- absztrakt
- 1. Bevezetés
- 2. Anyagok és módszerek
- 2.1. Állatok
- 2.2.
- 2.3. Immunfluoreszcens festési vizsgálat
- 2.4. Western Blot
- 2, 5. Kvantitatív (valós idejű) polimeráz láncreakció (valós idejű PCR)
- 2.6. Statisztikai elemzés
- 3. Eredmények
- 3.1. Az Ndrg2, a GFAP és az S100 által jelzett asztrociták eloszlása a különböző agyi régiókban
- 3.2. Az NDRG2, a GFAP és az S100 által jelzett asztrociták morfológiája különböző agyi régiókban
- 3.3. Az NDRG2, a GFAP és az S100 MHz Kolokalizációja a különböző agyi régiók Asztrocitáin belül
- 3.4. Az expresszió Ndrg2, GFAP, S100 Ft fehérjék különböző agyi régiókban
- 4. Vita
- az adatok rendelkezésre állása
- közzététel
- összeférhetetlenség
- A szerzők hozzájárulása
- elismerések
- kiegészítő anyagok
absztrakt
az asztrociták különböző morfológiai jellemzőkkel rendelkeznek attól függően, hogy melyik agyi régióban találhatók. Azonban a jelenlegi asztrocitikus markerek egyike sem képes sikeresen címkézni az összes alpopulációt. Ezért kritikus fontosságú a megfelelő marker azonosítása egy adott tudományos vizsgálathoz. Itt összehasonlítottuk három asztrocita marker eloszlását és fehérje expresszióját: Ndrg2, GFAP és S100, az agykéregben, a hippokampuszban és a thalamusban. Az NDRG2-és S100-pozitív asztrociták egyenletesebben oszlottak el, mint a GFAP-pozitív asztrociták az egész nagyagyban. Az NDRG2 és az S100 6DC immunreaktivitás a dorsalis cortexben és a thalamusban volt a legerősebb, míg a GFAP immunreaktivitás a hippokampuszban volt a legerősebb. A felnőtt egerekben az NDRG2, a GFAP és az S100 ons expressziós szintje a cortexben, a hippocampusban és a thalamusban volt a legmagasabb. Asztrocita morfológiát is kimutattunk, és azt találtuk, hogy a corpus callosumban és az agyi kocsányban a GFAP-pozitív asztrocitákat több és hosszabb folyamattal találták meg, mint az NDRG2 – és S100-pozitív asztrocitákat. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy az NDRG2 és az S100-AST megfelelőbben használják az asztrociták teljes eloszlásának és számának változásainak megjelenítésére, valamint az asztrociták jelölésére a kéregben és a talamuszban. A GFAP-ot azonban megfelelőbben használják a corpus callosum, az agyi kocsány és a hippocampus asztrocitáinak címkézésére. Ezek az eredmények segítik a kutatókat a megfelelő asztrocita marker kiválasztásában, és az asztrociták immunológiai tulajdonságainak különbségeit sugallják a szövet alapján, amelyben megtalálhatók.
1. Bevezetés
az asztrocitákat régóta kiegészítő sejteknek tekintik, amelyek csak trofikus, metabolikus és szerkezeti támogatást nyújtanak az idegsejteknek . Az utóbbi években azonban kiterjedt kutatások kimutatták, hogy döntő szerepet játszanak az agyi fiziológiai és patológiai funkciókban. Az asztrociták segítenek az ion homeosztázis és a vér-agyi gátak fenntartásában, a szinapszis kialakulásában és eltávolításában, valamint az agyi véráramlás szabályozásában és a neurotranszmitter újrahasznosításában, a glutamát excitotoxicitásában és az antioxidáns stressz szabályozásában . Fontos, hogy az asztrociták morfológiai, populációs és funkcionális eltérésekkel rendelkeznek a különböző agyi régiókban . Ezért az asztrociták polimorf és több alcsoportjának legmegfelelőbb markerének azonosítása kritikus fontosságú az asztrocitikus multifunkció kutatásához.
a glia fibrilláris savas fehérje (GFAP) a leggyakrabban használt asztrocitikus marker, de mint a citoszkeletont alkotó fő közbenső filament, a GFAP a teljes asztrocita térfogatnak csak körülbelül 15%-át immunizálta , és az asztrociták több mint 40% – át GFAP-negatívnak találták a felnőtt patkány hippokampuszában . Ezenkívül a GFAP rosszul jelölte meg a protoplazmatikus humán asztrocitákat, és a rostos asztrociták késői fejlődésében expresszálódott .
egy másik általánosan használt asztrocitikus marker az S100++, a citoplazmában gazdag Ca2+ kötő peptid, valamint az asztrociták magja, amely részt vesz a sejtciklus szabályozásában és a citoszkeleton módosításában . Ugyanakkor az S100-AST az érett oligodendrociták szubpopulációjában, a choroid plexus hámsejtjeiben és néhány neuronban is kifejezik . Az asztrociták címkézésében a GFAP és az S100 MHz hiányosságai pontatlanságokhoz vagy akár hibákhoz vezethetnek az asztrociták funkcióinak feltárásában.
az n-Myc downstream-szabályozott 2. gént (NDRG2) először egy normál emberi agyi cDNS könyvtárban fedezték fel PCR-alapú szubtraktív hibridizációs módszerrel . Ez egy tumorszuppresszor és sejtstresszhez kapcsolódó gén, amely a sejtek proliferációjához és differenciálódásához kapcsolódik . Az NDRG2 széles körben expresszálódik az agykéregben, a szaglóhagymában, a midcerebrálisban, a hippocampusban és a thalamusban . A legfontosabb, hogy az NDRG2 kifejezetten az agy asztrocitáiban expresszálódik . Így az NDRG2-t új asztrocita markernek tekintik, különösen az érett, nem reaktív és nem proliferáló asztrociták esetében . Azt azonban, hogy az ndrg2 megbízhatóbb-e a GFAP-nál és az S100-nál, mint asztrocitikus marker, valamint eloszlásuk és expressziójuk különbségeit a különböző agyi régiókban, nem jelentették.
a jelenlegi vizsgálatban összehasonlítottuk az ndrg2, GFAP és S100 Astrocytás markerek eloszlását, fehérje expresszióját és kölcsönös kolokalizációját az egerek teljes agyában. Arra törekedtünk, hogy azonosítsuk az asztrociták legmegfelelőbb markerét a különböző agyi régiókban.
2. Anyagok és módszerek
2.1. Állatok
fiatal, felnőtt és idős c57bl / 6 hím egereket 1 hónapos, 3 hónapos, 6 hónapos, 9 hónapos és 12 hónapos korukban kaptak a Central South University kísérleti Állatközpontjából. Az állatok szabadon ehettek és ihattak, 25-1.C hőmérsékleten tartották őket, és 12:12 órás Világos-Sötét körrel tartották őket, hogy szimulálják az állat cirkadián ritmusát. Minden erőfeszítést megtettünk az állatok szenvedésének minimalizálása és a felhasznált állatok számának csökkentése érdekében. Minden állatkísérleti eljárás a Central South University Animal Care and Use Committee (Kína) állatkísérleti Etikai Bizottsága által jóváhagyott protokollt követte.
2.2.
a HT22 sejteket (neuronális sejtvonal) és az ma1800-57 sejteket (asztrocita sejtvonal) Dulbecco módosított Eagle Táptalajában (DMEM, HyClone) tenyésztettük, amely 10% magzati szarvasmarha szérumot (FBS, Gibco), 50 egység/mL penicillint és 50 egység/mL sztreptomicint tartalmazott. Az OLN-93 sejteket (egy oligodendrogliális sejtvonalat) DMEM-ben tartottuk, kiegészítve 10% FBS-sel, 2 mM-es glutaminnal, 50 E/mL penicillinnel és 50 ~ g/mL sztreptomicinnel. A sejtek mindegyikét 37cc-n tartották 95% légköri levegő és 5% CO2 keverékében. A HT22 sejteket, az OLN-93 sejteket és az MA1800-57 sejteket diákon vetettük be, és a mikrotubulus-asszociált protein 2 (MAP2), az Alzheimer-tubulin és a GFAP elleni antitestekkel festettük őket.
2.3. Immunfluoreszcens festési vizsgálat
miután az egereket 50 mg/kg nátrium-pentobarbitállal érzéstelenítettük, agyukat kivontuk és 0,9% hideg heparinizált sóoldattal és 4% paraformaldehiddel rögzítettük. A postfixáció után a cerebrumokat 20% – os szacharóz és 30% – os szacharóz oldatban egymás után dehidratáltuk. A 10 km vastagságú szeleteket Leica CM1900 fagyasztott szeletelővel állítottuk elő. Az agyi szakaszokat 1% H2O2-ben inkubáltuk 15 percig, 0,3% Triton X-100-ban pedig 15 percig, az egyes kezelések közötti PBS posztinkubációban 3 db-os mosással. A szekciókat ezután 5%-os normál kecskeszérumban blokkoltuk 1 órán át szobahőmérsékleten, majd egy éjszakán át inkubáltuk 4 kb-n egy primer antitestekkel ellátott párásító dobozban az alábbiak szerint: egér anti-GFAP antitest (#3670, 1:500, sejtjelző technológia); nyúl anti-NDRG2 antitest (#5667, 1:200, sejtjelző technológia); egér anti-NDRG2 antitest (#DA281-6A5, 1:100, Sigma); nyúl Anti-S100#2017-1, 1:500, epitomics); egér anti-glutamin szintetáz (GS) antitest (#mab302, 1:200, Millipore); nyúl anti-MAP2 antitest (#ab32454, 1:500, abcam); és egér anti-6199-tubulin antitest (#t6199, 1:500, szigma). Ezután a szekciókat Alexa-488 (zöld, Invitrogén) és Alexa-647 (piros, Invitrogén)-konjugált szamár anti-nyúl vagy szamár anti-egér másodlagos antitestek keverékével inkubáltuk 2 órán át sötétben szobahőmérsékleten. 4,6-Diamidino-2-fenilindolt (DAPI) (ZLI-9557, Zsbio) használtak a magok festésére. A szekciókat 50% glicerinnel szereltük fel. Végül a metszeteket egy Olympus BX51 (Japán) fluoreszcens mikroszkóp segítségével nézték meg és fényképezték le. A vizsgálatunkban használt antitesteket széles körben használták korábbi vizsgálatainkban és más kutatók is, és ezeknek az antitesteknek az érzékenysége és specifitása megerősítést nyert.
2.4. Western Blot
a cortexet, a hippocampust és a thalamust c57bl/6, 1 hónapos, 3 hónapos, 6 hónapos, 9 hónapos és 12 hónapos egerekből gyűjtötték. A mintákat RIPA pufferben homogenizáltuk, majd a fehérjeminták koncentrációját BCA Protein Assay Kit (Pierce Biotechnology, USA) segítségével mértük. A fehérjemintákat 10%-os SDS-PAGE (SDS-PAGE Gel kit, CW0022S, Kína) választotta el, és elektromosan továbbították a polivinilidén-difluorid (PVDF) membránokra. Az SDS-PAGE gélkészlet összetevői közé tartozott a 30%-os Acr-Bis, az SDS-oldal elválasztó Gélpuffer, az SDS-oldal egymásra rakó Gélpuffer, az APS (ammónium-perszulfát) és a TEMED (N, N, N’, N’ – tetrametil-etilén-diamin). Ezt követően a membránokat tbst-ben hígított 5% zsírmentes száraz tejben blokkoltuk (TBS 0,05% Tween 20-mal) 1 órán át szobahőmérsékleten, majd specifikus primer antitestekkel inkubáltuk: egér anti-GFAP antitest (#3670, 1:1000, sejtjelzés technológia); nyúl anti-NDRG2 antitest (#5667, 1:1000, sejtjelzés technológia); nyúl anti-S100 antitest (#2017-1, 1:1000, Epitomics); és nyúl anti-GAPDH antitest (#5174, 1:1000, sejtjelzés technológia) egyik napról a másikra 4 C. a membránokat ezután inkubáltuk egy HRP-konjugált másodlagos anti-nyúl vagy anti-egér antitest (Thermo tudományos, USA) 2 H. a kemilumineszcens jeleket Western Lightning kemilumineszcens reagens plus (PerkinElmer Life Sciences) alkalmazásával fejlesztették ki; Wellesley, MA) és egy képelemző LI-COR Odyssey rendszer (LI-Cor Biotechnology, USA) által detektált. A fehérjeszalagok immunreaktivitását kvantitatívan elemeztük a Bio-Rad adapted Image Lab által. A sávsűrűség értékeit gapdh-ra normalizáltuk.
2, 5. Kvantitatív (valós idejű) polimeráz láncreakció (valós idejű PCR)
a cortexet, a hippocampust és a thalamust c57bl/6, 1 hónapos, 3 hónapos, 6 hónapos, 9 hónapos és 12 hónapos egerekből gyűjtöttük össze. A teljes RNS-t transzol Up Plus RNS Kit (kódszám) segítségével izoláltuk. ER501-01, Transgen, Kína) és nanodrop 2000 segítségével számszerűsítve. Ezután 1000 ng teljes RNS-t reverz transzkripcióval írtunk át egy 20-as reakcióban 62-nél (C) 15 percig, majd 85-öt (C) követett 5 másodpercig egy Transzszkript segítségével (QPCR kódszám). AT341, Transgen, Kína). A készlet komponensei közé tartozott egy 5 db-os transzkriptumú, minden az egyben Supermix qPCR-hez (Transzkriptumú, minden az egyben, minden az egyben, RNáz Inhibitor, rögzített Oligo(dT)18 alapozó, Random Primer(N9), dntps, puffer), egy 5 db-os transzkriptumú, minden az egyben, nem RT kontroll SuperMix qPCR-hez, egy Gdns eltávolító és egy RNase-mentes víz. Negatív kontrollként a qPCR-re vonatkozó 5 db-os transzszkriptumú, minden az egyben no-RT kontroll Szupermixet használtuk. Valós idejű PCR-t végeztünk egy 20 6L reakció szerint a gyártó kézikönyve Transstart Tip Zöld qRNA SuperMix (kódszám. AQ141, Transgen, Kína). Az alkalmazott mRNS primer szekvenciák az 1. táblázatban találhatók. A reakciót 94-30 mp-en, majd 40-94-5 mp-en, 60-15 mp-en és 72-19 mp-en végeztük a ViiA7 valós idejű PCR-detektáló rendszeren (2720 termikus ciklikus, alkalmazott Biosystems). A relatív mRNS expresszióból származó primereket és szekvenciákat a képlet segítségével elemeztük .
|
||||||||||||||||||||||||
2.6. Statisztikai elemzés
statisztikai teszteket végeztünk PRISM v7.0 szoftverrel (GraphPad). Két csoport összehasonlítását hallgatói t-tesztekkel végeztük. A különböző csoportok közötti összehasonlításokat egyirányú ANOVA alkalmazásával végeztük Tukey posttestjével. Az összes értéket középértékként (SD) határoztuk meg. A p<0,05 értékeit statisztikailag szignifikánsnak tekintették.
3. Eredmények
3.1. Az Ndrg2, a GFAP és az S100 által jelzett asztrociták eloszlása a különböző agyi régiókban
az egerek cerebra régióit a sejtmagok megjelölésével azonosítottuk. Ezenkívül egy megfelelő egér agyi atlaszt használtunk az elemzett specifikus régiók ellenőrzésére (1.ábra). Ezután immunfluoreszcens festéssel detektáltuk az ndrg2, GFAP és S100 (6 hónapos) felnőtt hím egerek különböző agyi régióiban az asztrociták eloszlását. Az NDRG2 – és S100-pozitív asztrociták bőségesebbek és egyenletesebbek voltak, mint a GFAP-pozitív asztrociták az egész nagyagyban (2.ábra). Az NDRG2-pozitív asztrociták a dorsalis kéregben (1.régió) és a thalamusban (5. Régió) koncentrálódtak, de kevésbé a hippocampusban (4. régió), a corpus callosumban (3. régió) és a ventrális kéregben (2. régió), és a legkevésbé az agyi kocsányban (6. Régió) (2. A) és 2. b) ábra). A GFAP-pozitív asztrociták leginkább a hippokampuszban koncentrálódtak; kevesebb volt kimutatható a corpus callosum és az agyi kocsány, és szinte észrevehetetlen a dorsalis cortex, ventralis cortex és thalamus(ábra 2(A) és 2 (c)). Az S100-pozitív asztrociták leginkább a dorsalis kéregben és a thalamusban koncentrálódtak, kevésbé a hippocampusban és a ventrális kéregben, és legkevésbé az agyi kocsányban és a corpus callosumban (2(b) és 2(c) ábra). Az NDRG2-pozitív asztrociták eloszlása hasonló volt az S100-pozitív Asztrocitákéhoz.
(a)
(b)
(a)
(b)
(a)
(b)
(c)
(a)
(b)
(c)
a különböző agyi régiókban az asztrociták nem megfelelő immunaktivitást mutattak az NDRG2, GFAP és S100 (2.ábra). A dorsalis cortex és a thalamus asztrocitái erősen reagáltak az NDRG2-re és az S100-ra, de gyengén a GFAP-ra. A hippokampusz asztrocitái erősen reagáltak a GFAP-ra, és mérsékelten az NDRG2-re és az S100-ra. A ventrális kéreg, a corpus callosum és az agyi kocsány asztrocitái gyengén vagy mérsékelten reagáltak az NDRG2-re, a GFAP-ra és az S100-ra (2.táblázat).
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|
+++: erősen pozitív; ++: mérsékelten pozitív; +: gyengén pozitív.
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
az ndrg2, a GFAP és az S100 vállalkozók által jelzett asztrociták eloszlása a hím egerek különböző agyi régióiban hasonló volt az öreg hím egerekéhez (12 hónap) (3.ábra).
3.2. Az NDRG2, a GFAP és az S100 által jelzett asztrociták morfológiája különböző agyi régiókban
az asztrociták főként két típusra oszthatók: rostos asztrociták a fehér anyagban és a protoplazmatikus asztrociták a szürkeállományban. Ezért összehasonlítottuk a corpus callosum (fehérállomány, 3.régió) és a hippocampus (szürkeállomány, 4. régió) különböző markerekkel jelölt két típusának morfológiáját (4. ábra). A felnőtt hím egerek (6 hónap) eredményei azt mutatták, hogy az NDRG2 – és S100-pozitív asztrociták csillag alakú formát mutattak, amelyet nagy és kerek soma jellemez, valamint rövid és durva citoplazmatikus folyamatok, amelyeknek kevés ága volt. A GFAP-pozitív asztrociták radiális alakúak, amelyeket kis soma, hosszú folyamatok és többágú ágak jellemeznek (4.ábra). Ezenkívül a corpus callosumban és az agyi kocsányban a GFAP által jelölt asztrociták sokkal hosszabb folyamatokkal rendelkeztek, mint az NDRG2 és az S100 (5.és 7. ábra).
3.3. Az NDRG2, a GFAP és az S100 MHz Kolokalizációja a különböző agyi régiók Asztrocitáin belül
az NDRG2 majdnem kolokalizálódott a GFAP-val a ventrális kéreg, a corpus callosum és az agyi kocsány asztrocitáiban, és többnyire a GFAP-val kolokalizálódott a hippocampus asztrocitáiban (5.és 8. a) ábra). Az NDRG2-nek szinte semmilyen kolokalizációja nem volt a GFAP-val a dorsalis cortex és a thalamus asztrocitáiban (5.ábra). Az NDRG2 és az S100 a hat agyi régió asztrocitáiban csaknem teljes kolokalizációt mutatott(6.és 8. B) ábra). A GFAP és az S100-Ak jelentős kolokalizációt mutattak a ventrális kéreg, a corpus callosum és az agyi kocsány asztrocitáiban, és majdnem teljes kolokalizációt mutattak a hippocampus asztrocitáiban (7.ábra). A GFAP-nak és az S100-nak nem volt kolokalizációja a dorsalis cortex és a thalamus asztrocitáiban (7. ábra).
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
az ndrg2 és egy másik asztrocitikus készítő, a glutamin szintetáz (GS) kolokalizációját is kimutattuk az egerek cerebrum asztrocitáiban. Az ndrg2 és a GS szignifikáns kolokalizációt mutatott az asztrocitákban (S1A ábra). Az NDRG2 és a GS alapos kolokalizációt mutatott be a corpus callosum rostos asztrocitáiban és a hippocampus protoplazmatikus asztrocitáiban (S1B ábra). Az ndrg2 fehérje expresszióját a neuronális sejtvonal HT22 sejtjeiben, az oligodendroglia sejtvonal OLN – 93 sejtjeiben és az ASZTROCITIKUS sejtvonal MA1800-57 sejtjeiben is kimutatták (S2 ábra). Az NDRG2 fehérjét MA1800-57 sejtekben mutatták ki, és alig volt kimutatható HT22 sejtekben és OLN-93 sejtekben (S2A és s2b ábrák).
3.4. Az expresszió Ndrg2, GFAP, S100 Ft fehérjék különböző agyi régiókban
használtuk western blot kimutatására expressziós szintje NDRG2, GFAP, S100 Ft fehérjék három agyi régiók felnőtt hím egerek (6 hónap): az agykéreg, a hippokampusz és a thalamus (8(c) ábra). Elemeztük ezen markerek expressziós szintjét ugyanabban az agyi régióban(8.ábra (d)). A cortexben az NDRG2 expresszió szintje szignifikánsan magasabb volt, mint a GFAP és az S100 (p<0,001, p<0,05). Az S100-as expressziós szint is jóval magasabb volt, mint a GFAP (p<0,05). A hippokampuszban a GFAP expresszió szintje magasabb volt, mint az NDRG2 és az S100 (p<0).01), és az NDRG2 expresszió szintje egy kicsit kisebb volt, mint az S100 6db expressziós szint, bár a különbség statisztikailag nem volt szignifikáns. A thalamusban az S100-as expressziós szint szignifikánsan magasabb volt, mint a GFAP és az NDRG2 expressziós szint (p<0,01), míg az NDRG2 expressziós szint hasonló volt a GFAP szintjéhez.
ezután elemeztük ugyanazon marker expressziós szintjét különböző agyi régiókban(8.ábra (e)). Az ndrg2 expresszió szintje a kéregben sokkal magasabb volt, mint a hippokampuszban és a thalamusban (p<0,01), és nem figyeltek meg szignifikáns különbséget a hippokampusz és a thalamus között. A GFAP expresszió szintje a hippokampuszban volt a legmagasabb a három régió között (p<0,001, p<0,01); nem figyeltek meg szignifikáns különbséget a kéreg és a thalamus között. A thalamusban az S100-as számú expresszió szintje szignifikánsan magasabb volt, mint az agykéregben és a hippokampuszban (p<0.01), Az utóbbi kettő között nem figyelhető meg szignifikáns különbség.
az NDRG2, a GFAP és az S100-as fehérje szintjét is kimutattuk az 1 hónapos, 3 hónapos, 6 hónapos, 9 hónapos és 12 hónapos hím egerek agykéregében, hippokampuszában és thalamusában (9(A)-9(f) számok). Az ndrg2 és a GFAP fehérje szintje az agykéregben, a hippokampuszban és a thalamusban az életkor előrehaladtával fokozatosan emelkedett (p<0,05, p<0,01). Az S100-as fehérje szint az agykéregben és a thalamusban, de a hippokampuszban nem, az életkor előrehaladtával fokozatosan emelkedett (p<0.05, p<0,01, p<0,001). Az 1 hónapos, 3 hónapos, 6 hónapos, 9 hónapos és 12 hónapos hím egerek agykéregében, hippokampuszában és talamuszában az ndrg2, GFAP és S100-as mRNS-szintek megegyeztek a fehérjeszintek szintjével (p<0,05, p<0,01, 9(g)-9(I)).
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
(h)
(i)
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
(h)
(i)
4. Vita
ebben a tanulmányban azt találtuk, hogy az ndrg2 és az S100 MHz által jelzett asztrociták szélesebb körben és egységesebben oszlanak meg, mint a GFAP által jelzett asztrociták a fiatal, érett és idős egerek teljes agyában. Ez arra utal, hogy az NDGR2 és az S100-Ak megfelelőbb markerek az asztrociták teljes eloszlásának és számváltozásának megfigyelésére. Továbbá az eredményeink azt mutatták, hogy a különböző agyi régiókban az asztrociták különböző szintű immunreaktivitást mutattak az NDRG2, a GFAP és az S100 Xhamsterhez képest, ami arra utal, hogy az agykéregben és a thalamusban az NDRG2 és az S100 GmbH megfelelőbb asztrocita markerek, mint a GFAP. Az asztrociták ndrg2-vel, GFAP-mal és S100-Cal szembeni immunreaktivitása szintén az általunk használt antitestek érzékenységének és specifikusságának tudható be. Továbbá, az ndrg2 és S100 által jelzett asztrociták morfológiája hasonló volt egymáshoz, de nyilvánvalóan különbözött a GFAP által jelöltektől, mivel ezek a markerek különböző citoszkeletális struktúrákat jelöltek. Az NDRG2 beszennyezi a citoplazmát és a sejtmembránokat, és gyengén beszennyezi a sejtmagot . A GFAP elsősorban a szómát és a folyamatokat festi, de a sejtmagot nem, míg az S100 6 a sejtmagot és a citoplazma egy részét és a folyamatokat . Az ndrg2, a GFAP és az S100) által jelölt asztrociták morfológiájának összehasonlításával megállapítottuk, hogy a GFAP alkalmasabb marker a corpus callosumban, az agyi kocsányban és különösen a hippocampusban található asztrociták számára. Az NDRG2 és az S100-as fő fehérjék a kéregben, illetve a thalamusban expresszálódtak leginkább. Arra következtetünk, hogy az NDRG2 alkalmasabb az agykéreg asztrocitáira, míg az S100 MHz alkalmasabb a thalamus asztrocitáira az asztrocita sűrűség számszerűsítésekor. Az ndrg2, a GFAP és az S100) különböző fehérje expressziós mintái a cortexben, a hippocampusban és a thalamusban megerősítették az asztrocitikus funkcionális heterogenitást.megállapították, hogy az asztrociták fontos szerepet játszanak a homeosztázis fenntartásában, és aktívan részt vesznek szinte minden neurológiai rendellenességben, például ischaemiás stroke-ban, traumás agyi sérülésekben, Alzheimer-kórban és Parkinson-kórban . Kimutatták, hogy az asztrocitikus morfológia, a génexpresszió és a funkció különbözött az agy különböző régióiban . A rostos asztrociták és a protoplazmatikus asztrociták két fő szubpopuláció, amelyeket morfológiájuk alapján azonosítanak . A rostos asztrociták hosszú, vékony folyamatokkal és csillagszerű megjelenéssel rendelkeznek, míg a protoplazmák számos finom folyamattal rendelkeznek, amelyek érintkeznek és a hüvely szinapszisát érintik . Érdekes módon sok gént heterogén módon fejeznek ki az asztrociták részhalmazai. Ezek a gének olyan fehérjéket kódolnak, mint a glutamát transzporterek és ioncsatornák , valamint a glutamát , a dopamin és az opioid receptorok .
a génexpresszió heterogenitása magában foglalta az asztrociták funkcionális sokféleségét. Például a glutamát felvétele különbözik a különböző részhalmazok között . Ezenkívül a spontán kalcium-oszcillációk különböznek a szomatoszenzoros kéreg különböző rétegei között. Az 1. kortikális réteg asztrocitái gyakori aszinkron Ca2 + aktivitást mutattak, míg a 2/3 réteg asztrocitái ritka szinkron Ca2+ aktivitást mutattak . Az agykéregben az asztrociták a glutamátra és a noradrenalinra reagálnak a kalcium növekedésével, míg a hippokampális asztrociták kalciumválaszokat mutatnak az ATP, GABA, glutamát, acetilkolin, prosztaglandinok és endokannabinoidok ellen . Tanulmányok azt is kimutatták, hogy a különböző agyi régiókból származó tenyésztett asztrociták eltérő kapacitással rendelkeznek a neurit növekedésének és elágazásának stimulálására . Mivel a különböző agyi régiókban található asztrociták morfológiájuk és funkciójuk eltérő jellemzőit mutatják, a különböző agyi régiókban található asztrociták legmegfelelőbb markerének azonosítása döntő fontosságú az asztrocitikus kutatók számára.
bár számos fehérjét jelentettek az asztrociták által szelektíven expresszálva, egyik sem bizonyult teljes mértékben az összes asztrocita altípusra korlátozva. A GFAP, a legszélesebb körben használt asztrocita marker, elsősorban a fehérállomány asztrocitáiban fejeződik ki a szürkeállományokkal szemben, és nem jelöli meg az asztrociták összes folyamatát . Ennél is fontosabb, hogy a GFAP-negatív asztrocitáknak vannak olyan részhalmazai, amelyek feszültségfüggő K+ áramokat mutatnak, míg a GFAP-pozitív asztrociták az idő – és feszültségfüggetlen áramok klasszikus mintázatát mutatják be .
korábbi tanulmányok azt találták, hogy az S100-AST képes volt megjelölni az asztrocitákat mind a szürke, mind a fehér anyagban; azonban néhány oligodendrocitában és neuronban is kifejeződött . Megállapították, hogy az S100 a thalamus asztrocitákban, a sejtek egyik altípusában expresszálódik, amelyek részt vesznek a Daergikus törmelék tisztításában, amelyet a Daerg terminálok degenerációja okoz a Parkinson-kórban, megkönnyítve a lizoszómák jelenlétét és az autofagoszómák kialakulását . Az asztrociták transzkriptomikus elemzése az aldehid-dehidrogenáz 1 családot, az L1 tagot (ALDH1L1) asztrocitikus markerként azonosította . Az ALDH1L1 azonban oligodendrocitákat is jelölt . Hasonlóképpen, a gerjesztő aminosav transzporterek glutamát/aszpartát transzporter (GLAST), glutamin szintetáz (GS), glutamát transzporter-1(GLT-1), vimentin, connexin 43, aquaporin 4és a sejtfelszíni glikoprotein CD44 szintén korlátozottak voltak az asztrociták címkézésekor .
az NDRG2 specifikusan expresszálódik mind patkányok, mind egerek asztrocitáiban, és összefügg a fejlődő embrionális agy növekedésével és érésével . A sejtproliferáció, a differenciálódás és a transzmembrán transzportok mellett az NDRG2 részt vesz a stresszválaszokban, a depresszióban, az ischaemiás betegségekben és a neurodegeneratív rendellenességekben is . Egerekben és emberekben az NDRG2 részt vesz a figyelemhiányos/hiperaktivitási rendellenesség (ADHD) kialakulásában, amely az agykéreg mozgásközpontjával kapcsolatos betegség . Flugge és munkatársai. az NDRG2 expresszióját észlelte az emberek, a selyemmajmok, a fák, a patkányok és az egerek agyában, és azt javasolta, hogy az NDRG2 új asztrocita marker legyen, különösen az érett, nem reaktív és nem proliferáló asztrociták esetében . Ebben a tanulmányban először észleltük az ndrg2-pozitív asztrociták eloszlási mintázatát a különböző agyi régiókban, valamint a klasszikus marker GFAP és S100) által jelölt asztrocitákkal való különbségeket.
az asztrociták és az asztrocitikus markerek megváltoztak az agy normális öregedése során. Korábbi kutatások kimutatták, hogy az asztrociták az öregedés korai szakaszában aktiválódnak, és a GFAP-pozitív asztrociták jelentős növekedését az idős egerek hippokampális régióiban találták . Mind a GFAP fehérje, mind a GFAP mRNS szintje nőtt az öregedő agy különböző részein, például az agykéregben, a hippocampusban és a kisagyban . Eltérések maradnak az S100 különböző jelentései között az öregedő agyban . Egyre több tanulmány kimutatta, hogy az NDRG2 összefügg az életkorral összefüggő rendellenességekkel, például az Alzheimer-kórral. Tanulmányunkban a GFAP és az ndrg2 mRNS szintje az agykéregben, a hippocampusban és a thalamusban fokozatosan nőtt az életkorral, míg az S100-as mRNS szintje a hippocampusban és a thalamusban az életkorral nőtt, de a kéregben nem.
meg kell jegyeznünk, hogy jelenleg az általunk tesztelteken kívül számos markert, például ALDH1L1, GLAST, GLT-1, CD44 és vimentin, használnak az asztrociták címkézésére. Tanulmányunkban csak a klasszikus agyi asztrocitákat hasonlítottuk össze az új javasolt marker NDRG2-vel és a leggyakrabban használt markerekkel: GFAP, S100, és GS a cerebrumban.végezetül, a tanulmányunk azt mutatja, hogy az NDRG2 és az S100 a megfelelőbb markerek az agykéregben és a thalamusban lévő asztrociták számára, valamint az asztrociták számának teljes eloszlásának és változásainak megfigyelésére az agyban. Eközben a GFAP jobb az NDRG2-nél és az S100-nál, ha a corpus callosumban, az agyi kocsányban és különösen a hippocampusban lévő asztrociták folyamatait és ágait jelöljük. Tanulmányunk megmutatja a legmegfelelőbb marker kiválasztásának fontosságát az asztrociták számára a különböző egér agyi régiókban, amely útmutatást nyújt az idegtudományi kutatók számára az asztrocitikus funkciók feltárásakor.
az adatok rendelkezésre állása
a tanulmány megállapításainak alátámasztására használt adatokat a cikk tartalmazza.
közzététel
Zengli Zhang és Zhi Ma a társszerzők.
összeférhetetlenség
a szerzők kijelentik, hogy nincs összeférhetetlenségük.
A szerzők hozzájárulása
zengli Zhang és Zhi Ma egyaránt hozzájárult ehhez a tanulmányhoz.
elismerések
ezt a munkát támogatta a pekingi Természettudományi Alapítvány (no. 7194321 a Lixia Zhang), a Nemzeti Természettudományi Alapítvány Kína (no. 81801138 a Yulong Ma, no. 81771206 a Wangyuan Zou), a fiatal tudós kutatási támogatás a kínai aneszteziológus Egyesület (no. 21700001 a Yulong Ma), a Miaopu Alapítvány Kínai pla általános kórház (no. 18kmm47 Lixia Zhang), és a pekingi városi tudomány & technológiai Bizottság (no.1811000017180022 Hang Guo).
kiegészítő anyagok
kiegészítő 1.ábra. Az ndrg2 és GS kolokalizációja az asztrocitákon belül. Kiegészítő Ábra 2. Az ndrg2 fehérje expressziója a sejtvonalakban. (Kiegészítő anyagok)