- A POU5F1 és SOX2 fokozó interaktómák azonosítása
- a POU5F1 és SOX2 fokozók interaktómái átfedésben vannak a korai DNS replikációs doménekkel, de nem heterokromatikus régiókkal
- az enhancer interaktómák szomszédosak a transzkripciós kezdő helyekkel, és aktív epigenetikai tulajdonságokkal rendelkeznek
- a pou5f1 és SOX2 enhancer kölcsönhatásban lévő gének transzkripciós státusza
- A Pou5f1 fokozóhoz kapcsolódó disztális gének részt vesznek a pluripotencia szabályozó áramkörében
- számos transzkripciós faktor kötő hely dúsul POU5F1 és SOX2 fokozó interaktómákban
- a RAD21 potenciálisan komplexben van más transzkripciós faktorokkal , hogy közvetítse az enhancer interaktómákat
A POU5F1 és SOX2 fokozó interaktómák azonosítása
a feltételezett pou5f1 és SOX2 fokozó régiók evolúciósan konzerváltak a gerincesek között (44 faj), aktív fokozó aláírásokkal, amelyeket epigenetikai jelek, például p300 hiszton határoznak meg acetiltranszferáz és H3K27AC, de nem h3k27me3 a Hescs7 ( kiegészítő ábra. 1A). A 4C technikát alkalmaztuk a pou5f1 és SOX2 “csali” feltételezett fokozóinak kölcsönhatásban lévő partnereinek azonosítására a pluripotens H9 sejtvonalban. Röviden, a sejteket a keresztkötésű kromoszómákhoz rögzítették a közelségben. A kromoszómákat ezután szonikációval fragmentálták. A kölcsönhatásban lévő kromatin fragmenseket ligáltuk, és a DNS-darabokat megtisztítottuk. A “csalival” kölcsönhatásban lévő genomi régiókat ezután beágyazott PCR-rel erősítettük (kiegészítő ábra. 1b, kiegészítő táblázat 1). Inverz PCR primereket terveztünk a pou5f1 és SOX2 gének feltételezett fokozóinak megcélzására. A felépített 4C könyvtár DNS-elektroforézissel vizualizálható, míg a ligálás nélküli kontroll szinte semmilyen PCR-terméket nem mutatott (kiegészítő ábra. 1B), jelezve, hogy a 4C könyvtárat ligációs termékekből erősítették.
következő generációs DNS-szekvenálást végeztünk Illumina HiSeq szekvenszer segítségével, és az azonosított 4C kölcsönhatásokat proximális vagy disztális kölcsönhatásként osztályoztuk (lásd módszerek). A disztális kölcsönhatások közé tartoznak az inter – kromoszóma kölcsönhatások és az intra-kromoszóma kölcsönhatások 20 kb-nál nagyobb genomi távolságokon, míg a proximális kölcsönhatások a 300 bp és 20 kb közötti genomi távolságokkal rendelkező intra-kromoszóma régiókat fedik le. A 3C–alapú vizsgálatok eredményeivel összhangban disztális interakciónk az összes interakciónak csak kis részét teszi ki, nagyjából 10% ~ 20% a 4C könyvtárak esetében ( 2.Kiegészítő táblázat). Két különböző H9 cellacsomagot használtunk a 4C könyvtárak létrehozásához a POU5F1 és a SOX2 számára függetlenül a következő generációs szekvenáláshoz. A POU5F1 és SOX2 disztális kölcsönhatások két replikációja 35% – kal, illetve 25% – kal fedi egymást. Ez összhangban van az egér ES sejtjeiben a ctcf által közvetített kromatin interaktómák biológiai replikációiban megfigyelt mérsékelt átfedéssel27, és tükrözheti az enhancer kölcsönhatások sokféleségét és dinamikáját, a ligálás hatékonyságát, a PCR amplifikáció összetettségét, valamint a szekvenálási mélységet. A valószínűleg sztochasztikus hatásokból eredő kölcsönhatások kiszűrésére hamis felfedezési Arány (FDR) alapú statisztikai modellt használtunk a dúsított kölcsönhatásban lévő domének azonosítására az egész genomban. Tovább egyesítettük azokat a dúsított kölcsönhatásban lévő doméneket, amelyek átfedik a biológiai replikációkat, mint nagy megbízhatóságú gyakori kölcsönhatásban lévő doméneket. Összesen 23, illetve 9 nagy megbízhatóságú, gyakran kölcsönhatásban lévő domént azonosítottak a POU5F1, illetve a SOX2 interaktómákra vonatkozóan (1.ábra , 3., 4. Kiegészítő táblázat), és ezek többsége kromoszóma közötti kölcsönhatás, amely génben gazdag régiókat foglal magában, hasonlóan az e4C eredményekhez20.
a disztális kölcsönhatások Circos térképeit a Circos szoftver52 segítségével mutatjuk be.
a kék külső gyűrű a génsűrűség profilját képviseli.
a POU5F1 és SOX2 fokozók interaktómái átfedésben vannak a korai DNS replikációs doménekkel, de nem heterokromatikus régiókkal
ezután megvizsgáltuk, hogy a pou5f1 és SOX2 fokozó kölcsönhatásban lévő doméneknek (1 Mb-tól 4 Mb-ig terjedő Méret, 3., 4. táblázat ) vannak-e egyedi epigenetikai jellemzőik. Mint Ryba et al. 28, a DNS replikáció időzítése korrelál a kromatin térbeli közelségével a Hi-C analízissel mérve, ami arra utal, hogy a korai és késői DNS replikáció a térben elkülönülő rekeszekben fordul elő a magban. Megfigyeltük, hogy a POU5F1 és SOX2 génlókuszok a hesc-k korai DNS-replikációs doménjein belül vannak, és azon tűnődtünk, vajon a kölcsönhatásban lévő doménjeik hasonló DNS-replikációs időzítéssel rendelkeznek-e. Amint az a 2a. ábrán látható, a pou5f1 és SOX2 fokozó kölcsönhatásban lévő domének főként átfedésben vannak a korai DNS replikációs doménekkel a hesc-kben. A vizsgált replikációs időzítési értékek eloszlása az azonosított POU5F1 és SOX2 enhancer-interacting helyeket körülvevő genomi régiókban (50 kb-os tartomány) elmozdulást mutat a pozitív értékek felé a genomszintű tömbértékekhez képest (P < 2.2 db 10-16-os számú, páratlan Wilcoxon-féle rang-sum próbával; 2b. ábra). Ez a megfigyelés egy érdekes epigenetikai tulajdonságot tárt fel, hogy a pou5f1 és SOX2 erősítőket körülvevő magasabb rendű struktúrák szinkronizált DNS-replikációs időzítéssel rendelkeznek. Mivel a korai DNS replikációs domének kapcsolódtak az aktív gén transzkripcióhoz a hESCs28-ban, valószínű, hogy a POU5F1 és SOX2 fokozók kölcsönhatásai az azonosított disztális régiókkal funkcionális jelentőséggel bírnak. Ez a megfigyelés összhangban van azzal, amit az egér ES sejtjeiben a POU5F1 enhancer interactome-ban láttunk (az adatok nem jelennek meg). A 2A. ábrán is látható, hogy a pou5f1 és a SOX2 kölcsönhatásban lévő domének nem fedik át a heterokromatikus régiókat, amelyek erős H3K9me3 jelekkel vannak jelölve a hESCs29-ben, ami arra utal, hogy az interaktómák a génszabályozás szempontjából a genom aktív részén belül vannak. Ezenkívül potenciális kapcsolatot tártunk fel az emberi kromoszómák nukleáris lamina-asszociált doménjeivel (LADs) 30, de nem figyeltünk meg semmilyen kapcsolatot, valószínűleg annak a ténynek köszönhetően, hogy a legényeket emberi fibroblasztokban határozták meg.
az interaktómák kapcsolata a DNS replikációs doménekkel és a heterokromatikus régiókkal.
a gyakori kölcsönhatásban lévő tartományokon belüli interakciós helyek a (2a) pontban kerülnek bemutatásra (csak a Chr1 és a Chr2 látható). (2b), a DNS-replikáció időzítésének (RT) tömbértékeinek eloszlásának összehasonlítása a kölcsönhatásban lévő helyek 50 kb-ján belüli régiók számára a teljes genomra.
az enhancer interaktómák szomszédosak a transzkripciós kezdő helyekkel, és aktív epigenetikai tulajdonságokkal rendelkeznek
a pou5f1 és SOX2 enhancer interaktómák és a jegyzetekkel ellátott génhelyekkel való összefüggésének feltárásához elemeztük az enhancer kölcsönhatásban lévő helyek genomi távolságának eloszlását a legközelebbi géntranszkripciós kezdő hely (TSS) között ( ábra 3a ). Mind a POU5F1, mind a SOX2 enhancer–interakciós helyek kernelsűrűségi diagramjai egyértelműen éles csúcsot mutatnak a TSS középpontjában. A teljes genomban véletlenszerűen szimulált helyek eloszlási csúcsához képest a fokozó interaktómákban megfigyelt csúcsok szignifikánsan magasabbak a TSS körüli keskeny ablakon belül (P = 0,0018, P = 0,0047, Kolmogorov-Smirnov teszt). A TSS körüli kölcsönhatásban lévő helyek dúsítása azt sugallja, hogy a POU5F1 és a SOX2 fokozók inkább a géneket tartalmazó genomiális régiókkal lépnek kölcsönhatásba. Tovább vizsgáltuk a POU5F1 és SOX2 enhancer-interacting helyek eloszlását különböző genomiális régiókban31. A 3B. ábrán látható , hogy a gén promoter szekvenciák az egyik dúsított régió mind a POU5F1, mind a SOX2 fokozó interaktómák számára. Ezenkívül a disztális intergenikus régiók frakciója következetesen csökken a két interaktom esetében. Ezért megfigyelésünk azt sugallja, hogy az aktív fokozókat körülvevő magasabb rendű kromoszóma szerkezet közvetlenül részt vehet a génszabályozásban. Azt is megjegyezték, hogy amikor a korai DNS-replikációs területeken véletlenszerű helyeket választanak ki (lásd a részleteket) a TÁVOLSÁGELOSZLÁS összehasonlítására a TSS-hez, a POU5F1 és a SOX2 interaktómák még gazdagabbak a TSS körül, bár statisztikailag nem szignifikánsak (P = 0,390,1 P = 0,2098, Kolmogorov-Smirnov teszt, kiegészítő ábra. 2 ).
(a) Kernelsűrűség becslése genomi távolság a kölcsönhatásban lévő helyek a legközelebbi TSS helyek. A távolságokat HOMER szoftver segítségével számítottuk ki34. A teljes genom 100 000 véletlenszerű helyének sűrűségtérképei szintén szerepelnek. B) az interaktómák dúsítási elemzése a különböző genikai régiókban. Az eloszlás elemzését a KEMR szoftverével végeztük31.
a Hisztonmódosítás ismert, hogy részt vesz a transzkripciós szabályozásban a kompakt kromatin struktúrák dekondenzálásával a transzkripciós faktorkötéshez. A 3C–alapú, az egész genomra kiterjedő interaktómás vizsgálatok aktív és inaktív kromatin-rekeszeket azonosítottak a sejtmagban, olyan aktív rekeszekkel, amelyek hisztonjelekkel dúsítottak, amelyek aktiválják a gén transzkripcióját, mint például a H3K9ac32. Ezért megkérdeztük, hogy a POU5F1 és a SOX2 aktív fokozói szelektíven kölcsönhatásba lépnek-e az aktív gén transzkripciót mutató disztális régiókkal. A h3k27me3, H3K4me1, H3K4me2, H3K27ac, H3K9ac, H4K20me1 és H3K36me3 ChIP-Seq tag profiljait a H1 ES sejtvonalban33 használtuk az interaktomokhoz kapcsolódó hiszton minták elemzéséhez. A chip-Seq címkéket az enhancer interakciós helyek körül megszámolták és normalizálták34 és boxplotként jelenítették meg. Mint megjegyeztük, a POU5F1 és a SOX2 interaktómák nagyobb intenzitású h3k4me1, H3K4me2 és H4K20me1 profilokkal rendelkeznek, amelyek a gén aktív szabályozásának jelei ( 4a ábra ). A korai DNS replikációs területek véletlenszerű helyeivel összehasonlítva a vizsgált hisztonjelek általában dúsabbak a POU5F1 interaktómában, mint a SOX2 interaktómában, a H3K4me1 és a H3K9ac a pou5f1 interaktómában a leginkább dúsítottak (P < 2.2 db 10-16-os számú, párosítatlan Wilcoxon rang-sum teszt). Érdekes módon a H3k36me335 Policomb által közvetített géncsendesítő jel egyik interaktómában sem dúsul (P = 0,485, P = 0,922). Megvizsgáltuk továbbá a pou5f1 és SOX2 fokozó interaktómák kapcsolatát az 5-hidroxi-metil-citozin (5-hmC) helyekkel a genomban. Mint egy korábbi tanulmány kimutatta, a genomi 5-hmC helyek aktív fokozókkal gazdagodnak a hescs-ben36. Mivel a pou5f1 és a SOX2 upstream enhancerek az 5-HMC helyekkel szomszédosak (5 kb-on belül), megkérdeztük, hogy az enhancer interactomes is dúsított-e 5-hmC helyekkel. A 4b. ábrán látható, hogy az 5-hmC helyek a pou5f1 és SOX2 interaktómák közelségében dúsulnak a korai DNS replikációs területek véletlenszerű helyeihez képest (P < 2,2 60-16, p = 0,047, Kolmogorov-Smirnov teszt). Így a hesc-k két enhancer interaktómája epigenetikai tulajdonságokkal rendelkezik aktív fokozók, amelyek megkönnyíthetik a gén transzkripciójának aktív szabályozását.
(a) különböző hisztonjelek doboza a kölcsönhatásban lévő helyek és véletlenszerű helyek körül. A chip-Seq címkéket egy kölcsönhatásban lévő helyről számított 5 kb-on belül számoltuk és normalizáltuk. (B) összehasonlítottuk a kölcsönhatásban lévő helyek és a véletlenszerű helyek Távolságeloszlását a legközelebbi 5-hmC helyhez képest. 100 000 véletlenszerű helyet generáltak a korai DNS-replikációs területekről összehasonlítás céljából.
a pou5f1 és SOX2 enhancer kölcsönhatásban lévő gének transzkripciós státusza
a POU5F1 és SOX2 enhancerekhez kapcsolódó gének transzkripciós állapotának megértéséhez elemeztük az RNS-Seq transzkriptóm adatait a hescs–ben és a magzati tüdő fibroblasztokban37, olyan génekre összpontosítva, amelyek TSS-vel rendelkeznek 10 Kb az enhancer-kölcsönható helyek. A hesc–kben a POU5F1 és a SOX2 enhancer-kölcsönható gének expressziója szignifikánsan magasabb, mint a hesc-kben szereplő összes géné (P = 7,5 60-6 és P = 1.2 (10-6), párosítatlan Wilcoxon rank-sum teszttel; 5a.ábra ), jelezve, hogy az interaktómák aktív transzkripciós génekkel gazdagodnak. Így az aktív POU5F1 és SOX2 fokozók részt vehetnek a kapcsolódó disztális gének transzkripciójának közvetítésében. Az RNS-Seq transzkriptóm analízis azt is kimutatta, hogy a hesc-kben eredetileg aktív pou5f1 és SOX2 fokozó szerekkel társított gének a differenciált tüdő fibroblasztokban (P = 1,2 60-5, illetve P = 0,013, párosított Wilcoxon rank-sum teszttel; 5b ábra) le vannak szabályozva. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy e két szárral kapcsolatos gén fokozói kölcsönhatásba lépnek egy olyan géncsoporttal, amely erősen expresszálódik a hesc-kben, de elnyomódik a fibroblasztokban.
A Pou5f1 fokozóhoz kapcsolódó disztális gének részt vesznek a pluripotencia szabályozó áramkörében
annak feltárására, hogy a POU5F1 és a SOX2 fokozó–kölcsönhatásban lévő gének hozzájárulnak-e a hESCs önmegújulásához és pluripotenciájához, egy genomszintű RNS interferencia képernyőről származó adatokat elemeztünk a pou5f1 promoter reporter assay segítségével a hescs-ben38. A transzgenikus POU5F1-GFP expresszió interferenciáját a GFP fluoreszcencia intenzitását tükröző Fav értékekkel számszerűsítjük, amely a szárral kapcsolatos hajlamot képviseli (6a ábra ). Az összes átvilágított génhez képest a POU5F1 enhancer-kölcsönható gének (a kölcsönhatásban lévő helyekhez legközelebb eső gének, a TSS-től a kölcsönható helyekig terjedő genomi távolsággal kevesebb, mint 10 kb) csökkenő tendenciát mutatnak Fav értékek, bár statisztikailag nem szignifikánsak (P = 0,08, párosítatlan Wilcoxon rank-sum teszt). A SOX2-célzó gének esetében azonban a Fav értékek hasonlóak az összes szűrt génhez (P = 0.98, páratlan Wilcoxon rang-összeg teszt). Ezért ezen adatok alapján a pou5f1 interaktómában lévő gének fontosabbnak tűnnek az őssejtek pluripotenciája szempontjából, mint a SOX2 interaktómában lévő gének.
(a) az interaktom gének korrelációja a pluripotenciával. Az egymással kölcsönhatásban lévő géneket siRNS-vizsgálatban szűrtük POU5F1 – GFP riporter gén felhasználásával hESCs-ben bevontuk elemzésre. A kölcsönhatásban lévő gének Fav értékeinek eloszlását (a fluoreszcencia változása) összehasonlítjuk az eredeti vizsgálatban szűrt összes 21122 génnel. (B) az azonosított transzkripciós szabályozók differenciális expressziójának elemzése a hesc-kben és a magzati tüdő fibroblasztokban.
gén ontológiai elemzés39 39 pou5f1-kölcsönhatásban lévő génből és 20 SOX2-kölcsönhatásban lévő génből kiderült, hogy ezek jelentős része részt vesz a transzkripciós szabályozásban (30,8% és 35,0% a POU5F1 és SOX2 interaktómákban, illetve; 5., 6. Kiegészítő táblázat), és a pou5f1 és SOX2 interaktómákban 8, illetve 4 különböző, egymással kölcsönhatásban lévő doménre oszlik el, egy kölcsönhatásban lévő doménben legfeljebb 3 génnel. Ezen transzkripciós szabályozók differenciális expressziós elemzése a hescs-ben és a magzati tüdő fibroblasztokban a POU5F1 interaktómában lévők közül 9-et (11-ből 12 azonosított transzkripciós szabályozó rendelkezik RNS-Seq adatokkal) nagyobb expresszióval rendelkezik a hESCs-ben ( 6B ábra ), ami arra utal, hogy ezek a gének aktív szerepet játszanak a hescs pluripotencia szabályozó hálózatában. Azoknak a transzkripciós szabályozóknak a SOX2 interaktómában, 3 nak, – nek 5 fokozott expressziót mutatott a hesc-kben. Ezért a POU5F1 enhancer interactome nagyobb szerepet játszhat az őssejtek pluripotenciájában, mint a SOX2 enhancer interactome.
számos transzkripciós faktor kötő hely dúsul POU5F1 és SOX2 fokozó interaktómákban
a transzkripciós faktor kötődés az fokozó egyik jellemzője, és elősegítheti a fokozó és a disztális gének hosszú távú kromatin–kromatin kölcsönhatását. A pou5f1 és a SOX2 feltételezett fokozók ismert forró pontok a többszörös DNS-kötő fehérjék társításában a hesc-kben. Annak megértése érdekében, hogy bizonyos transzkripciós faktorok dúsulnak–e a POU5F1 és SOX2 enhancer-kölcsönható régiókban, szisztematikusan elemeztük 32 DNS-kötő fehérje ChIP-Seq profilját a hesc-kben (lásd módszerek). A normalizált ChIP-Seq címkeszámokat a 4C interakciós helyek középpontja körül a boxplot segítségével számítottuk ki és vizualizáltuk ( 7a ábra ). Kontrollként a korai DNS-replikációs területeken a véletlenszerű helyek középpontja körüli számlálást is kiszámítottuk. A kontrollhoz képest az ATF3, CTCF, Gabba, JUND, NANOG, RAD21 és YY1 lokalizációjú statisztikai analízis mindkét enhancer interaktómában a leginkább dúsított fehérjék voltak (p < 0,01, párosítatlan Wilcox rank-sum teszt). A pluripotenciával kapcsolatos transzkripciós faktor OCT4 azonban egyikben sem dúsul pou5f1 vagy SOX2 interaktom. Ezért az ATF3, CTCF, Gabba, JUND, NANOG, RAD21 és YY1 a jellemző fehérjék a pou5f1 és SOX2 fokozó interaktómákban a hesc-kben, és jelenlétük funkcionálisan fontos lehet.
(a) különböző DNS-kötő fehérjék dobozai az enhancer interakciós helyei és véletlenszerű helyei körül (a korai DNS-replikációs területekről). A chip-Seq címkéket egy kölcsönhatásban lévő helyről számított 5 kb-on belül számoltuk és normalizáltuk. (B) A RAD21 együtt lokalizálódik más transzkripciós faktorokkal az interaktómákban. A RAD21 csúcshelyek körüli átlagos intenzitási profilokat a pou5f1 és sox2 interaktómákban a hesc-kben az ATF3, CTCF, Gabba, JUND, NANOG és YY1 transzkripciós faktorokra ábrázoljuk.
a RAD21 potenciálisan komplexben van más transzkripciós faktorokkal , hogy közvetítse az enhancer interaktómákat
amint azt a 7A.ábra mutatja, A RAD21 a POU5F1-ben és a sox2 enhancer interaktómákban azonosított dúsított fehérjék egyike a hesc-kben. A RAD21 egy DNS-lánc térhálósítóként ismert kohéziós komplex része. Kimutatták, hogy a kohézin közvetíti a pou5f1 disztális fokozó hurkolását a pou5f1 gén promóterrel egér ES sejtekben40. Összhangban egy korábbi jelentéssel, miszerint a Rad21 együttműködik a Ctcf-fel és más transzkripciós faktorokkal az egér ES sejtazonosságának fenntartásában40, a RAD21 helyek mind a pou5f1, mind a sox2 interaktomokban a hesc-kben együtt vannak elfoglalva transzkripciós faktorok. Az aggregációs diagramok világosan szemléltetik az ATF3, CTCF, Gabba, JUND, NANOG és YY1 kötési profilok csúcsjeleit a RAD21 helyek közepén a POU5F1 és SOX2 interaktómákban ( 7b ábra ). A Gappa leütése az egér ES sejtjeiben ismert, hogy csökkenti az Oct3/4 expressziót, míg a Gappa túlzott expressziója fenntartja az Oct3/4 expresszióját LIF nélkül is az egér ES sejtkultúrájában41. A hescs38 genomszintű siRNS-szűrőjén a legtöbb dúsított fehérje, például RAD21, CTCF, Gabba, JUND, NANOG és YY1, jelentősen csökkentette a GFP riporterhez kapcsolódó transzgenikus POU5F1-promoter expresszióját, Fav értékekkel -1.50421, -1.05828, -1.44161, -1.07731, -1.82749, -2.57204, illetőleg (az összes vizsgált gén felső 25% – án belül). A kromatin–kromatin kölcsönhatások további megértése érdekében DNS-fluoreszcens in-situ hibridizációt (FISH) alkalmaztunk két genomiális lókusz együttes lokalizációjának vizualizálására egyetlen sejt szintjén. A 12. kromoszómán található rarg gén lokuszt a pou5f1 interaktómában azonosították a hESCs-ben. Nemrégiben kimutatták, hogy a RARG nagyon fontos szerepet játszik a pluripotenciában, és két nagyságrenddel növelheti az iPS sejtek indukcióját42. Egy másik lokusz a 12. kromoszómán, amely nem része a POU5F1 interaktómának, kontrollként használtuk. A rarg lokusz (chr12) közötti együttes lokalizációs frekvencia: 51751589-51956291) és a POU5F1 lokusz (chr6: 31169844-31340561) 1,67-szer nagyobb volt, mint a kontroll lokusz (chr12: 80380971-80564119) és a POU5F1 lokusz (9,35% versus 5,61%, P < 0.05, kiegészítő ábra. 3A). A rarg és a POU5F1 lókuszok közötti magasabb érintkezési gyakoriság összhangban van a szekvenálási adatainkkal, és arra utal, hogy stabilabb kölcsönhatások alakulnak ki a két lókusz között. A rarg és a kontroll lókuszok vizsgálata (kiegészítő ábra. 3B) kimutatta, hogy több RAD21 és más transzkripciós faktor kötő hely van a RARG lokuszban, gyakori együttes lokalizációval. A kromoszóma kölcsönhatás gyakoriságának egybeesése a rad21-t tartalmazó kötőhelyekkel több transzkripciós faktor esetében arra utal, hogy a RAD21 együttműködhet más transzkripciós faktorokkal a hosszú távú kromatin-kromatin kölcsönhatások megszervezésében. Így a RAD21 a többszörös transzkripciós faktorokkal együtt valószínűleg hozzájárul a pou5f1 és SOX2 fokozókat körülvevő magasabb rendű kromoszómaszerkezethez a hescs-ben egy pluripotencia hálózat részeként. A 4C-Seq vizsgálatból származó hipotézis megerősítéséhez azonban további molekuláris vizsgálatokra van szükség.