A Du-Huo-Ji-Sheng-Tang hatásmechanizmusai a porc lebomlásáról az Osteoarthritis Nyúlmodelljében

absztrakt

A Du-Huo-Ji-Sheng-Tang (DHJST) egy hagyományos kínai gyógynövény, amelyet osteoarthritis kezelésére használnak. Jelen tanulmányban a DHJST terápiás hatása a porc lebomlására az osteoarthritis nyúlmodelljében vizsgálták. A nyulak térdízületeiben elülső keresztszalag-transzekciót (ACLT) hajtottak végre kísérleti osteoarthritis kiváltására. A hatodik hét végén 30 aclt-vel rendelkező nyulat hat csoportra osztottak, kontrollcsoport, DHJST csoport és Oszaminetacin (OSA) csoport, amelyeket további 4 hétig követtek. Az ACLT-ben szenvedő nyulak másik három csoportját DHJST-vel vagy OSA-val kezelték, amelyeket 6 hét után áldoztak fel, és 6 hetes időpont-kontrollként szolgáltak. Az eredmények azt mutatták, hogy a műtét utáni hatodik hét végén szignifikánsan szövettani degeneráció volt a kontrollcsoportban a normál csoporthoz képest. A kontroll csoportban a szövettani degeneráció átlagos pontszáma tovább emelkedett a 10.héten, és a dhjst csoportban szignifikánsan alacsonyabb volt a szövettani degeneráció átlagos pontszáma a kontroll csoporthoz képest. A potenciális mechanizmus kutatásához a VEGF és a HIF-1 6 expressziós szintjét detektálták. A VEGF mRNS és a HIF-1 mRNS expressziója a normál csoportban alacsony, míg a kontroll csoportban az aktivitás fokozatosan növekszik. Ugyanakkor a DHJST-csoportban a VEGF és a HIF-1 aktivitás szignifikánsan csökkent az azonos időpontú modellcsoporthoz képest. Összefoglalva, a DHJST jelentős terápiás hatást fejt ki az osteoarthritis nyulakra, és a mechanizmusok a VEGF és a HIF-1 expresszió gátlásával kapcsolatosak.

1. Bevezetés

az Osteoarthritis (OA) egy progresszív és legyengítő betegség, amely évekbe telhet, amíg klinikailag megnyilvánul az érintett egyénekben. A porc öregedése és a kondrocita öregedése fontos szerepet játszik az OA patogenezisében és fejlődésében. Az OA kialakulása során gyakran fokális növekedés tapasztalható a sejthalálban. Számos jelentés kimutatta, hogy a chondrocyta öregedése hozzájárul a porc degeneráció kockázatához azáltal, hogy csökkenti a kondrociták azon képességét, hogy fenntartsák és javítsák az ízületi porcszövetet . Mivel elmélet szerint minden kondrocita felelős az azt körülvevő extracelluláris mátrix fenntartásáért, és hogy a szövet egyik régiójában előállított mátrixmolekulák nagyon korlátozottan képesek áthaladni a szöveten, az életképes sejtek fokális elvesztése részben felelős lehet A szövetekért, amelyek képtelenek helyrehozni a kisebb károkat .

jelenleg nincs gyógymód az OA-ra, és a rendelkezésre álló kezelések csak lassítják a betegség progresszióját . Az elmúlt 20 évben a hagyományos kínai orvoslás (TCM) jelentős előrelépést mutatott az OA ellen, például a betegek klinikai eredményeinek javításában, a gyulladásos reakciók gátlásában és a porc degenerációjában . In vivo és in vitro vizsgálat azt is kimutatta, hogy a kínai gyógynövények formula Több átfogó intézkedések ellen OA . Du-Huo-Ji-Sheng-Tang, amely áll Radix Angelicae Pubescentis, Herba Taxilli, Herba Taxilli, Radix Acanthopanacis Bidentatae, Herba Asari, Radix Gentianae Macrophyllae, Cortex Cinnamomi és Poria, már széles körben használják kezelésére OA. Javíthatja a klinikai tüneteket, a térd működését és a betegek életminőségét . A TCM-ben az OA patogenezisével kapcsolatos ismereteink alapján megvizsgáltuk a DHJST hatását az OA porc degenerációjának megelőzésére nyulakban, és megfigyeltük annak mechanizmusait.

2. Módszerek

2.1. Anyagok

a zsákutca kolorimetrikus apoptózis detektáló rendszert (TUNEL assay) a Nanjing Jiancheng biotechnológiai Társaságtól (Kína) szereztük be. A Trizol total RNS extrakciós készlet, a DNS molekuláris marker,a SYBR Premix EX TaqTM és a Perfect Real Time kit az Invitrogen Co. (USA). Gyógynövények DJST (tagjai Radix Angelicae Pubescentis, Herba Taxilli, Herba Taxilli, Radix Acanthopanacis Bidentatae, Herba Asari, Radix Gentianae Macrophyllae, Cortex Cinnamomi és Poria, által biztosított Shanghai Huayu Chinese Herbs Co. Kft., Kína) farmakognozista akkreditálta a szokásos protokollok szerint, amelyet a sanghaji hagyományos kínai orvoslás városi kórháza készített, az összetevőket a 2 : 1 : 1 : 1 : 0.2 : 1 : 0.3 : 1 (száraz tömeg), a gyógyszereket standard módszerekkel extrahálták a kínai Gyógyszerkönyv szerint (China Pharmacopoeia and Committee, 2000). Ezeket a nyers gyógyszereket desztillált vízben áztattuk, és kétszer 30 percig forraltuk, majd a gyógyszeroldatot egy hálón átszűrtük, majd a szűrletet 4 g mL−1-re koncentráltuk vákuumszivattyúval, majd -20 6CC-on tároltuk a felhasználásig. Oszaminetacin (OSA) tablettánként 25 mg indometacint és 75 mg aminoglükózt tartalmaz (a Hebei Jizhong Pharmaceutical Co. Kft., Kína), pozitív kontroll gyógyszerként használták.

2.2. Nyulak és szövetek előkészítése

negyvennyolc hónapos Új-zélandi fehér nyulakat szállított a kísérleti állatok központja a Kínai Tudományos Akadémiának. Harminc nyúl egyoldalú elülső keresztszalag-transzekción (ACLT) esett át általános érzéstelenítés alatt. A normál nyulakon nem végeztek eljárást.

a hatodik hét végén az ACLT-vel rendelkező 30 nyulat hat csoportra osztották, a kontrollcsoportra,a DHJST-csoportra és az OSA-csoportra, amelyeket további 4 hétig követtek. Az ACLT-ben szenvedő nyulak másik három csoportját DHJST-vel vagy OSA-val kezelték, amelyeket 6 hét után áldoztak fel, és 6 hetes időpont-kontrollként szolgáltak. A főzeteket orálisan adagoltuk dózisban 0.923 g (kg−1·d−1) 4 héten át, az OSA−csoportban lévő nyulaknak 0,09 g OSA−t (kg-1·d-1) adtak 4 héten keresztül, a modell kontrollcsoportot és a normál csoportot orálisan, azonos térfogatú fiziológiás sóoldattal adták be.

a nyulakat mintavétel céljából feláldozták. A protokollt a kínai sanghaji egyetemi orvosi központ állatkísérletekkel foglalkozó bizottsága hagyta jóvá. A nyúl tibiae-t eltávolították, és a sípcsont ízületi porcát azonnal tárolták -80 kb. A sípcsontot gondosan boncoltuk és eltávolítottuk a szomszédos izomból, majd azonnal 10% – os formalinban rögzítettük 24 órán keresztül. Ezt követően a Tibiae-t 4 héten át vízkőmentesítettük 100 g/L etilén-diamin-tetraecetsavban, PBS-ben mostuk, etanolsorozaton keresztül dehidratáltuk, és a megfelelő orientáció biztosítása érdekében szabványosított módon paraffinba ágyaztuk. A paraffinszövet szakaszokat (7 db) szabványosított módon vágtuk le. A szekciókat deparaffinizáltuk hisztokémiai elemzésekhez.

2.3. A porc szövettani vizsgálata

A Dhjst-csoportban, az OSA-csoportban és a kontroll-csoportban nyulak femorotibialis ízületein végzett szövettani vizsgálatot. A szakaszokat Safranin o-gyors zöld színnel festették. Ezeket a szövettani metszeteket az egyes helyekről egy módosított Mankin osztályozási rendszer (1.táblázat) két független, testület által tanúsított állatorvosi patológus értékelte.

2.4. TUNEL Assay

a H2O2 által indukált apoptózist a terminális deoxinukleotidedil-transzferáz által közvetített dUTP nick végcímkézés (TUNEL) vizsgálat Apo-DirectTM Kit (CalBiochem, San Diego, CA) alkalmazásával. A TUNELT a gyártó utasításai szerint végeztük. Röviden, Az előkezelések és a H2O2-nek való kitettség után a sejteket betakarítottuk, mostuk, rögzítettük, permeabilizáltuk és DNS-szálszakadásokra jelöltük, majd elemeztük egy Coulter Epics Elite flow citométeren (Beckman-Coulter, Miami, USA). Minden vizsgálatot három példányban végeztünk.

2, 5. Fluoreszcens kvantitatív PCR

A teljes RNS-t 50 mg porcból extraháltuk tibiae artikuláris trizol reagens alkalmazásával. A cDNS szintézist mintánként 4 ~ g teljes RNS-t használva, véletlenszerű primerekkel és reagensekkel végeztük, amelyeket a Revert Aid első szálú cDNS szintézis készlet tartalmaz. Minden mintából két mikro litert (2 ons) használtunk valós idejű PCR-hez egy Rotor-Gene 2000 rendszerben (Ausztrália). A relatív mennyiségi meghatározást a delta cycle threshold () relatív mennyiségi meghatározásával számítottuk ki. Meghatároztuk az endogén kontroll CAPDH mRNS küszöbciklusát () és a céljeleket, és a relatív RNS mennyiségi meghatározását összehasonlító módszerrel számítottuk ki, ahol a vaszkuláris endotheliális növekedési faktorhoz (VEGF) használt primerek

szekvenciái: 5′-TGCCCCCCCGGAGGTTCA-3(előre) és 5′-GGCCCTGGTGGTTTGAT-3(fordított) (termékhossz: 75 bp).A hipoxia-indukálható faktor-1 (HIF-1) esetén alkalmazott primerek szekvenciái: 5′-CAGTGCAAAAGACAGGTGGAAG-3(előre) és 5′-CCCTGTATGGTGGTGATGTTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGT-3(fordított) (termékhossz: 107 bp).A gapdh-hoz használt primerek szekvenciái: 5 ‘- CCGAGGGCCCACTAAAGG-3(előre) és 5’-GCTGTTGAAGTCACAGGAGACAA-3 (fordított) (termékhossz: 88 bp).

2.6. Statisztikai elemzés

az összes eredményt átlagban és szórásban (SD) fejeztük ki. A mérési adatokat a varianciák egyirányú elemzésével elemeztük (ANOVA, SPSS 11.0). A rangadatokat ridit segítségével elemeztük. A P < eredménye .A 05 statisztikailag szignifikánsnak tekinthető.

3. Eredmények

3.1. Nyulakban az ACLT által kiváltott szövettani degenerációt DHJST

csökkentette a reprezentatív szövettani szakaszok az 1. ábrán láthatók. A 10. hét végén megfigyeltük az ízületi felület normális integritását normál csoportban(1.ábra (a)). A kontroll csoportban, fokozott degenerációval, a Szafranin o-gyors zöld elszíneződése a középső és a mély zónákra kiterjedő hasadékképződést kísérő Szafranin o-gyors zöld elszíneződés veszett el (1(b) ábra), a DHJST csoportban pedig a korai enyhe fibrilláció, valamint a chondrocyta csoportosulás mellett a Szafranin o-gyors zöld elszíneződés elvesztése volt megfigyelhető (1(c) ábra). OSA csoport, a Szafranin o-gyors zöld festés elvesztésével ezek a változások hasonlóak voltak a DHJST csoporthoz(1 (d) ábra). A műtét utáni hatodik hét végén szignifikánsan szövettani különbségek voltak a kontrollcsoportban a normál csoporthoz képest (P < .01). A kontroll csoportban a Szafranin o-gyors zöld festés átlagos pontszáma tovább nőtt a 10 .héten a 6. héthez képest (P <.01) (2. ábra A) pontja). A 10. hétvégén szignifikáns különbségek voltak a Mankin pontszámban a kontroll csoport és a DHJST csoport között, szignifikánsan alacsonyabb volt a Safranin o-gyors zöld festés átlagos pontszáma a DHJST csoportban a kontroll csoporthoz képest (P < .01) (2. B) ábra), és nincs statisztikailag szignifikáns különbség a Mankin-pontszámban a DHJST-csoport és az OSA-csoport között (P >.05).

(a)

(b)

(c)

(d)

(a)
(b)
(c)
(d)

Figure 1

Histological examination of cartilage (Safranin O-fast green staining, ×100).

(a)

(b)

(c)

(d)

(a)
(b)
(c)
(d)

Figure 2

The influence of DHJST on histological parameters and apoptotic of chondrocytes. Az eredményeket az egyes oszlopokban (n = csoportonként 5) jelenti. * P <.01 szemben az osteoarthritis kontroll csoporttal a 6. héten, * * P < .01, összehasonlítva az osteoarthritis kontrollcsoportjával.

3.2. A DHJST gátolta a porcsejtek apoptózisát

a műtét utáni hatodik hét végén az apoptózis sejt indexe a kontrollcsoportban a normál csoporthoz képest szignifikáns különbségek voltak (P <.01). A kontroll csoportban az apoptózis sejt indexe továbbra is jelentősen megnőtt (a hatodik héten átlagosan 0,35 SD 0,13-ról 0,62 0,10-re a 10. héten; P < .01) (2. ábra c) pontja). A 10. hét végén a DHJST csoporthoz képest az apoptózis sejt indexe jelentősen megnő a kontrollcsoportban (P < .01) (2. ábra d) pontja). Az apoptózis sejtindexében nem volt szignifikáns különbség az OSA-csoport és a DHJST-csoport között (P>.05).

3.3. A VEGF és a HIF-1 expresszió gátlása a PORCSEJTEKBEN a DHJST terápiás hatásával függ össze

a fluoreszcens kvantitatív PCR azt mutatta, hogy a VEGF mRNS és a HIF-1 GmbH expressziója alacsony a normál csoportban; míg az aktivitás fokozatosan és jelentősen növekszik a kontroll csoportban a normál csoporthoz képest (P<.01); a kontrollcsoportban az ízületi kondrocitákban a HIF-1 a műtét utáni hatodik héten növekedni kezd, a 10. héten tovább növekszik a hatodik héthez képest (átlag = 64,21 SD = 20).12 a hatodik héten, és 160,35 62,27 a 10. héten; P < .05) (2. táblázat). A 10 .hétvégén a DHJST-csoportban a VEGF mRNS és a HIF-1 mRNS expressziója szignifikánsan csökkent a kontrollcsoporthoz képest a beadás után (P <.01). Bár az OSA-csoportban a VEGF mRNS és a HIF-1 mRNS szintje általában 4 hetes OSA-kezeléssel csökkent a kontrollcsoportéhoz képest, nem volt szignifikáns különbség (3.táblázat).

4. Vita

az ACLT modell az OA egyik legszélesebb körben használt kísérleti modellje. A nyúl ACLT-t egyre inkább használják az OA vizsgálatokban, mivel a betegség kialakulása gyors. A kísérleti ACLT modellek alkalmazása különösen klinikai jelentőséggel bír, mivel az ACL szakadása emberben fordul elő, és az OA kialakulásához is vezet. A tanulmány azt mutatja, hogy nagy mennyiségű kondrociták apoptózis létezik az OA progresszív stádiumában nyulakban, amelyeket műtét indukál. A kondrocita apoptózis az OA porc egyik jellegzetes változása. A kóros apoptózis káros stimuláció esetén kemotaxis vagy gyulladásos faktorok felszabadulását eredményezheti, ami viszont súlyosbítja a porc sérülését és aktiválja a fájdalmat . Ezért a kondrocita apoptózis gátlása fontos stratégia lehet a nyulak térdízületeinek degeneratív változásai ellen. A chondrocyták apoptosis indexe a DHJST csoportban jelentősen csökken a modellcsoportéhoz képest, ami arra utal, hogy a chondrocyta apoptosis gátlása lehet A DHJST egyik fontos mechanizmusa a degeneratív változások ellen.

korábbi tanulmányok kimutatták az ízületi kondrociták mikrokörnyezetének hipoxiás jellegét. Érdekes módon az osteoarthritikus ízületek tovább csökkentették az oxigénszintet, a hipoxia szerepét az OA patogenezise során . Egy nemrégiben készült tanulmány leírta, hogy az ízületi kondrocitákban a katabolikus és a hipoxiás stressz a HIF-1 transzkripciós faktor erős induktorai, amely a sejtek alacsony oxigénszinthez való alkalmazkodásának fő szabályozója. A HIF-1 kulcsfontosságú szerepet játszik a kondrociták túlélésében és növekedésében a porcfejlődés során, valamint az energiatermelésben és a kondrociták mátrixszintézisében egészséges és osteoarthritikus porcokban. Az osteoarthritikus porcban a HIF-1 fehérje szintje jelentősen megemelkedik, aktivitása korrelál a degeneratív porcváltozások súlyosságával . Jelen munka dokumentálja a HIF-1 transzkripciós faktor fontosságát a hipoxiás ízületi porc integritásának fenntartása szempontjából. A HIF-1 többlet szintje egybeesett az ízületi chondrocyták fokozott apoptózisával, és degeneratív változásokhoz vezetett a nyulak térdízületeiben. A DHJST beadását követően a HIF-1 A modellcsoporthoz képest csökken az expresszió. Az eredmények azt mutatják, hogy a DHJST hatása a kondrociták működésének szabályozására, a HIF-1 aktivitásának gátlásán keresztül.

érdekes, hogy a DHJST-csoport és az OSA-csoport között a VEGF és a HIF-1 közül a különböző expresszió jelentős a beadás után. Számos tanulmány kimutatta, hogy bizonyos nem szteroid gyulladáscsökkentő gyógyszerek, mint például az indometacin, gyulladásgátló hatásokat okoznak, függetlenül a HIF-1-től! tevékenység, mert az indometacin nem gátolta foszfatidilinozitol 3-kináz vagy extracelluláris szignálszabályozott kináz/mitogén-aktivált protein kináz út, valamint Erk aktivitás . Ezzel szemben az indometacin képes aktiválni a peroxiszóma proliferátor által aktivált receptort-a 6-ot, amely nem érzékeny a nátrium-szalicilátra vagy az aszpirinre. A foszfatidilinozitol-3-kináz vagy az Erk út gátlása a HIF-1 inhibitorával és az angiogén faktorokkal függ össze .

a hipoxia és a különböző növekedési faktorok / citokinek fokozzák a VEGF expressziót . A VEGF nemcsak az egyik legfontosabb angiogenezis tényező, hanem az OA gyulladásos folyamataiban is részt vesz , és hozzájárul az olyan tünetekhez, mint a fájdalom és a duzzanat a szinoviális membránok megcélzásával, a krónikus gyulladásos válaszok gyakran társulnak az érrendszer proliferációját indukáló angiogén tényezők termelésével, és a rheumatoid arthritisben a VEGF erősen expresszálódik a szinoviális sejtekben . Mivel a mechanikai túlterhelés az OA egyik okozati tényezője, megvizsgáltuk annak hatását a VEGF expresszióra a nyúl porcán, hogy a VEGF expressziója csökken a DHJST beadása után, az eredmény azt jelzi, hogy a DHJST megvédheti az ízületi porcot a VEGF expresszió elnyomásával kondrocitákban (3.ábra).

3.ábra

A DHJST feltételezett védőmechanizmusai a porc lebomlására.

5. Következtetések

eddig a DHJST bioaktív összetevői ismeretlenek, de tanulmányunk azt mutatja, hogy a DHJST jelentős terápiás hatást fejt ki az OA-ra nyulakban, a kondrociták apoptózisának gátlásának mechanizmusai révén, valamint a VEGF, HIF-1) expressziójának szabályozása a kondrocitákban. Ez tudományos bizonyítékot szolgáltat a klinika számára a DHJST alkalmazására az OA kezelésében.

finanszírozás

A sanghaji Természettudományi Alapítvány (Támogatás száma: 08jc1418800).