- Myoblasts elfogadja hosszúkás alakú megkülönböztetni és szabályozni aktin hálózat terjedési terület
- az aktinhálózat és a mag térbeli szerveződését a myoblast morfológia irányítja
- A sejtek megnyúlása fokozza a myoblast kontraktilitását
- A sejtpárok kontraktilitása nőtt a fúziójuk és a hosszúkás mikropatternákon történő emelés után
- az aktomiozin kontraktilitása elősegíti a myotube differenciálódását
- a Myoblast megnyúlása kiváltja a Yap nukleáris exportot, amely elengedhetetlen a myoblastok myotubákba történő differenciálódásához
Myoblasts elfogadja hosszúkás alakú megkülönböztetni és szabályozni aktin hálózat terjedési terület
hogy értékelje a kapcsolat a sejt alakja, aktin hálózat és fokális összenövések, mi tenyésztettük c2c12 myoblasts egy homogén réteg fibronektin (FN). 24 órás tenyésztés után a myoblastokat rögzítették és festették aktinra, hogy meghatározzák morfológiai paramétereiket (ábra. 1A). Az FN-bevonatú szubsztrátok lehetővé tették specifikus sejt-szubsztrát kölcsönhatások létrehozását specifikus transzmembrán integrinek toborzásával. Valóban, több olyan integrin alegység, amely kombinálódik a 6. számú alegységgel, a csontváz myogenezise során fejeződik ki, fontos a myogén sejtvándorlásban, a myoblast fúzióban,az izomrost érésében vagy az izomintegritás fenntartásában32, 33. A laminin(LAM) bevonatú szubsztrátokon végzett további kísérletek azt mutatták, hogy mind a morfológiai paraméterek (sejt alak index, sejt kerülete és sejtterület, kiegészítő ábra. 1A) és sejt-szubsztrát kölcsönhatások (fokális adhéziók száma és területe, kiegészítő ábra. 1b) statisztikailag hasonlóak voltak az FN és a LAM esetében, validálva az FN bevonatot a c2c12 myoblastok morfológiájának in vitro tanulmányozásához a fúziós/differenciálódási folyamat során.
a Myoblastok hosszúkás alakot vesznek fel, hogy megkülönböztessék és szabályozzák aktinhálózatukat a terjedési területre. (A) színkódolt epifluoreszcens képek tipikus C2C12 egyedi myoblastokról, amelyek különböző sejt alakú indexeket (CSI) mutatnak in vitro. A sejteket phalloidinnal festettük aktinra. A sávok mérete 20 fő. A (B) CSI (R2 = 0,80), (C) a sejt kerülete (R2 = 0,97) és (D) a sejt területe (R2 = 0) morfológiai elemzése.82) azt jelzik, hogy az in vitro tenyésztett c2c12 sejtek átlagos területe 2057 618 6m2, átlagos CSI pedig 0,37 0,15 (n = 101 A B, C és D esetében). A piros görbék Gauss-illeszkedés. (E) az aktin fluoreszcencia intenzitásának lineáris alakulása a sejtterület függvényében (R2 = 0,748, n = 28). A teljes vinculin terület alakulása (F) a sejtterület (R2 = 0,783, n = 28) és (G) függvényében, valamint az F-aktin intenzitása (n = 28). (H) a c2c12 myoblastok proliferációjának (sárga) és differenciálódásának (piros) idővonala in vitro. A fekete nyíl azt jelzi, hogy a proliferációs közegeket differenciáló közegekkel helyettesítik. (I,J) A myoblastok oldalaránya P0, P2 (proliferációs szakaszok, átlag = 0,40 0,16 p0-nál, n = 150 mindkettőnél) és D2 (differenciálási szakasz, átlag = 0,24 0,07, n = 100).
számszerűsítettük a sejtalak indexet (CSI), amely a myoblastok morfológiáját jellemezte a sejt megnyúlásának megadásával. A lekerekített sejtek CSI-je közel 1, míg a hosszúkás sejtek CSI-je közel 0. 0,1-0,8 közötti CSI-t találtunk, amelynek átlagos értéke 0.37 0,15 (n = 101), ami a sejtmorfológiák nagy változékonyságára utal (ábra. 1B). A myoblastok átlagos kerülete 259 62 6 m (ábra. 1C, n = 101) és széles elterjedési területe (~1000 – ~4000 6m2), átlagértéke 2057 618 6m2 (ábra. 1D, n = 101). Ezeket a c2c12 myoblastokon kapott eredményeket megerősítették további morfológiai mérések elvégzésével (CSI, sejtperiméter és sejtterület) primer humán myoblastokon (16ubic, kiegészítő ábra. 2A), amelyek az FSHD által nem érintett beteg bicepszéből származnak (pl. akikről megerősítették, hogy hiányzik a 4qA törlés). Amint azt a kiegészítő ábra mutatja. 2B-D, eredményeink azt mutatják, hogy a 16ubikus myoblastok CSI-je 0,14-0,86 között mozgott, átlagértéke 0,44 0,17 (n = 90), ami a humán myoblastok sejtmorfológiájának nagy változékonyságára utal, amint azt a C2C12 sejteknél megfigyelték. Összességében eredményeink azt mutatják, hogy a sejtmorfológiák variabilitása nem függ a sejttípustól vagy a sejttenyészet bármely tárgyától.
ezután tanulmányoztuk az aktinszálak eloszlását a c2c12 myoblastok populációjában annak megértése érdekében, hogy a variabilitást terjesztő területek modulálhatják-e az aktin citoszkeletont. Eredményeink azt mutatták, hogy az F-aktin hálózat teljes fluoreszcencia intenzitása lineárisan kapcsolódik a sejtterülethez (ábra. 1E, n = 31, R2 = 0,748), ami arra utal, hogy minél nagyobb a myoblast terjedése, annál több aktinszál képződik. Amint azt a kiegészítő ábra mutatja. 3, ezután jellemeztük a vinculin-tartalmú adhéziók eloszlását annak meghatározására, hogy a sejt alakjának variációi hogyan befolyásolják a sejt-szubsztrát kölcsönhatásokat a C2C12 myoblastokban. Megállapítottuk, hogy a sejt-szubsztrát adhéziók teljes területe sejtenként nőtt a sejt területével (ábra. 1F, n = 31, R2 = 0,783) és az F-aktin fluoreszcencia intenzitásával (ábra. 1 g). Eredményeink azt mutatják, hogy a C2C12 myoblastok különböző sejtformákat és terjedési területeket feltételeznek, viszont mind az aktinszálak, mind a vinculin adhéziók mennyiségét a terjedésükhöz igazítják. Ahhoz, hogy több betekintést nyerjünk a sejt alakjának a myoblast differenciálódásában betöltött szerepébe, a következő lépésben megvizsgáljuk a sejt képarányának alakulását a proliferáció (P0 6 óra és P2 48 óra) és a differenciálódás (D2 96 óra) szakaszában (ábra. 1 óra). Amint az ábrán látható. 1I, J, eredményeink azt mutatják, hogy a myoblastok oldalarányát 0,40 0,16 (P0) – ról 0,36 0,09 (P2) és 0,24 0,07 (D2) – re növelték, ami arra utal, hogy a myoblastok jelentősen megnyúltak, és 1:4 oldalarányt alkalmaznak a differenciáláshoz. Ezenkívül eredményeink azt mutatták, hogy az aktin stressz szálak erősen orientáltak a D2-nél (kiegészítő ábra. 4A,B), amely szintén jelentős nukleáris nyúlásoknak felel meg (Kiegészítő ábra. 4C). Összességében eredményeink azt mutatják, hogy az F-aktin hálózatot a myoblast morfológia módosításai modulálják, és azt jelzik, hogy a myoblastok differenciálódása 1:4 képarányig szükséges a sejtek megnyúlásához.
az aktinhálózat és a mag térbeli szerveződését a myoblast morfológia irányítja
a myoblast morfológiák belső változékonyságát tapadó mikrominternák segítségével szabályoztuk a terjedési területeik szabványosítására és alakjuk szabályozására. Mikrokontakt nyomtatási technikával20 létrehoztuk a fibronektin (FN) ragasztós mikromintáit, amelyek állandó területe 1600 6m2 és különböző geometriák. Mi használt lekerekített (CSI = 1), négyzet (CSI = 0,79), háromszög (CSI = 0,60) és a különböző képarányok téglalap (CSI = 0,50 és 0,34 az 1: 4 és 1:7 képarány, ill.) FN mikropatternák az egyes myoblastok tenyésztéséhez (ábra. 2A). A mikrominták különböző geometriái lehetővé tették a myoblast alakzat in vitro standardizálását széles tartományban, és a terjedési terület szabályozását.
az aktin hálózat és a mag térbeli szerveződését a myoblast morfológia irányítja. (A) Epifluoreszcens képek a c2c12 sejtekről, amelyeket 1600 6m2-es fibronektin (FN) mikrominterneken termesztenek, és F-aktin (zöld), sejtmag (kék) és vinculin (piros). A kör alakú, négyzet alakú, háromszög alakú és téglalap alakú (1:4 és 1:7 képarány) mikrominták a CSI = 1, 0,79, 0,60, 0,50 és 0,34 értékeknek felelnek meg. A sávok mérete 20 fő. B) az aktinszálak térbeli szerveződésének tipikus példái mikroszálas C2C12 sejtekben, amelyek orientációjuk szerint színkóddal vannak ellátva. A sávok mérete 20 fő. (C) az aktinhálózat tájolása lekerekített (n = 12 fekete), négyzet alakú (n = 11 piros), háromszög alakú (n = 19 kék) és 1:4 (n = 18 zöld) vagy 1:7 (N = 11 Rózsaszín) téglalap alakú mikropatter myoblastokban. (D) A nukleáris oldalarány és (E) a nukleáris orientáció alakulása a myoblastok különböző geometriáihoz (10 db / 15 db CSI).
a sejtgeometria szerepének kvantitatív meghatározásához az aktin citoszkeleton térbeli szerveződésében meghatároztuk az aktinszálak orientációját az egyes sejtformákhoz34, 35. A phalloidinnal festett aktinszálakat tájolásuk függvényében színkóddal színeztük, a színgradiens világoskéktől kezdve, amikor az aktinszálakat a vízszintes tengelyre merőlegesen szervezték (0!), a vöröset (+90!) vagy a narancsot (-90!). 2B). Megfigyeltük, hogy a lekerekített sejtekben az aktinszálak véletlenszerűen oszlanak el, orientációjuk -90-től + 90-ig terjed. A négyzet alakú sejtek aktinszálakat mutattak ki három fő szögtartományban: 0° 25°, 50° 90° -50° -90°, mivel háromszög alakú sejtek mutatott aktin szálak elsősorban szervezett szerint a három oldalán a minta, 0°, 60° -60°. Érdekes módon azt találtuk, hogy az aktinszálak erősen orientáltak a hosszú cellatengellyel párhuzamosan (0 db) az 1:4 (CSI = 0,50) és 1:7 (CSI = 0,34) képarányú négyszögletes cellák esetében. A vinculin tartalmú adhéziók számszerűsítése nem mutatott statisztikai különbséget a sejtmorfológiák közötti adhéziós területeken (kiegészítő ábra. 5A-C), míg a fokális adhéziók orientációját a sejt alakja modulálta (kiegészítő ábra. 5D, E), amint azt az aktinszálak esetében megfigyelték. Eredményeink azt mutatják, hogy mind az 1:4, mind az 1:7 téglalap alakú myoblastok lehetővé teszik az aktin citoszkeleton erősebb szerveződését (ábra. 2c) és fokális adhéziók, ami arra utal, hogy a myoblast megnyúlása kontraktilis dipólusok kialakulásához vezet.
figyelembe véve a sejtmag szerepét a myoblastok differenciálódásában a myotubes-ben, ezután megvizsgáltuk, hogy a sejt alakjának és a citoszkeleton architektúrájának változásai képesek-e modulálni a nukleus alakját és orientációját36. Megállapítottuk, hogy a nukleáris képarány jelentősen megnőtt a CSI csökkentésével (ábra. 2D). Valójában a kör alakú mikromintákon lévő lekerekített sejtek (CSI = 1) lekerekített magot mutattak, amelyet 1,11 0,06 átlagos oldalarány jellemzett, míg az 1:4 (CSI = 0,50) és 1:7 (CSI = 0,34) oldalarányú téglalap alakú sejtek nagy magdeformációkat mutattak, 1,39 0,21, illetve 2,19 0,23 oldalaránnyal. Azt is észrevettük, hogy a mag orientációját a sejtmorfológia modulálta (ábra. 2E). Megállapítottuk, hogy a lekerekített, négyzet alakú és háromszög alakú sejtekben a mag tájolása széles szögtartományt ölel fel (~15-től ~60-ig), átlagos tájolása ~40 (kör alakú, n = 11), ~33 (négyzet, n = 14) és ~43 (háromszög, n = 10) volt a vízszintes tengelyhez képest. A négyszögletes sejtek esetében az eredményeink azt mutatták, hogy a sejtmag a sejttengellyel párhuzamosan orientálódott, átlagos szöge ~14 (1:4, n = 15) és ~2 (1:7, n = 10) volt.
A sejtek megnyúlása fokozza a myoblast kontraktilitását
a következő kérdés, amellyel foglalkoztunk, az volt, hogy a sejt alakjának változásai hogyan befolyásolják a myoblast kontraktilitását. A kérdés megválaszolásához vontatási erő mikroszkópiát (TFM) használtunk a mikropatterrel ellátott myoblastok által kifejtett vontatási feszültségek meghatározására. Amint az ábrán látható. 3A megfigyeltük, hogy a maximális feszültségeket a mikropatter myoblastok végtagjain fejtettük ki, függetlenül a sejt alakjától. Amint azt korábban más sejttípusokon37 megfigyeltük, a kontraktilis stressz elsősorban a mikropatternált myoblastok sarkaiban (négyzetek és háromszögek) vagy mindkét végtagján (1:4 és 1:7 téglalapok) halmozódott fel. Számszerűsítettük az egyes mikropatter myoblastok által kifejtett teljes stresszt annak meghatározására, hogy a sejt morfológiája modulálja-e a sejt kontraktilitását. Amint az ábrán látható. 3B, a lekerekített cellák (CSI = 1) összesen 170,7 (CSI = 46,4 N/m2), míg a téglalap alakú cellák (CSI = 0,34, képarány 1:7) összesen nagyobb (295,9 (656) feszültséget fejtettek ki.8 N / m2), ami arra utal, hogy a hosszúkás sejtformák fokozott vontatási feszültségekhez vezetnek. Továbbá azt tapasztaltuk, hogy a téglalap alakú cellák (CSI = 0,34, képarány 1:7) a nagyobb maximális feszültségértéket mutatták (684,3 657,8 pa, ábra. 3C), míg a lekerekített myoblastok a legalacsonyabb maximális stresszértéket mutatták (351,5 623,6 pa). Figyelembe véve, hogy a kontraktilis feszültségeket a sejt perifériáján fejtettük ki, és hogy a CSI csökkentése fokozott vontatási feszültségeket eredményez, a maximális feszültségértéket a tömegközépponttól a sejt végéig tartó távolság függvényében ábrázoltuk (ábra. 3D), ami 22,6 fő (CSI = 1), 28,28 fő (CSI = 0,79 fő), 33,98 fő (CSI = 0,60 fő), 41,23 fő (CSI = 0,50 fő) és 53,45 fő (CSI = 0,34 fő). Amint az ábrán látható. 3D-ben azt találtuk, hogy a maximális kontraktilis stressz lineárisan nőtt a centroidtól a sejt végéig tartó távolsággal (R2 = 0,958, n = 65), ami arra utal, hogy a myoblastok hosszúkás morfológiái több vonóerőt fejtenek ki.
annak érdekében, hogy meghatározzuk az aktomiozin hálózat hozzájárulását a kontraktilis erők kialakulásához a myoblastokban, a C2C12 sejteket a G-aktin megkötő gyógyszerrel, a Latrunculin B-vel (LatB) és a miozin II inhibitor Blebbistatinnal (Bleb) kezeltük. A phalloidinnal kezelt myoblastok azt mutatták, hogy a LatB-vel és a Bleb-vel kezelt sejtek diffúz aktinhálózatot mutattak (ábra. 3E), bizonyítva, hogy mindkét gyógyszer jelentősen befolyásolta az F-aktin szervezetét. A TFM-et mindkét gyógyszerrel kezelt mikropattern myoblastokon használtuk, hogy meghatározzuk az aktomyosin hálózat szerepét a kontraktilis erők kialakulásában a különböző geometriájú myoblastokban. Eredményeink azt mutatják, hogy a LatB kezelés a kontraktilitás jelentős csökkenését okozta, amely a sejt megnyúlásával nőtt. Valójában a lekerekített sejtek a kontraktilis stressz ~62% – os veszteségét mutatták, míg a LatB-vel kezelt 1:4 és 1: 7 téglalap alakú sejteket ~88%, illetve ~86% kontraktilis stressz veszteség jellemezte (ábra. 3F). Továbbá, azt találtuk, hogy a kontraktilis stressz 1:A Bleb-vel kezelt 4 téglalap alakú sejtet a kontraktilis erő ~80% – ának elvesztése jellemezte, bizonyítva, hogy a miozin II molekuláris motorok a myoblast kontraktilis erők kulcsszereplői.
Összességében ezek az eredmények azt mutatják, hogy az aktomyosin hálózat kontraktilitása a hosszúkás myoblastokban fokozódik a párhuzamos aktomyosin rostok sűrű hálózatának létrehozásával.
A sejtpárok kontraktilitása nőtt a fúziójuk és a hosszúkás mikropatternákon történő emelés után
annak megértéséhez, hogy a myoblast morfológiája hogyan befolyásolhatja a myotubák kontraktilis tulajdonságait, két myoblast minimális modelljét vesszük figyelembe. Először meghatároztuk a különböző formájú mikromintákra bevont P1 (24 h proliferációs közegben) sejtdublettek által kifejtett vonóerőt (kiegészítő ábra. 6A). A CSI széles tartománya között nem volt statisztikai különbség a kontraktilis stresszben (kiegészítő ábra. 6B), az aktin hálózat jól meghatározott orientációja ellenére (kiegészítő ábra. 6C) és a magok (kiegészítő ábra. 6D, E) 1:4 és 1:7 téglalap alakú mikromintákon. Ezen megfigyelés alapján számszerűsítettük a körkörös (CSI = 1) és négyszögletes (CSI = 0,50, 1:7 képarány) FN mikrominterneken tenyésztett sejtdubletek által kifejtett kontraktilis stresszt további öt nap alatt (D5, ábra. 1H) differenciáló közegben. A MitoTracker Red CMXRos-t (Thermofisher Scientific), élő mitokondriális festést használtuk annak biztosítására, hogy a myoblast dublettek összeolvadjanak (ábra. 4A) 38. Amint az ábrán látható. 4B, C, Azt találtuk, hogy a teljes kontraktilis stressz kissé megnövekedett a kör alakú mikropinternákon növesztett fuzionált sejtdubleteknél (267 64 pa), összehasonlítva a kör alakú, nem fuzionált sejtdubletekkel (157 37 pa), míg az fuzionált hosszúkás dubletteknél több mint kétszer nagyobb volt a kontraktilis (543 193 pa), mint a nem fuzionált hosszúkás dubletteknél (211 73 pa). Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a sejtek összehúzódása a sejtfúzió után növekedett, és a hosszúkás morfológiák esetében jelentősen javult.
a sejtpárok kontraktilitása nőtt a fúziójuk után és a hosszúkás mikropatternákon. (A) A c2c12 sejtpárok Epifluoreszcens képei nem fuzionált (D) és fuzionált (FD) kör alakú és téglalap alakú (1:7 képarány) FN mikromintákon, és mitokondriumokra festettek Mito trackerrel. A sávok mérete 20 fő. B) A c2c12 sejtpárok által a kör alakú és négyszögletes FN mikromintákra fuzionált kontraktilis feszültség reprezentatív térképei. C) a nem fuzionált (D), (sima rudak) és fuzionált (FD, hasított rudak) c2c12 sejtpárok teljes feszültségének alakulása kör alakú (szürke) és négyszögletes (lila) FN mikrominterneken. D kör: n = 8; FD kör: n = 5; D téglalap: n = 6 és FD téglalap: n = 8. ** p < 0.01.
az aktomiozin kontraktilitása elősegíti a myotube differenciálódását
ezután megkérdeztük, hogy a myoblastok aktomiozin kontraktilitása befolyásolhatja-e a myotube differenciálódását. A c2c12 myoblastokat FN-bevonatú szubsztrátokon tenyésztettük proliferációs közegben 2 napig (P2, ábra. 1H) a celluláris összefolyás eléréséhez. Ezután vagy LatB-t vagy Bleb-et adtunk hozzá 30 percig, majd a proliferációs táptalajt differenciáló táptalajjal helyettesítettük. 4 nap elteltével differenciáló közegben (D4, ábra. 1H), A C2C12 sejteket rögzítették és festették a DNS és a TroponinT, a differenciálódás markere (ábra. 5). A LatB és Bleb kezelések hatását alfa-aktinin festéssel értékeltük a Latrunculin B-vel (+LatB) és blebbistatinnal (+Bleb) kezelt kontroll myotubes (CTRL) és myotubes. Amint azt a kiegészítő ábra. 7, a kontroll myotubes tipikus csíkos Z-sávos mintákat mutat, míg a LatB és a Bleb kezelések zavarják a myotubes csíkozási mintáit. Kontroll myotubes (CTRL) jellemeztük átlagos képarány 7,99 3,38 (ábra. 5A) és a pozitív Troponin T terület 51,7 6,6% (ábra. 5B). Eredményeink azt mutatják, hogy a LatB és a Bleb kezelések a Troponin T terület hányadát 44,9 6,2% – ra, illetve 44,4 5,1% – ra csökkentették. Ezenkívül azt találtuk, hogy a fúziós index statisztikailag alacsonyabb volt a LatB (27 6%!) és a Blebb-vel kezelt (29 3%) sejteknél, mint a kontrollsejteknél (38 5%!!), erősítve az aktomiozin kontraktilitásának szerepét a myoblast differenciálódásban (ábra). 5C). Összességében ezek az eredmények azt mutatták, hogy a myoblastok aktomyosin kontraktilitása elősegíti a myotube differenciálódását.
az aktomiozin kontraktilitása elősegíti a myotube differenciálódását. (A) A myotube képarány eloszlása 4 nap elteltével differenciáló közegben (n = 114, R2 = 0,915). B) a troponin T pozitív területének százalékos aránya és C) a kontrollsejtekben (CTRL), LatB-ben és Bleb-ben kezelt sejtek fúziós indexének alakulása (n = 20 mindegyikre). (D) a kontroll myotubes (Ctrl), LatB és Bleb-kezelt Myotubes tipikus epifluoreszcens képei 4 nap után differenciálódó közegben képződnek. A Myotubes-t DNS-re (kék) és troponin T-re (piros) immunszonálták. A sávok mérete 100 6m. * p < 0,05, **p < 0,01 és n.s. nem szignifikáns.
a Myoblast megnyúlása kiváltja a Yap nukleáris exportot, amely elengedhetetlen a myoblastok myotubákba történő differenciálódásához
a myotube differenciálódását szabályozó intracelluláris mechanizmusokba való betekintés érdekében figyelembe vesszük a YAP szerepét azáltal, hogy meghatározzuk annak lokalizációját a citoplazmában vagy a myoblastok magjában, ahol kötődik a myoblastokhoz és a myoblastokhoz aktiválja a tead transzkripciós faktorokat39. Ennek érdekében számszerűsítettük a citoplazmatikus/nukleáris YAP arányt mikropatternált myoblastokban (ábra. 6A és kiegészítő ábra. 8). Cell nyúlás 1:4 és 1: 7 négyszögletes mikrominták növelték a citoszol/nukleáris YAP arányt (ábra. 6B), ami arra utal, hogy a sejtek megnyúlása az aktomyosin hálózat által kifejtett nukleáris nyomóerőkön keresztül kiváltja a YAP nukleáris exportot40. Annak ellenőrzésére, hogy a Yap lokalizációja a citoplazmában vagy a magban összefügg-e a differenciálódási folyamat meghatározott szakaszaival, a Yap-ot c2c12 sejtekben festettük a proliferációs lépés 24 órája (P1) és 48 órája (P2), valamint a differenciálódási lépés 96 órája (D2) és 264 órája (D9) után (ábra. 6C és kiegészítő ábra. 9). Érdekes módon eredményeink azt mutatták, hogy a citoplazmatikus/nukleáris YAP Arány 0,37 0,07-ről 0,68 0,06-ra nőtt a P2-nél és 0,67 0,06-ra a D2-nél, majd 0,42 0,10-re csökkent a D9-nél (ábra. 6D). Érdekes módon a citoplazmatikus / nukleáris YAP arány a D9-nél statisztikailag nem különbözött a P1 értékektől, ami arra utal, hogy a differenciált myotubes citoplazmatikus/nukleáris YAP aránya hasonló a myoblastokéhoz. Ezen eredmények igazolására a myoblastokat a P1 (24 h) proliferációs szakaszban és a D2 (96 h) differenciálódási szakaszban gyűjtöttük be, és izoláltuk citoplazmatikus és nukleáris anyagaikat. Bicinchoninsav (BCA) fehérje vizsgálatot végeztünk, és a citoplazmatikus és nukleáris extrakciókban lévő fehérjéket elektroforézissel elemeztük (ábra. 6E). Western blot eredményeink azt mutatták, hogy a citoplazmatikus/nukleáris YAP Arány 0,62-ről 0,08-ra nőtt P1-nél 0,87 0,24-re D2-nél (ábra. 6F). A YAP biokémiai mennyiségi meghatározása jelentős Yap nukleáris exportot mutatott a C2C12 sejtek megkülönböztetésében, és megerősítette eredményeinket.
a Myoblast megnyúlása kiváltja a Yap nukleáris exportot, ami elengedhetetlen a myoblastok myotubokká történő differenciálódásához. (A) Epifluoreszcens képek c2c12 sejtek nőtt FN mikropinterns 1600 6m2 és immunszaporított YAP. A sávok mérete 20 fő. (B) citoplazmatikus-nukleáris YAP arány a különböző myoblast morfológiákra (n = 10 mindegyikre). C) A Yap-ra immunizált összefolyó c2c12 sejtek Epifluoreszcens képei a proliferációs szakasz 1.napján (P1, 24 h), valamint a differenciálódási szakasz 2. napján (D2, 96 h) és 9. napján (D9, 264 h). A sávok mérete 100 6m. (D) citoplazmatikus-nukleáris YAP Arány P1 (n = 50), P2 (n = 30), D2 (n = 30) és D9 (n = 30) esetén. E) A Yap (65 kDa) expresszió Western blot analízise a C2C12 proliferációban és differenciálódásban. (F) citoplazmatikus-nukleáris YAP Arány (átlag 6 S. D.) a proliferáció és a differenciálódás során (3 replikáció minden egyes állapotra 20,106 sejt/replikációval). (G) citoplazmatikus-nukleáris YAP Arány D2-nél és (H) fúziós index a kontroll (CTRL) és leptomicinnel (LMB) kezelt sejteknél D4-nél. ** p <0,01, ****p < 0,0001 és n.s nem szignifikáns.
ezen eredmények alapján értékeltük a Yap szerepét a leptomycin B alkalmazásával, hogy blokkolja az aktív exportot a magból azáltal, hogy közvetlenül kötődik az exportin141-hez. Alberto Elosegui-Artola és munkatársai a közelmúltban kimutatták, hogy a leptomycin B (LMB) hatékonyan használható annak tanulmányozására, hogy a citoszkeleton által kifejtett kontraktilis erők hogyan hajtják végre a Yap nukleáris transzlokációt39. A c2c12 myoblastok P2-nél (48 h) LMB-vel történő kezelésével azt találtuk, hogy a citoplazmatikus / nukleáris YAP Arány szignifikánsan alacsonyabb volt az LMB-vel kezelt sejtekben D2-nél (96 h, ábra. 6G), ami arra utal, hogy a YAP főleg a magon belül koncentrálódik, amikor a nukleáris export gátolva van. Ezenkívül eredményeink azt mutatták, hogy az LMB-vel kezelt sejtek D4-es fúziós indexe (ábra. 6H) nagyon alacsony volt (3,8 6db.5%) a kontrollcellákhoz képest (42,4 6,1%), ami azt mutatja, hogy a c2c12 differenciáláshoz aktív nukleáris exportra van szükség.