a rezisztencia mechanizmusa Escherichia coli által indukált ampicillin laboratóriumi

Bevezetés

patogén Escherichia coli gyakran okoz hasmenést, szepszis, és más klinikai tünetek, és még mindig az egyik fő bél kórokozók érintő emberi és állati egészségre. Az ampicillint (AMP), egy félszintetikus laktám antibiotikum, széles körben használják az emberi és állati E. coli fertőzés kezelésére, de az utóbbi időben a rezisztencia aránya nőtt.Az 1-3 AMP a baktériumok aktív replikációs szakaszában működik, gátolja a bakteriális sejtfal szintézisét. A baktériumok gyakran ellenállnak az ilyen antibiotikumoknak a következő módokon: kódolja a laktamázt, megváltoztatja a célfehérjét a sejtfalban, csökkenti a külső membrán permeabilitását, növeli a gyógyszer efflux pumpájának expresszióját. Az antibakteriális gyógyszereket az állatok használják, majd ürülék útján terjednek a környezetbe, ami nemcsak a környezetet szennyezi, hanem nagy kárt okoz az emberi egészségnek és a tenyésztőipar fenntartható fejlődésének.4,5

kimutatták, hogy a teljes genom szekvenálás (WGS) irányítja a baktériumok rezisztenciájának megelőzését és ellenőrzését.6 Az egy nukleotid polimorfizmus (SNP) elsősorban a DNS-szekvencia polimorfizmusára utal, amelyet egyetlen nukleotid variációja okoz genomi szinten, és a különböző SNP-k szűrésére szolgáló újraszekvenálási elemzés közvetlenebben tanulmányozhatja a gyógyszerrezisztenciát. Az AMP laboratóriumi indukció módszerével szimuláltuk a klinikai antibiotikumok folyamatát az organizmusokban, és megvizsgáltuk a gyógyszerrezisztencia mértéke és a mutáció helye közötti kapcsolatot. A nem szinonim egy nukleotid polimorfizmus (non-SNP) szűrése a gyógyszerrezisztens és a fogékony törzsek között, hogy megértsük a nem SNP szerepét a gyógyszerrezisztens törzsekben. A tanulmány célja az E. coli gyógyszerrezisztencia törvényének és mechanizmusának megértése, új célok biztosítása az új antibiotikumok kifejlesztéséhez, az antibiotikumok ésszerű felhasználása, valamint az E. coli több gyógyszerrezisztencia többszörös előfordulásának és kezelésének megoldása a klinikai gyakorlatban.

anyagok és módszerek

Baktériumizolátumok és reagensek

a vizsgálatban használt E. coli törzs (E. coli 15743) izolálták egy beteg székletmintájából egy kórházban Suixian, Henan tartomány, Kína, 2015-ben. Ennek a törzsnek a Kirby Bauer (K-B) papírdiffúziós módszerrel történő jellemzése azt mutatta, hogy a törzs érzékeny volt 20 antibiotikum nyolc osztályára. Az E. coli ATCC 25922-t kontrollként használtuk vizsgálatunkhoz.

M-H húsleves közepes és M-H szilárd közeg (Oxoid company, Egyesült Királyság), gyógyszerészeti érzékeny papír (Hangzhou Binhe mikrobiális cég, Hangzhou, Kína), AMP standard termékek (kínai kábítószer-azonosító Intézet, Peking, Kína), DNS-extrakciós készlet (Shanghai Laifeng Biotech company, Shanghai, Kína). Illumina Hiseq a Shanghai Lingen Biotechnology Co. – nál készült., Kft.

a kísérletben használt E. coli-t kifejezetten izoláltuk ehhez a vizsgálathoz. A tanulmányt a Zhengzhou Egyetem Élettudományi Etikai Bizottsága hagyta jóvá, és a beteg írásbeli tájékozott beleegyezést is aláírt.

indukciós folyamat

a minimális gátló koncentrációt (Mic) mikrobroth hígítási módszerrel határoztuk meg.7-9 az AMP-re érzékeny E. coli törzset (klinikai szempontból izolálva, MIC értékkel) MH szilárd táptalajban tenyésztettük, 37 Kb C tenyészet 18-24 óra után, válasszon egyetlen kolóniát 8 mL m-H folyékony táptalajban a baktériumok amplifikálásához. A fenti baktériumoldatot 1/2mic AMP-t tartalmazó M-H folyékony közegben tenyésztettük, illetve az AMP koncentrációját a szubkultúra során folyamatosan növeltük. Amikor az antibiotikumok koncentrációja elérte a 16 ~ g/mL-t, minden alkalommal 8 ~ g/mL-t növeltek, és minden koncentrációt kétszer szubkultúráltak. Amikor egy gyógyszer MIC változásának értéke nagyobb vagy egyenlő volt a mic négyszeresével az indukció előtt és után, úgy ítélték meg, hogy az indukció utáni MIC változásnak jelentős jelentősége van.10 az M-H táptalaj antibiotikumok nélküli táptalaját használták kontrollként az egész folyamat során.

Multilocus sequence typing (MLST) az E. a coli törzseket hét pár háztartási gén alapján osztályozták, amelyek adk, fumC, gyrB, icd, mdh, purA és recA.

érzékenységi vizsgálat

Kirby Bauer papírdiffúziós módszert alkalmaztak az E. coli szűrésére, amely érzékeny volt nyolcféle antibiotikumra, beleértve az aminoglikozidokat, penicillineket, cefalosporinokat, tetraciklineket, laktamáz inhibitorokat, karbamátokat, szulfonamidokat és kinolonokat. Az indukált törzseket megismételtük gyógyszerérzékenységi teszt. Az adatok értelmezése a Clinical and Laboratory Standards Institute 2016 irányelveinek megfelelően történt.11

először E. coli rezisztenciát indukáltunk az AMP-vel szemben, az E. coli tenyésztésével az AMP koncentrációjának fokozatos növelésével (2, 4, 8, 16, 32, 64, 128, és 256 db/ml). Miután megkaptuk a rezisztencia törzset, összehasonlítottuk a 20 antibiotikum rezisztenciaspektrumát az indukált törzs (E. coli 15743-256, indukált 256 ~ g/mL) és az eredeti törzs (E. coli 15743) között gyógyszerérzékenységi tesztek elvégzésével. A bakteriális szuszpenziót egy agar lemezre terítették, egy kis kör alakú papírral, amely különböző antibiotikumokat tartalmazott,és 37 6-20 órán át tenyésztették. Antimikrobiális gyűrű átmérőjét mértük.

WGS és resequencing analysis

a mic 32-es és 256-os értéken lévő törzseket sorrendben E. coli 15743-32 és E. coli 15743-256 néven nevezték el. A teljes genom analízist az elsődleges érzékeny törzseken, a resequencinget pedig indukált rezisztens törzseken végeztük. Az újraszekvenálás eredményeit összehasonlítottuk az eredeti térkép eredményeivel. Nem SNP-k szűrése, amelyek befolyásolhatják a fehérje működését.

a szekvenálást a Shanghai ling ‘ en Biotechnology Co.végezte. Kft. (Sanghaj, Kína). Illumina Hiseq kombinálva harmadik generációs szekvenálási technológiát alkalmaztak a törzsek genomiális szekvenálásának befejezéséhez ebben a projektben.

RT-PCR

távolítsuk el a reverz transzkripciós DNS-t a 4 db C-es fagyasztóból, és készítsük elő a reagens kívánt koncentrációját az utasításoknak megfelelően. Kapcsolja be az ABI Fast7500 eszköz, készlet 95°C-on 30 s, reagálni 40 ciklus, 95°C-on 3 s, 60°C-on 30 s, majd feloldani, hogy a görbe a 95°C-on 15 s, 60°C-60 s-95°C-on 15 s. Adja hozzá a mintát a 8 soros EP-csőhöz, mintánként három párhuzamos kutat, majd centrifugálással távolítsa el a buborékokat. Az egyes minták átlagos CT-értékét a reakció befejezése után rögzítettük. A kérdéses gén relatív expressziós szintjét 2−ons alkalmazásával számítottuk ki. (A CÉLGÉN ct értéke-a belső referenciagén CT értéke. ΔΔCT = kísérleti minta ΔCT – kontroll csoport ΔCT.)

bioinformatikai analízis

Svájci MODELLSZOFTVERT használtak a génmutáció előtt és után kódolt fehérje aminosav-szekvenciájának elemzésére, és a fehérje harmadlagos szerkezetének előrejelzésére.12,13

Statisztikai analízis

SPSS17.0-t használtunk az egyszerű lineáris regressziós analízishez, és a regressziós egyenletet teszteltük. A teszt mérete 0,05 volt (6,05).

eredmények

Gyógyszerérzékenységi teszt eredményei

adataink azt mutatták, hogy az E. coli 15743 érzékeny volt 20 különböző antibiotikumra. Indukció után, E. az 15743-256 coli rezisztens volt az AMP, piperacillin, cefuroxim, cefazolin, cefoxitin, AMP/szulbaktám, amoxicillin/klavulánsav, piperacillin/tazobaktám és aztreonam ellen, de még mindig érzékeny a fennmaradó 11 antibiotikumra (1.táblázat, vegye figyelembe, hogy a közvetítőket gyógyszerrezisztenciaként is meghatározták). Eredményeink azt mutatták, hogy az eredeti érzékeny E. coli nemcsak az AMP-re rezisztens volt, hanem számos más antibiotikummal szemben is rezisztens, és az indukció során multirezisztens lett.

1.táblázat az Escherichia coli antibakteriális gyűrű átmérője

a gyógyszerrezisztencia előfordulása (mic-értékkel meghatározva) az indukció során

a gyógyszerrezisztencia kinetikájának vizsgálatához E. coli-t tenyésztettünk növekvő amp-koncentrációval különböző időszakokon keresztül, és minden koncentrációnál Mic-t mértünk a 2. táblázat szerint. Regresszióanalízist végeztünk a MIC értéken és az indukciós időn SPSS 17.0 alkalmazásával. A regressziós egyenlet y=1,0435 lnx-0,7316 volt. Az egyenlet illesztési hatását értékeltük, R2=0,9605, P<0,05. A kritikus érték a mic-érték, amely eléri a 32 ~ g/mL értéket, és a MIC-érték gyorsabban nőtt a 32 ~ g/mL elérése előtt, mint utána (2.táblázat).

2. táblázat az e MIC értéke. coli 15743 idővel és indukált koncentráció

eközben a regresszióanalízishez azt a részt választottuk ki, amelynek MIC-értéke legfeljebb 32 USD/mL volt, és a regressziós egyenlet y=0,0358 x+1,2812 volt. Az egyenlet illesztési hatását értékeltük, R2=0,991, P<0,05. Az E. coli 15743 MIC értéke az indukciós koncentráció és az indukciós idő növekedésével nőtt (1.ábra).

1.ábra a MIC érték időbeli változása.Rövidítés: MIC, minimális gátlókoncentráció.

MLST eredmények

annak bizonyítására, hogy az indukált törzs (E. coli 15743-256) valóban az eredeti törzsből (E. coli 15743) származik, két törzs feletti MLST-t végeztünk. A genomi DNS-t bakteriális DNS-extrakciós készlet segítségével extraháltuk, PCR-t amplifikáltunk és a Sangon Biotech (Shanghai) Co., Kft. Az NCBI adatbázis robbanáskeresése azt mutatta, hogy ez a két törzs azonos, MLST típusú, adk-13, fumC-363, gyrB-302, icd-97, mdh-17, purA-94 és recA-93. Adataink azt mutatják, hogy az indukciós folyamat nem volt szennyezett, és az E. coli 15743-256 rezisztens törzs az E. coli 15743 érzékeny törzsből származik.

teljes genom elemzés

Az E. coli 15743 4408 gént, 22 rRNS-t és 85 tRNS-t tartalmazott. A gén sűrűsége 0,945 kb, a GC-tartalom 51 volt.7%, a gén százalékos aránya 88,3% volt, az intergenikus régió hossza 545 151, az intergenikus régió GC-tartalma 42,6% volt, az intergenikus régió pedig a genom 11,7% – át tette ki. Az E. coli 15743 genomok jellemzőit a 2. ábra foglalja össze. Az E. coli 15743 nem tartalmazott plazmidokat.

2.ábra az E. coli genetikai térképe 15743.Megjegyzések: a körtérkép legkülső köre a genom méretű logó, minden skála 0,1 Mp. A második és a harmadik kör a pozitív és negatív láncok CDS-je, a különböző színek pedig a CDS különböző fogaskerekes osztályozását jelzik. A negyedik kör rRNS vagy tRNS. Az ötödik kör a GC-tartalom, a kifelé mutató piros rész pedig azt jelzi, hogy a régió GC-tartalma magasabb, mint a teljes genom átlagos GC-tartalma. Minél magasabb a csúcsérték, annál nagyobb a különbség az átlagos GC-tartalomtól, a befelé mutató kék rész pedig azt jelzi, hogy a régió GC-tartalma alacsony. A teljes genom átlagos GC-tartalma esetén a magasabb csúcs nagyobb különbséget jelez az átlagos GC-tartalomtól. A legbelső kör a GC ferdeség értéke. A specifikus algoritmus G-C vagy G+C. Ha az érték biológiai értelemben pozitív, a pozitív lánc hajlamos átírni a CDS-t. Ha negatív, a negatív lánc hajlamos átírni a CD-ket.Rövidítés: COG, Ortológ csoportok Klasztereifehérjék.

a törzs genomtérképe magában foglalja a gének eloszlását az igazságosság és az antiszensz láncain, az Ortológ fehérjecsoportok (COG) klasztereinek funkcionális osztályozását, a GC-tartalmat, a genomszigetet és a homológ géneket, amelyek teljes mértékben megjeleníthetik a genom jellemzőit.

fogaskerék

az e fogaskerék funkcionális osztályozása. a coli 15743 kimutatta, hogy a legtöbb gén kapcsolatban áll az aminosav szállításával és anyagcseréjével, a szénhidrát szállításával és anyagcseréjével, az energiatermeléssel és-átalakítással, csak az Általános funkció előrejelzésével, a szervetlen ion transzportjával és anyagcseréjével, valamint a sejtburok biogenezisével (3.ábra).

3.ábra a fogaskerék funkcionális osztályozása E. coli 15743.Rövidítés: COG, a fehérjék Ortológ csoportjainak klaszterei.

nem SNPs

annak megállapításához, hogy az E. coli genomjában változás történt-e az eredeti törzs indukciója után, az indukált rezisztens törzsek (E. coli 15743-32 és E. coli 15743-256), és elemezte a mutációk számát és a mutáció helyét.

az eredeti E. coli törzshez (E. coli 15743) képest kilenc nem SNP volt két indukált gyógyszerrezisztens törzsben, köztük három közös nem SNP-ben, amelyek az orf00819, orf01200 és orf02235 génekben voltak jelen. Más nem SNP-k voltak jelen az orf01916, orf00490, orf03479, orf04094 génekben. Három nem SNPs mutáció fordult elő az orf03479 génben, és csak egy SNP mutáció fordult elő a fennmaradó gének mindegyikében. Három nem SNP volt a sejtmembrán fehérjéket kódoló génekben. Három ismeretlen funkciójú génben volt. Az egyik a szervetlen ion transzportjával és metabolizmusával, a másik a transzkripcióval, a másik pedig a jelátviteli mechanizmusokkal volt kapcsolatban (3.táblázat).

3.táblázat a nem-SNPs elemzés eredményei E. coli 15743-32 és E. coli 15743-256

adataink azt mutatták, hogy négy nem SNP volt az E. coli 15743-32-ben, amelyek négy génen voltak. Nyolc nem SNP volt az E. coli 15743-256-ban, hat génre terjedve. A COG funkcionális osztályozása azt mutatta, hogy a legtöbb gén kapcsolatban áll az aminosav transzportjával és anyagcseréjével, a szénhidrát transzportjával és anyagcseréjével, az energiatermeléssel és-átalakítással, az Általános funkció előrejelzéssel, a szervetlen ion transzportjával és metabolizmusával, valamint a sejtburok biogenezisével.

RT-PCR

teljes genom újraszekvenálása E. coli 15743-32 és E. coli 15743-256, konszenzusos gének fluoreszcens valós idejű kvantitatív PCR kimutatása. Megvizsgáltuk azokat a géneket, amelyekben nem SNP-k fordulnak elő, valamint az E. coli 15743-32 és az E. az 15743-256 coli három azonos génnel rendelkezett (orf00819, orf01200, orf02235), ezeknek a géneknek az expressziós szintjét az egyes generációs törzsekben a 4A–C ábra mutatja.

4.ábra az mRNS expressziójának eredményei a különböző generációkban törzsek.

RT-PCR azt mutatta, hogy az orf01200, orf00819, orf02235 gének nagy expressziót mutattak rezisztens törzsekben (E. coli 15743-32, E. coli 15743-64, E. coli 15743-128, E. coli 15743-256).

fehérjeszerkezet-előrejelzés

a harmadlagos szerkezet csak az orf01200 és orf04094 gének által kódolt fehérjékben változik, és az előrejelzett eredményeket az 5.és 6. ábra mutatja.

5.ábra a fehérje által kódolt harmadlagos szerkezete orf01200 gén.Megjegyzések: (A) a mutáció előtt; (B) a mutáció után.

6.ábra az orf04094 gén által kódolt fehérje harmadlagos szerkezete.Megjegyzések: (A) a mutáció előtt; (B) a mutáció után.

az orf01200, 2hrt mutációja előtt.1.A-t választottuk referenciasablon fehérjeként (5a.ábra). A maradék infrastruktúra modelltartománya 2-1033 volt, a szekvencia hasonlósága 0 volt.59, a sablon lefedettsége pedig 1,00 volt. Az orf01200 mutációja után, 1iwg.1.Az A-t választottuk referenciasablon fehérjeként (5b ábra). A maradék infrastruktúra modelltartománya 7-1036 volt, a szekvencia hasonlósága 0,59, a sablon lefedettsége pedig 1,00 volt.

az orf04094, 4cti mutációja előtt.1.B-t választottuk referenciasablon fehérjeként (6a ábra). A maradék infrastruktúra modelltartománya 184-436 volt, a szekvencia hasonlósága 0,56, a sablon lefedettsége pedig 0,59 volt. Az orf04094 mutációja után, 3ib7.1.Az A-t választottuk referenciasablon fehérjeként (6B ábra). A maradék infrastruktúra modelltartománya 10-262 volt, a szekvencia hasonlósága 0,33, a sablon lefedettsége pedig 0,91 volt.

megbeszélés

a MIC és az indukciós idő regressziós analízise azt mutatta, hogy a törzs MIC értéke nőtt az exogén antibiotikum nyomás és az indukciós idő növekedésével. Liu et al, kimutatta, hogy az E. coli rezisztencia imipenem általi indukciója során a MIC-érték idővel növekedett.14 még akkor is, amikor az indukált koncentráció elérte az elsődleges törzs MIC-értékének 128-szorosát, az indukció folytatódott, és a MIC-érték tovább nőtt az indukcióval. A vizsgálat eredményeivel összhangban az E. coli MIC értéke az idő múlásával és az indukált koncentrációval nőtt. Ez azt mutatja, hogy ha az adag nincs korlátozva, a törzs ellenállása egyre súlyosabbá válik.

AMP-T indukáltak az E. coli 15743-ban 63 órán keresztül (a MIC elérte a 32 ~ g / mL-t), és a MIC értéke nyolcszorosa volt a fogékony törzsének. Ezt megelőzően a MIC-érték gyorsan növekedett, míg amikor a MIC-érték 32 ~ g/mL volt, az indukció folytatódott, és a mic-érték növekedési üteme csökkent. Figyelembe véve a baktériumrezisztencia röviddel a gyógyszerrezisztencia küszöbértékének elérése előtt fordulhat elő (MIC-érték 32 Ft/mL). A kritikus érték elérése után a baktériumok lustaak lehetnek és lassan növekedhetnek, de a MIC értéke tovább növekszik. Úgy gondolják továbbá, hogy ez a törzs bizonyos rezisztencia mechanizmusokat aktivál, és megváltoztatja a baktériumok gyógyszerrezisztencia állapotát.

Zhang et al, kimutatta, hogy a kloramfenikol érzékeny shigellát indukált a gyógyszerrezisztens állapotba, és a gyógyszerrezisztencia spektruma megváltozik.10 ennek eredményeként a Shigella nemcsak rezisztens volt a kloramfenikollal szemben, hanem más típusú antibiotikumokkal szemben is. A vizsgálat eredményeivel összhangban az E. coli gyógyszerrezisztencia-spektruma az indukció után amplifikálódott. Az eredmények azt mutatták, hogy E. a coli 15743-256 nemcsak az AMP-re volt rezisztens, hanem a piperacillinre, a cefuroximra, a cefazolinra, a cefoxitinre, az AMP/szulbaktámra, az amoxicillin/klavulánsavra, a piperacillin/tazobaktámra és az aztreonamra is rezisztensek voltak. Úgy véljük, hogy az E. coli AMP általi indukciója során az AcrAB-TolC expressziós rendszere aktiválódik, vagy a többszörös efflux szivattyúrendszerek közül egynél több aktiválódik, és az efflux mechanizmuson kívül más ellenállási mechanizmusok is vannak.

a bakteriális rezisztencia molekuláris mechanizmusa még mindig nem tisztázott. Az e specifikus molekuláris mechanizmusának vizsgálata érdekében. coli rezisztencia AMP-vel szemben, bakteriális WGS analízist végeztünk. A szekvenálási eredményeket összehasonlítottuk a referencia szekvenciával, és 20 SNP-t szűrtünk az E. coli 15743-32 szekvenciájából, amelyek közül 4 nem szinonim SNP volt. Huszonhat SNP-t szűrtünk az E. coli 15743-256 törzsből, amelyek közül nyolc nem szinonim SNP volt. Xiang et al, kimutatta, hogy a mutáns törzsek rezisztenciaszintje magasabb volt, mint a nem mutáns törzseké, és kvantitatív reakció volt a pontmutációk és a bakteriális rezisztencia szintje között, és több génmutáció fokozhatja a baktériumok antibiotikumokkal szembeni rezisztenciáját.15 e vizsgálat eredményeivel összhangban az E. coli 15743-32-ben a mutáns gének száma kisebb volt, mint az E. coli 15743-256-ban, ami azt jelzi, hogy a mutációk száma összefügghet a gyógyszerrezisztencia mértékével, és minél több mutációs hely van, annál nagyobb a gyógyszerrezisztencia mértéke.

a szekvenálás után az ebben a kísérletben szűrt nem SNP-k eloszlottak az orf00490, orf00819, orf01916, orf01200, orf02235, orf03479 és orf04094 génekben. Ezek közül az orf00490, orf00819 és orf01916 gének vesznek részt a sejtfal szintézisében. A Kegg-ben szereplő megjegyzések a következők: fumarát-reduktáz d alegység (frdD), sejtosztódási fehérje ftsI (penicillin-kötő fehérje 3) és Porin külső membránfehérje OmpD. Tanulmányok kimutatták, hogy az frd gén egy FRD enzimet kódol, amely katalizálja a fumarát-reduktáz és a szukcinát-dehidrogenáz közötti átalakulást.16 azt is megállapítottuk, hogy az frdD gén plazmidvektor alkalmazásával történő amplifikációja növelheti a borostyánkősav hozamát.17,18 ezzel a vizsgálattal kombinálva úgy vélik, hogy az frdD gén részt vesz bizonyos metabolikus útvonalakban, amelyek valószínűleg AMP-rezisztenciával társulnak. Az E. coli esetében a fő célpontok a pbp1 (a sejtmorfológia fenntartása), a PBP2 (az E. coli feszültségének és rúd alakjának fenntartása) és a pbp3 (a bakteriális osztódással kapcsolatos). A PBP3 a sejtosztódási fehérjék alapvető összetevője, amelyek katalizálják a sejtfal peptidoglikánok térhálósodását a sejtosztódás során.19-22 vizsgálat kimutatta, hogy az OmpD fehérje és az OmpD génexpresszió lefelé történő szabályozása a bakteriális biofilmekben csökkenti a sejtmembrán permeabilitását és növeli az antibiotikumokkal szembeni rezisztenciát.23,24 a vizsgálat eredményeivel összhangban az OmpD génmutáció megindítja a bakteriális rezisztencia mechanizmusát az Alzheimer-laktám antibiotikumokkal szemben, és az E. coli sejtmembrán permeabilitásának csökkenése az AMP-vel szembeni fokozott rezisztencia egyik oka. Úgy véljük, hogy a sejtfal szintézisében részt vevő gének által kódolt fehérjék funkciójának ezen változásai befolyásolják a baktériumok AMP-vel szembeni rezisztenciáját.

az orf04094, orf01200, orf02235 géneket a KEGG-ben ozmotikus nyomásérzékelő hisztidin-kináz (envZ), multi-drug efflux pump gén (acrB) és a transzkripciós szabályozásban (marR) részt vevő multi-drug resistance protein néven jegyzik. Az elmúlt években az aktív efflux mechanizmus a baktériumok többszörös gyógyszerrezisztenciájának fő oka.25-27 mivel a szennyvízrendszer nagy része széles körben szállítja a szubsztrátumokat, és sok aktív szennyvízrendszer létezhet ugyanabban a baktériumban, ez a rendszer bakteriális rezisztenciához vezethet a különböző, teljesen eltérő szerkezetű antibakteriális gyógyszerekkel szemben, nevezetesen többszörös rezisztenciával. Marlen Adler tanulmányában az ftsI gén mutációi önmagukban nem növelték az antibiotikum-rezisztenciát, míg az ftsi és az envZ génmutációk többszörösére növelték az antibiotikumok MIC-jét. Cohen és munkatársai kimutatták, hogy a mutált MarR gén által kódolt gátló fehérje funkciója csökken, és a baktériumok hatása az antibiotikumok többszörös rezisztenciájára kicsi volt, amikor a MarR mutációt csak kimutatták.28 Merric et al, megállapította, hogy az E. coli csak alacsony szintű multi-gyógyszer rezisztenciát mutatott, amikor a MarR gént mutálták.29 a vizsgálat eredményei azt mutatták, hogy egyszerre több gén mutálódott, és az AMP-vel szembeni E. coli rezisztencia nőtt.

az orf03479 gént valin-glicin ismétlődő g (VgrG) fehérjeként jegyezzük fel a KEGG-ben. A VI típusú szekréciós rendszer (T6SS) egy fághoz kapcsolódó rendszer, amely számos bakteriális patogénben létezik, mint pl E. coli, Pseudomonas aeruginosaés Burkholderia cenocepacia. Az effektor faktorok kiválasztódhatnak a baktériumok extracelluláris sejtjeibe, a fehérje szekréciós rendszer pedig szorosan kapcsolódik a patogén baktériumok virulenciájához. Wang Jianfeng és munkatársai kimutatták, hogy a VgrG génmutáció befolyásolja a baktériumok toxicitását és gyógyszerrezisztenciáját, de a glutamát-valin ismétlődő fehérje funkciója még mindig nem tisztázott.30 Ez a tanulmány úgy véli, hogy a VgrG gén összefüggésbe hozható az AMP rezisztenciával, és mechanizmusa további vizsgálatot igényel.

összefoglalva, ezeknek a mutáns géneknek a fogaskerekes funkciója összefügg a sejtmembránok eredetével, a szervetlen ionok transzportjával és metabolizmusával, a transzkripcióval és a jelátviteli mechanizmusokkal. Tanulmányok kimutatták, hogy az antibiotikum stressz alatt a baktériumok mind aktív, mind passzív védelmet nyújthatnak túlélésük biztosítása érdekében.31 a passzív védekezésben a baktériumok szunnyadnak, csökkentik az élet vitalitását és blokkolják az antibiotikumok kombinációját, és az antibiotikumok gyilkos hatásának csökkentésére irányulnak. Aktív védekezésben növelik az efflux szivattyú aktivitását, hogy növeljék az antibiotikumok effluxját, és csökkentsék az antibiotikumok felhalmozódását a baktériumokban, ezáltal csökkentve az antibiotikumok baktériumokra gyakorolt gyilkos hatását. Ez a tanulmány azt sugallja, hogy az E. coli ellenállása az AMP-vel szemben az aktív védelmi rendszerek és a passzív védelmi rendszerek kombinációja. A gyógyszerrezisztencia röviddel azelőtt fordulhat elő, hogy a bakteriális MIC érték eléri a gyógyszerrezisztencia küszöböt. Az frdD, ftsI, acrB, OmpD, marR, VgrG és envZ gének az AMP rezisztenciához kapcsolódnak. Ezek a vizsgálatok segítenek javítani az E. coli molekuláris mechanizmusát, amely rezisztens a CAC-laktám antibiotikumokkal szemben, és kutatási alapot nyújtanak a multirezisztens baktériumok megelőzéséhez és ellenőrzéséhez, valamint az új antibiotikumok céljainak meghatározásához.