7/C626-ból. Az egér hármas negatív emlőrákos 4T1 sejtjeit DMEM táptalajban tartottuk fenn 10% FBS-sel. A humán monocita THP-1-et ATCC-formulájú RPMI-1640 táptalajban tenyésztettük, kiegészítve 10% FBS-sel, 15 mM HEPES-sel, 4,5 g/l glükózzal és 2-merkaptoetanollal, hogy a végső koncentráció 0,05 mM legyen. 7 sejtet tenyésztettünk DMEM táptalajban 10% FBS-sel az ATCC tenyésztési módszerrel. Az összes sejtvonalat negatív mycoplasma-szennyeződésnek teszteltük MycoSensor PCR Assay kit (Agilent Technologies, katalógus # 302108).

plazmidok és reagensek

CD47 promoter-kontrollált luciferáz vektort úgy állítottunk elő, hogy a humán CD47 promoter régiót (-1554 nt) pgl2-bázikus plazmiddá klónoztuk a Kpni / Hind III helyekről. A feltételezett NF-kB-kötő helyek (TGGAAGCT-764-757) törlését gyors mutációs készlettel (Stratagene, La Jolla, CA) végeztük. Az alkalmazott primer szekvenciák: 5 ′-GTGGTCGGGTACCTGCCCGCTCGCCCCTCGCGGGCTCTGCG-3′ (sense) and 5 ′-CGCAGAGCCCGCGAGGGGCGAGCGGGCAGGTACCCGACCAC-3′ (antisense).

pGL2-NF-κB-luc plasmid was constructed with the 3 NF-κB-binding sites: GTGGGTTCCC, TCGCCACTCCCC, and TGGAAAGTCCCC by blunt-end ligation. IMD-0354 (Catalog # I3159) and TNF-α (Catalog # T0157) were purchased from Sigma. The lentiCRISPR v2 vector was purchased from the Addgene plasmid repository (Catalog # 52961). Herceptin was obtained from the UC Davis Comprehensive Cancer Center Pharmacy as left-over medicine (Genentech, NDC 50242-132-01). A Lapatinib-et (katalógus # S1028) a Selleckchem-től vásárolták. Anti-CD47 (B6H12) antitest IHC, ICC, és western blot vásárolt Santa Cruz (katalógus # sc-12730). Az áramlási citometria Anti-CD47-FITC-jét a BD Biosciences-től vásárolták (katalógus # 556045). Anti-humán CD47 (B6H12) antitest fagocitózis vizsgálathoz kivontuk a B6H12.2 hybridomából (ATCC HB-9771). Anti-egér CD47 antitest in vivo tumor gátlás kivontuk MIAP301 hibridoma által biztosított Dr. William Frazier (Washington University School of Medicine). Anti-CD11b antitest IHC festéshez az Invitrogen-től vásárolták (katalógus # MA5-17857). A western blot elleni egér monoklonális anti-ons-tubulin antitestet a Sigma-Aldrich-től vásárolták (katalógus # T6074). A western blot elleni egér monoklonális anti-ons-aktin antitestet a Sigma-Aldrich-től vásárolták (katalógus # A5441). Anti-HER2/ERBB2 (katalógus # 29d8) antitest IHC festéshez és western blot-hoz a Cell Signaling Technology-tól vásárolták (katalógus # 2165). Az áramlási citometria elemzéséhez Anti-HER2-APC antitestet vásároltak BD Biosciences (katalógus # 340554).

Immunoblott

a sejtekből vagy tumorszövetekből származó fehérjéket RIPA lízis pufferben (Pierce) extraháltuk proteáz és foszfatáz inhibitor koktéllal (sejtjelzés) kiegészítve. A fehérje koncentrációját a BCA assay (Pierce) segítségével határoztuk meg. A lizátumokat ezután denaturáltuk, és a 30 db 6G fehérjét tartalmazó mintákat 10% SDS-poli-akrilamid gélben elektroforézisnek vetettük alá, majd ezt követően polivinilidén-difluorid membránokba (Bio-Rad) vittük át. 5% – os zsírmentes száraz tejjel történő blokkolás után a membránt az elsődleges antitestnek tették ki, és egy éjszakán át inkubáltuk 4 kB-os hőmérsékleten. A blotokat HRP-hez kapcsolt másodlagos antitestekkel (Sigma-Aldrich) és Amersham ECL western blot detektáló reagenssel (katalógus # RPN2106) történő inkubálással vizualizáltuk. A blot-okat Konica SRX101A fejlesztőn fejlesztették ki, és az ImageJ segítségével számszerűsítették.

áramlási citometriás analízis

az összegyűjtött sejteket PBS-ben 0,5% BSA-t tartalmazó PBS-sel öblítettük, a sejtpellet-eket fluoreszcenciával jelölt primer antitestekkel inkubáltuk 37cc-n 30 percig, majd háromszor 0,5% BSA / PBS-sel mossuk. Az összes antitestet titráltuk az állapot optimalizálása érdekében, mielőtt a kísérletre alkalmaznánk. Az áramlási citometriás elemzést a FACS Canto II citométer (BD), majd az ezt követő elemzést a FlowJo (Tree Star, Ashland, or, USA) szoftver segítségével végeztük. A kapuzási stratégiák FSC és SSC tulajdonságokon alapultak, és a fitc, APC csatornák pozitív sejtpopulációira lettek beállítva.

emberi emlőrákos szövetek

friss fagyasztott HER2 pozitív és negatív emlőrákos szöveteket az UC Davis Comprehensive Cancer Center Biorepozitory (IRB # 283665 és IRB # 218204) biztosított, amelyet az UC Davis Comprehensive Cancer Center Support Grant (CCSG) finanszírozott, amelyet a Nemzeti Rák Intézet (NCI P30CA093373) ítélt oda, a diagnosztikai eredmények kivételével minden beteginformáció blokkolva. További humán emlőrák patológiai mintákat, beleértve a formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) párosított primer emlőrák és visszatérő emlőrákok festetlen 4-ft vastag részeit, az Ohio Állami Egyetem patológiai tanszékétől szerezték be IRB jóváhagyással (#2002h0089).

immunhisztokémia (IHC)

immunhisztokémiai festést végeztünk 4-6-mm vastag FFPE szövetszakaszokon. Röviden, a diákat deparaffinizáltuk és rehidratáltuk, és az antigéneket 40 percig egy citrát pufferben (pH 6,1) nyertük 95cc-on. Az endogén peroxidáz aktivitást 3% – os H2O2 oldattal blokkoltuk. Az elsődleges antitest inkubációt 4CC-n végeztük egy éjszakán át, majd a vectastain ABC Kit (Vector Laboratories) RT-n 30 percig a gyártó utasításai szerint. A reakciótermékeket peroxidáz szubsztrát Kit alkalmazásával detektáltuk, majd hematoxilinnel (Vektor laboratóriumok) ellenfestettük. Két vezető patológus volt felelős a klinikai emlőrák diagnosztizálásáért és a kísérleti daganatok értékeléséért. A CD47 expressziót mind a festési intenzitás, mind a festett sejtek százalékos arányának felhasználásával értékeltük. A festési intenzitást 0: negatív; 1: gyenge; 2: mérsékelt; 3: erős. A magas expressziót erős festési intenzitásként határoztuk meg a tumorsejtek több mint 25% – ában; a közepes expresszió mérsékelt festési intenzitás volt a tumorsejtek több mint 25% – ában; az alacsony expresszió gyenge festési intenzitás volt a tumorsejtek több mint 25%-ában, vagy mérsékelt festés <a tumorsejtek 25% – ában az ASCO-CAP iránymutatásokat63 használtuk a HER2 immunhisztokémia (IHC) értelmezéséhez, és a HER2 fehérje expresszióját negatív IHC 0-ként (nincs hiányos festés vagy membránfestés, amely halvány/alig érzékelhető, és az invazív tumorsejtek 10% – án belül) vagy negatív IHC 1+ – ként (hiányos)értékeltük halvány/alig észrevehető membránfestés >az invazív tumorsejtek 10% – án belül); egyértelmű IHC 2+ (kerületi membránfestés, amely hiányos és/vagy gyenge/közepes, és az invazív tumorsejtek >10% – án belül; és vagy teljes és kerületi membránfestés, amely intenzív és az invazív tumorsejtek 10% – án belül); pozitív IHC 3+ (kerületi membránfestés, amely teljes, intenzív az invazív tumorsejtek több mint 10% – ában). Ha az eredmények kétértelműek voltak (2+), reflex tesztet végeztünk in situ hibridizációval (ISH). Az in vivo besugárzott tumorok CD47 expressziójának kimutatásakor a kezelt egér tumorokat eltávolítottuk és 4% paraformaldehidben rögzítettük PBS-ben 24 órán keresztül. a mintákat sorozatos etanollal (70%, 95% és 100%) dehidratáltuk 48 órán keresztül, mielőtt a paraffin oldatba ágyaztuk (Polysciences).

Immuncitokémia (ICC)

a sejteket kerek fedőlapokon vetettük be, és 60-80%-os összefolyásig növesztettük, majd PBS-sel öblítettük, 4% paraformaldehidben (pH 7,2) rögzítettük, és PBS-ben 0,1% Triton X-100-mal permeabilizáltuk. A sejteket ezután blokkoló oldatban inkubáltuk 15 percig, mielőtt az elsődleges antitesttel egy éjszakán át inkubáltuk 4 kb 1: 250 hígítással. A sejteket TR – vagy FITC-konjugált szekunder antitestekkel inkubáltuk 1: 1000 arányban a blokkoló oldatban 1 órán át szobahőmérsékleten sötétben, majd konfokális mikroszkóppal elemeztük.

a sugárzással összefüggő antigénfehérjék azonosítása

C57/B6 egeret immunizáló gazdaszervezetként használtunk, 5 db 106 db mcf7 / C6 sejttel a 0-ban.Egérenként 1 ml térfogatot injektáltak a farok vagy a lábtartó tövébe,majd a 14. napon ugyanolyan mennyiségű sejttel növelték. A második kihívást követő 5. -7. napon az egereket eutanizálták, és a szérumot összegyűjtötték a radiorezisztens BC sejtekben expresszált antigénmolekulák kimutatására. Annak érdekében, hogy megkülönböztessük a RAAPs-ot a normál emlő hámsejtjeiben és a vad típusú MCF7 sejtekben expresszált nem specifikus molekuláktól, a nyers szérummal előtisztítási eljárást hajtottunk végre a következő lépésekkel. Kétmillió emberi normál emlő epithelialis MCF10A sejtet állítottunk elő 1 mm EDTA/PBS-t tartalmazó oldatban tripszin nélkül, hogy elkerüljük az érzékeny fehérjék egy részének emésztését, majd kétszer öblítsük le PBS-sel. A sejteket pelletáltuk, majd meglazítottuk a cső aljának megérintésével, majd 1 ml egér anti-szérumot adtunk hozzá, és forgattuk 4 6CC-n 2 órán át. az elegyet ezután 9391 g-n centrifugáltuk 5 percig 4 c-n, majd a felülúszókat összegyűjtöttük, amelyet egyszer megismételtünk. Az első megtisztított antiszérumot vad típusú MCF7 sejtekkel történő inkubálással tovább tisztítottuk ugyanazokkal az eljárásokkal, és hatszor megismételtük. A végső tisztított antiszérumot ezután western blot tesztelte az MCF10A sejtek, az MCF7 sejtek, az MCF7/C6 és az RD-BCSC sejtek fehérje lizátumával szemben, amelyeket emlőrák őssejtek markerei HER2+/CD44+/ CD24− valamint aldehid-dehidrogenáz (ALDH)64. A cd47-et és a HER2-t a radiorezisztens BC sejtekben lévő más Raap-okkal együtt western blot-okkal vagy Rd-BCSC sejtekből tisztított membránfehérjék immunprecipitációjával azonosítottuk, és az eluált frakciókat LC/MS-en keresztül elemeztük.

a HER2 és CD47 CRISPR szerkesztése

az sgrns-eket a Dr. Zhang Lab CRISPR tervezőszoftverének (http://crispr.mit.edu) és az előző kiadványban leírt protokollnak megfelelően tervezték65. Az emberi sgrns-eknek megfelelő négy Oligót szintetizáltak és klónoztak lentiCRISPR v2 vektorba a Zhang Lab Gecko pooled library amplifikációs protokollt követve. A nem specifikus célzás lehetőségének minimalizálása érdekében minden egyes célzó génből három sgrns oligót szintetizáltak és teszteltek. A western blot által meghatározott legjobb kiütési hatékonyságú sgRNA-t választották a későbbi kísérletekhez. Az sgrns szekvenciákat humán és egér sejtekben a következőképpen használtuk:

hHer2gRNA_F: CACCGCGGCACAGACAGTGCGCGGTC

hHer2gRNA_R: AAACGACGCGCACTGT CTGTGCCGC

hCD47gRNA_F: CACCGTAAATATAGATCCGGTGGTA

hCD47gRNA_R: AAACTACCAC CGGATCTATATTTAC

mHer2gRNA_ F: CACCGTGATGGCCCTCGCCCCTCGG

mHer2gRNA_ R: AAACCCGAGGGGCGAGGGCCATCAC

mCD47gRNA_F: CACCGCCCTTGCATCGTCCGTAATG

mCD47gRNA_R: AAACCATTACGGACGATGCAAGGGC

The lentiviral particles were generated using 293T cells following the protocol from Addgene. For gene editing, the isolated BCSC sphere cells or MCF7/C6 cells were trypsinized into single cells and plated 1. 2.5 × 105 cells/0.5 ml per well in the 12-well plates. 12 órán át tartó inkubálás után 1 ml vírustartalmú felülúszót 8 ng polibrénnel adtunk a sejtekhez, majd 6 órán át inkubáltuk. ezután 0,5 ml további, 10% hő-inaktivált FBS-t tartalmazó rendszeres táptalajt adtunk hozzá, majd egy éjszakán át tovább tenyésztettük. A fertőzési táptalajt 2 ml friss táptalajra cseréltük 10% FBS-sel, és 72 órán át tenyésztettük. a sejteket 60 mm-es szövettenyészeti edényekbe passzíroztuk, és 0,3 Ft/ml Puromizinben tenyésztéssel választottuk ki 1 héten keresztül, és a megcélzott gén kiesését immunoblottolással igazoltuk.

luciferáz vizsgálat

a sejteket pgl2-bázikus-CD47 vagy pGL2-bázikus-CD47-MNF-kB vagy pGL2-NF-kB luciferáz riporterekkel transzfektáltuk, és a luciferáz aktivitást Luminométerrel (Promega, Madison, WI) mértük. A reporter transzfekciós hatékonyságának normalizálása érdekében a lizátumok teljes fehérjekoncentrációját a BCA Protein Assay kit (Pierce, Rockford, IL) segítségével mértük, standardként a BSA-val.

kromatin immunprecipitációs (ChIP) vizsgálat

a sejteket formaldehiddel (1% final) 10 percen át térhálósítottuk, jéghideg PBS-sel mossuk, és SDS lízis pufferben gyűjtöttük össze (1% SDS, 10 mM EDTA, 50 mM Tris, pH 8. 1). A kromatint szonikációval nyírtuk, előzetesen g fehérje konjugált agaróz gyöngyökkel tisztítottuk, és anti-p65, anti-c-Rel vagy normál IgG-vel inkubáltuk 4 C éjszakán át. Miután a protein G-T 2 órán át adtuk 4 6CC-nél, a komplexet egymás után mostuk alacsony és magas sótartalmú immunkomplex mosópufferekkel (0. 1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris-HCl pH 8.1 plusz 150 mM NaCl alacsony sótartalmú pufferekhez és 500 mM NaCl magas sótartalmú pufferekhez), majd TE puffer (kétszer). A DNS-transzkripciós faktor kölcsönhatás a NaCl hozzáadása és az egyik napról a másikra történő inkubálás után 65cc-on megfordult. Az RNáz A és a proteináz K lebontása után a DNS-fragmenseket fenol/kloroform extrakcióval és etanol kicsapással tisztítottuk. A DNS-eket megtisztítottuk és PCR-hez használtuk az NF-kB-kötőhelyeket magában foglaló gén promoter régióra specifikus primerekkel. A CD47 alapozók a következők voltak:

5′-CGTGGACCAGGACACCTAGG-3′ (sense)

5′-AGGGAAGAGAACCGCATAGG-3′ (antisense)

The PCR amplification of the IκB promoter region (1134/902) was also included as positive. The primers for NF-κB-binding site in the IκB promoter were:

5′-TGTAGCACCCATTAGAAACACTTC-3′ (sense)

5′-TTCTTGTTCACTGACTTCCCAAT-3′ (antisense).

Preparation of anti-human and anti-mouse CD47 antibodies

Hybridoma for monoclonal mouse anti-human CD47 antibody (B6H12.2), IgG2b were obtained from ATCC. Monoklonális patkány anti-egér CD47 IgG2a antitest (miap301) és hybridoma nyerték Dr. William Frazier (Washington University School of Medicine). Mindkét hybridoma sejtvonalat imdm közegben tartottuk fenn 20% FBS-sel. Az antitesteket hybridoma felülúszóból tisztítottuk a genscript (katalógus # L00209) protein G gyanta felhasználásával, a gyártási standard eljárásokat követve. A mintákat ezután tovább koncentráltuk 10-20-szor a Pall Life Sciences Mikroszep centrifugális eszközeivel. A tisztított IgG koncentrációját az abszorbancia OD280-nál történő mérésével határoztuk meg.

fagocitózis vizsgálat

mind a humán monocyta THP1 sejteket, mind az egér M ++ Raw 264,7 sejtjeit (ATCC, TIB-71) egy 5% – os CO2 inkubátorban tartottuk fenn 37 ca66-on, közelítő sűrűségüknél 1 KB 106 / ml. Körülbelül 0,8 606 sejt / ml nyers 264,5 sejtet vagy 1 106 6 thp1 sejtet vetettünk be egy 6 lyukú lemezre. 24 óra inkubálás után a nyers 264,7 sejtet aktiváltuk 0,1 6G/ml lipopoliszacharid (LPS) kezelésével 24 órán keresztül. a monocita THP1 sejtek differenciálódtak a Phorbol 12-mirisztát 13-acetát (PMA) (40 nM) 48 órán keresztül. Az aktivált makrofágokat Dio-val festettük 40 nM-es végső koncerten közegben 20 percig, majd háromszor öblítettük közeggel. A rákos sejteket 1 db ddao-val (5 mM-es törzsoldat DMSO-ban -20 ~ C-nél tárolva) jelöltük PBS-ben 37 ~ C-nél 15 percig, majd 1% FBS-t tartalmazó PBS-sel mostuk. DDAO-jelölt célsejteket (1 db 106) adtunk a DIO-festett M-hez, és 2 ml-es végső térfogatban inkubáltuk 37 db-os 2 órán át. az inkubációt követően az M-es és a célsejteket háromszor EDTA-PBS mosással, majd 0,25% – os tripszinizációval gyűjtöttük be. A fagocitózist a kettős jelölésű sejtek (DIO+/DDAO+) értékelésével értékeltük, amely a fagocitizált emlőrákos sejteket Érett M-ekkel képviseli, áramlási citometriával. Az elemzéshez a FlowJo szoftvert használták.

Klonogén túlélési próba

a Klonogén túlélési vizsgálatot kezeléssel vagy anélkül végzett sugárzást követően végeztük (Lapatinib, 10 6/m per 72 óra; anti-CD47 antitest 10 mg / ml egy éjszakán át). A kezelt sejteket 10-14 napig tenyésztettük, majd a kolóniákat rögzítettük, coomassie kék folttal festettük. A több mint 50 sejtet tartalmazó kolóniákat túlélő klónoknak számítottuk, és az egyes színlelt tumorsejtek bevonási hatékonyságára normalizálódtak.

Gap-kitöltési sebesség assay

a Gap-kitöltési kapacitást 1-vel mértük 6-kútlemezek mindegyikében 100% – os összefolyásig növesztett sejtek, majd 24 h-sejt éhezés. Ezután a rést úgy hozták létre, hogy az edényt átlósan kaparják egy steril pipetta hegyével. A sejteket vagy kezeletlenül hagyták, vagy 10 db 6G/ml IgG-vel vagy anti-CD47 antitesttel kezelték a kísérlet időtartama alatt. A töltési kapacitást 72 órán keresztül monitoroztuk, és reprezentatív képeket készítettünk a 0.napon (a kaparás napján) és a 3. napon.

Tumorgömbképződés

a sejteket 40 db 6m-es sejtszűrővel szitáltuk (katalógus # 352340. Corning) és az egysejtű szuszpenziókat alacsony kötődésű 60 mm-es Petri-csészékbe vetettük 1000 sejt/ml sűrűséggel. A sejteket szérummentes emlő epitheliális bazális közegben (MEBM) tenyésztettük, kiegészítve B27-Tel (katalógus # 17504-044. Life Technology), 20 ng/ml EGF (katalógus # 4022-500. Bio-vision), 20 ng / ml alap-FGF (katalógus # 13256-029. Invitrogén), és 4 db (80603-686 EMD MILLIPORE katalógusszámú) heparin. A sejteket 10 napig tenyésztettük, és a tumorgömböket fénymikroszkóppal számoltuk.

Transzwellinváziós vizsgálat

Alikvotok (0. 4 ml) Matrigel (katalógus # 356231. BD Biosciences) hígítottuk bevonó pufferben: 0,01 M Tris (pH 8,0), 0,7% NaCl a végső koncentráció 200-300 Ft/ml. Körülbelül 100-at töltöttek be a felső kamrába 24-kút transwell (katalógus # 3422. Costar) és 37 6c-on keltetve körülbelül 1 óra gélesedésre. Óvatosan távolítsa el a maradék bevonatpuffert az áteresztő tartómembránról a réteg megzavarása nélkül, majd adjon hozzá cellákat (2,5 604/ml). Az alsó kamrát 800 db mem táptalajjal töltötték meg, amely 5 db/ml fibronektint tartalmazott (katalógusszám: SC-29011. Santa Cruz). A transzwellt eltérően kezelt sejtekkel 48 órán át inkubáltuk, és diff-Quick Stain kit-tel festettük (katalógus # K7128. IMEB INC).

F (ab’)2 fragmentum előállítása

CD47 F (ab’)2 fragmentumot állítottunk elő IgG papaingyanta hasításával egy F (ab’)2 előkészítő készlet segítségével (katalógus # 786272. G-Bioscience) a gyártó ajánlásainak és a bejelentett eljárásnak67 megfelelően. A papain emésztést követően a Fab fragmentumot elválasztottuk az emésztetlen IgG-től és az Fc régiótól a Protein a Spin oszloppal a Fab fragmentációs készletből a Spinout GT-600 sótalanító oszlopokat szállítottuk annak biztosítására, hogy a kezdeti antitest minta legyen a fab fragmentáció optimális feltétele, és a tisztított anti-egér CD47 IgG-t összegyűjtöttük az in vivo egér tumor kezelésére.

A BC sejtek sugárzása CRISPR-Ko CD47 és/vagy HER2

a daganatgátlás hatékonyságának in vivo vizsgálatához hiányos CD47 és HER2 státuszú sugárzás esetén 5 605 4T1/C2 sejtet ültettek be CRISPR-knockout CD47 (CD47−/−), HER2 (HER2−/−) vagy kettős (CD47−/−/HER2−/−) sejtekkel a BALB/c emlő zsírpárnáiba (N = 6 csoportonként). A Tumor növekedését úgy értékeltük, hogy a tumor térfogatát 2 naponta mérjük a 7. naptól kezdve, amíg a tumor térfogata el nem éri a korlátozást. A CD47 és HER2 különböző státuszú tumorok radioszenzitivitásának felmérése érdekében a helyi tumorsugárzást 5 Gy-vel szállították minden daganathoz a 9.napon, és a tumor növekedését minden második napon mértük, amíg a kontroll tumorok elérték a maximális korlátot.

RT egér BC anti-CD47 és/vagy HER2 kezelés

in vivo vizsgálatok tumor gátlás egyetlen CD47 antitest jelenlétében vagy hiányában sugárterápia, anti-CD47 kezelés követte a protokollt Willingham et al20 néhány módosítással. Nyolc hetes immun-Kompetens (BALB/c) nőstény egereket (Charles River Laboratories, Sacramento, USA) 1 605 db egér mell 4T1 sejtet injektáltunk a 4.emlőmirigybe. Ötven mikroliter PBS-t, amelyek 100 Ft-ot tartalmaznak kontroll IgG vagy anti-CD47 F (ab’) fragmentumokat injektáltunk a tumor helyére (1.nap) vagy a tumorszövetekbe (15. nap), és minden második napon megismételtük a kísérletek végéig. A Tumor térfogatát 5 naponta ellenőriztük. A sugárkezelés, anti-CD47, vagy a sugárzás kombinálva anti-CD47, az állatok hordozó 4T1 tumorok véletlenszerűen osztva különböző kezelési csoportok és a kontroll csoport (5-10 egerek csoportonként). A Tumor helyi sugárzása akkor kezdődött, amikor a tumor térfogata eléri a 200 mm3-t FIR-rel (5 Gy/nap/tumor négy frakcióhoz, mikrosugaras IR forrás felhasználásával; teljes dózis = 20 Gy) kombinálva háromszor anti-CD47 F (ab’) tumorinjekciókkal. Az in vivo besugárzott daganatok radioszenzitivitását anti-CD47 F (ab’) jelenlétével vagy hiányával a kísérletek végén a tumor térfogatának mérésével értékeltük. Az állatokat eutanizálták, amikor a daganatok ~1400 mm3 voltak, vagy amikor az állatok kényelmetlennek tűntek, még akkor is, ha a daganat kisebb volt, mint 1400 mm3, hogy megfeleljenek az UCD IACUC előírásainak a gerinces állatok kutatásában való felhasználására vonatkozóan. Az in vivo sugárterápia állathasználati és gondozási protokollját a kaliforniai Davis Egyetem intézményi Állathasználati és gondozási Bizottsága hagyta jóvá (IACUC 15315).

a cd47 és HER2 elleni kettős antitestekkel végzett in vivo tumorgátlási vizsgálatokhoz sugárterápia jelenlétében vagy hiányában nyolc hetes immun-Kompetens (BALB/c) nőstény egereket (Charles River Laboratories, Sacramento, USA) injektáltunk 1 db 105 db egér emlő 4T1 sejtjével a 4.emlőmirigybe. Amikor a tumor térfogata elérte a 200 mm-T3, az egereket véletlenszerűen négy csoportra osztottuk (csoportonként 6 egér). PBS, IgG, anti-CD47 F (ab’) fragmenseket (100 6G) vagy Herceptin-t (5 mg/kg) injektáltunk a tumorszövetekbe 4 órával a helyi sugárterápia előtt (5 Gy naponta 2 napig). Az injekciókat elvégezték, és a tumor méretét minden második napon megfigyelték a kísérletek végéig. Az egereket eutanizálták, amikor a daganatok ~1400 mm3 voltak, vagy amikor az állatok kényelmetlennek tűntek, még akkor is, ha a daganat kisebb volt, mint 1400 mm3, hogy megfeleljenek az UCD IACUC előírásainak a gerinces állatok kutatásában való felhasználására. Az in vivo sugárterápia állathasználati és gondozási protokollját a kaliforniai Davis Egyetem intézményi Állathasználati és gondozási Bizottsága hagyta jóvá (IACUC 15315).

Tumor infiltrált makrofágok és makrofág fagocitózis

GFP-expresszáló egér emlőrák 4T1 sejteket ültettek be a BALB / c egerek 4.emlő zsírpárnájába, és a kezelést akkor kezdték meg, amikor a tumorok körülbelül 200 mm3-t értek el 50 db 500 GB kontroll IgG-t, anti-CD47 F (ab’) fragmentumokat, Herceptin-t vagy mindkét antitestet tartalmazó tumor injekcióval minden második napon háromszor. A Tumor lokális RT-t a 10.és 11. napon, 5 Gy/nap/tumor mellett szállítottuk két frakcióra, a teljes dózis = 10 Gy, és a kísérleteket 2 nappal az antitestkezelés befejezése után fejeztük be. A daganatokat kivontuk, és FFPE szekciókat készítettünk immunfluoreszcencia festésre a szokásos eljárás szerint: a diákat depardiaffinizáltuk és rehidráltuk, az antigéneket pedig 40 percig nyertük citrát pufferben (pH 6,1) 95-nél C. a autofluoreszcencia eltávolításához a diákat de-autofluoreszcencia oldatban (0,5 M CuSO4, 0,05 m NH4COOH H2O-ban) RT-n 48 órán át, vízzel leöblítettük 5 perc 3-szor, majd 1:100 arányban blokkoltuk ló szérum. Az elsődleges antitest inkubációt 4CC-n végeztük egy éjszakán át: anti-GFP (1:100; Dako), anti-CD11b (1:100; Millipore); Mosás után a diákat inkubáltuk 1: 250 hígított fluoreszcens konjugált szekunder antitestekkel (rodamin CD11b-hez, Alexa Fluor 488 GFP-hez) RT-n 1 órán át, majd dapi-t tartalmazó Vectashield Antifade oldattal szereltük fel (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA). A makrofágok által közvetített fagocitózist fluoreszcens mikroszkóppal detektálták Axiovision szoftverrel (Zeiss, Németország), a mikrofotográfokat pedig az ImageJ segítségével számszerűsítették.

Statisztikai analízis

az in vitro celluláris vizsgálatokból és állatkísérletekből nyert összes kísérleti adatot átlagban (értem) mutatjuk be, két csoportban Kétfarkú Student t-teszttel, több csoportban pedig ANOVA-val elemezve. A Kaplan–Meier túlélési görbék statisztikai szignifikanciáját Mann-Whitney teszttel értékelték. A független kísérletek számát és az ismétléseket az ábra legendái jelezték. A < 0,05 p-értékeket szignifikánsnak tekintették, és csillagokkal jelölték a következők szerint: *P < 0.05, * * P < 0,01, ***P < 0,0001, ****P < 0,0001.

jelentés összefoglaló

a kutatási tervezéssel kapcsolatos további információk a cikkhez kapcsolódó Nature Research Reporting Summary-ban találhatók.