A T-sejtek aktiválása indukálja a CD25 és Foxp3 expresszióját, amely az effektor és a memória fenotípus differenciálódásához kapcsolódik
a PBMC-t bryosztatin-1 (5 nM) és ionomycin (1 db) (B/I) 80 egység/ml IL-2 (peprotech) jelenlétében 16 órán át. A B / I aktiváció utánozza az intracelluláris jeleket, amelyek T-sejt aktiválódást eredményeznek a protein kináz C aktivitásának, illetve az intracelluláris kalcium aktivitásának növelésével . A sejteket háromszor mostuk, és 106 sejt/mL-es teljes táptalajon 40 U/mL IL-2-vel (Peprotech) tenyésztettük 3 napig, és a Foxp3 expresszióját áramlási citometriás analízissel határoztuk meg. A FoxP3 expresszióját frissen izolált T-sejteken is meghatároztuk a 0. napon. Amint az ábrán látható. 1A (felső panel), önmagában az IL-2 jelenléte 3 napig nem növelte jelentősen a Foxp3 vagy CD25 expresszióját a kiindulási szint felett a 0.napon (ábra. 1C). A B / I aktiváció azonban Foxp3 és CD25 expressziót indukált CD4 + és CD8 + T sejtekben (ábra. 1A, középső panel). A B / I aktiváció után a CD4 + CD25 + Foxp3 + T-sejtek száma 1% – ról 23% – ra emelkedett (P = 0,016) és a CD8+CD25+Foxp3+ T-sejtek száma 0,6% – ról 9% – ra emelkedett (P = 0,013). A tenyésztés kiterjesztése IL-2 jelenlétében 6 napig további stimuláció nélkül megtartotta a CD4 + CD25 + Foxp3 + T-sejteket a kiindulási szint felett a nem aktivált T-sejtekben (1% vs.7%; P = 0,031), míg a CD8+CD25+Foxp3+ T-sejtek a kiindulási szintre csökkentek (0,6%). Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a Foxp3 aktiváció által kiváltott expressziója a CD4 + CD25 + T sejtekben stabilabb, mint a CD8+CD25+ T sejtekben. A T-sejtek abszolút száma 3 és 6 nappal a B/I stimuláció és expanzió után nőtt IL-2 jelenlétében (ábra. 1B). A T-sejtek aktiválása anti-CD3/CD28 Abs segítségével 3 napig hasonló eredményeket hozott, mint a B/I aktiváció esetében a CD4+CD25+FoxP3+ T-sejtek 0,4% – ról 8,7% – ra történő növelésével (ábra. 1C). A T-sejtek fenotípus analízise CD44+ effektor és CD44 + CD62L + memória fenotípusokat mutatott ki a B/I aktiválás előtt és után 6 nappal (ábra. 1D, felső panel). Míg az effektor CD4+ és CD8+ T-sejtek száma csökkent az aktiválás után (sorrendben 18% – 9% és 21% – 13%), addig a memória CD4+ és CD8+ T-sejtek száma emelkedett (sorrendben 82% – 91% és 79% – 87%). B / I aktiválás után a CD4 + T-sejtek a FoxP3 expressziójának 6-szoros növekedését mutatták CD44+, CD62L + fenotípusokban (CD44+: 2,6% – 15%; CD62L+: 2% – 12%). Ezenkívül mind a CD4+, mind a CD8+ T-sejtek Foxp3 magas expressziót mutattak az aktiválást követően, összehasonlítva a FoxP3low expresszióval a 0.napon (ábra. 1D, középső és alsó panelek). Az összes CD4 + Foxp3 + T sejt CD44-et expresszált, amelyek közül 80% CD62L-t is expresszált (ábra. 1D, középső panel, jobb szélen). Ezek az adatok azt mutatják, hogy a CD4+Foxp3+ T sejtek 20% – a effektor, 80% – a memória fenotípus. Hasonló fenotípusos tendenciát mutattak ki a CD8 + Foxp3 + T-sejtek esetében is, amelyek 100% – a CD44+, amelynek 67% – a CD62L+ T-sejt volt (ábra. 1D, Alsó panel, jobb szélen). Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a CD8+Foxp3+ T sejtek 33% – a effektor, 67% – a memória fenotípus. A bemutatott adatok ábra. Az 1A – D azt sugallja, hogy a FoxP3high fokozott expressziója az effektor T-sejtekben a sejtdifferenciálódás, nem pedig a sejtproliferáció miatt következett be, mert a CD44+CD62L-effektor T-sejtek relatív százaléka csökkent a B/I aktiválás után. Hasonló mechanizmus létezhet a memória T-sejtekben a FoxP3high expressziója miatt az aktiválás után, összehasonlítva a foxp3low nappal 0.
Foxp3 kifejezés a T-sejt aktiválása után. A T-sejteket egészséges önkéntesekből izolálták és két csoportra osztották. A kontrollcsoport nem volt aktiválva és tenyésztve IL-2 jelenlétében 3 napig (a; felső panel), egy másik csoportot pedig b/I-vel aktiváltak 16 órán keresztül, és IL-2 jelenlétében tenyésztették 3 napig (a; középső panel) vagy 6 napig (a; Alsó panel). Az összesített mintákban a CD4 + és CD8 + T-sejtek abszolút számát a tenyésztést követő 0., 3. és 6. napon áramlási citometriás analízissel határoztuk meg (B). A FoxP3 és CD25 expresszióját frissen izolált CD4+ T-sejtekben határozták meg (0.nap) és 3 napos anti-CD3/CD28 Abs (C) stimuláció után. A frissen izolált és B / I-aktivált T-sejteket áramlási citometriának vetettük alá, hogy meghatározzuk a T-sejt fenotípusait (d; felső panel); a Foxp3+ effektor és a memória T-sejteket zárt CD4+Foxp3+ sejtekben vagy zárt CD8+Foxp3+ sejtekben (d; Alsó panel) határoztuk meg. Két donor reprezentatív adatait két kísérletben mutatjuk be.
az aktiválás által kiváltott FoxP3 expresszió CD4+ T sejtekben in vitro nem közvetíti a szabályozó funkciót
A T-sejteket CFSE-vel jelöltük és anti-CD3 (1 ug/ml) és anti-CD28 (1 ug/ml) Abs-sel stimuláltuk a B/I-aktivált CD4+CD25 jelenlétében vagy hiányában+foxp3+ T-sejtek (2:1 és 20:1 válaszadó:szupresszor arány) 3 napig. Az áramlási citometriás elemzés a zárt CD8 + T-sejtek proliferációjának hasonló sebességét mutatta indukálható FoxP3+ T-sejtek hiányában vagy jelenlétében (ábra. 2A, 60% vs.61% és 65%). A CD3 / CD28 aktiváció FoxP3 expressziót is indukált a válaszadó CD4+ T sejtekben. A kapuzott CD4 + FpxP3 + T-sejtek szintén 70-75% – os proliferációt mutattak aktiváláskor (ábra. 2A). A T-sejt apoptózisának elemzése hasonló apoptózis arányt tárt fel a válaszadó T-sejtekben CD4+FoxP3+ T-sejtek hiányában vagy jelenlétében (ábra. 2B, 57% vs. 57 és 59%). A B/I-aktivált CD4+FoxP3+ T-sejtek többsége (74-76%) apoptotikusnak bizonyult az anti-CD3/CD28 aktiváció során a reagáló T-sejtekkel való társkultúrában.
T-sejt proliferáció indukálható CD4+FoxP3+ T-sejtek jelenlétében. A Ko-tenyésztési szuppressziós vizsgálat elvégzéséhez a válaszadó T-sejteket CFSE-vel jelöltük, és az indukálható FoxP3+ T-sejtek (20:1 és 2:1) különböző arányainak hiányában vagy jelenlétében tenyésztettük 3 napig anti-CD3/CD28 Abs jelenlétében. A zárt CD8 + T sejtek CFSE hígítást mutattak (a, bal panel). A válaszadó CD4+ T-sejteket, amelyek FoxP3-at expresszáltak egy 3 napos aktiváció miatt, szintén kapuztuk és elemeztük a CFSE hígítás szempontjából (a, jobb panel). A Ko-tenyésztési szuppressziós vizsgálatból (a, bal panel) nyert sejteket V. Mellékletre is festettük, hogy meghatározzuk az apoptózist a válaszadó CD8+ T sejtekben (B, bal panel) és a B/I-aktivált CD4+FoxP3+ T sejtekben (B, jobb panel).
a T-sejtek allogén aktiválása az MLR során Foxp3 expressziót indukál a CD4+CD25+ T-sejtekben, amelyek az effektor/memória fenotípushoz kapcsolódnak
8 napos allogén MLR-t végeztünk annak meghatározására, hogy a Foxp3 expresszió indukciója a T-sejtekben stabil volt-e az MLR alatt, és hogy egy ilyen indukált Foxp3+ expresszió gátolhatja-e a T-sejt proliferáció. A válaszadó és stimulátor sejteket különböző egészséges donoroktól szerezték be. A stimulátor sejteket besugároztuk (5000 rad), és 8 napon át tenyésztettük a válaszadó sejtekkel 10 6m brdu (BD Pharmingen) jelenlétében. A sejteket ezután megfelelő Abs-sel festettük, és áramlási citometriás elemzésnek vetettük alá. Amint az ábrán látható. 3A (felső panel) a CD4+CD25+ T sejtek 86% – A és a CD8+CD25+ T sejtek 93% – a mutatott BrdU beépülést a sejtproliferáció eredményeként. Csak a válaszadó vagy stimulátor sejtekben nem észleltek proliferációt (az adatok nem jelennek meg). Az ilyen allogén proliferáció egy aktiváció által kiváltott Foxp3 expresszió jelenlétében zajlott le CD4+ T-sejtekben oly módon, hogy a CD4+ T-sejtek 8% – a CD25+Foxp3+ volt (ábra. 3A, Alsó panel). A CD8 + CD25 + T sejtek viszont nem mutatták a Foxp3 stabil expresszióját. Ezek az eredmények összhangban vannak a megfigyelés ábra. 1 azt mutatja, hogy a Foxp3 expressziója a CD4+ T-sejtekben stabilabb, mint a CD8+ T-sejtekben 6-8 nappal a T-sejt aktiválása után. A korábbi jelentésekben in vitro szuppresszív vizsgálatokat végeztek a CD4+CD25+ T-sejtek (Treg-ek) magas arányának jelenlétében a válaszadó sejtekhez, hogy meghatározzák a T-sejt aktiváció és proliferáció szuppresszív funkcióját. A CD4+CD25+ T-sejtek arányának ilyen mesterséges növekedése a válaszadó sejtekhez csökkentené a megfigyelés in vivo érvényességét. Az MLR során indukált CD4+CD25+Foxp3+ T-sejtek gyakorisága 8% volt, ami a fiziológiailag releváns tartományon belül van, amint azt más csoportok jelentették . Az egérben a természetben előforduló Treg-ek gyakorisága szintén ezen a tartományon belül van, mégis szabályozó hatása van az autoimmunitás gátlására. Ha a CD4+ T-sejteket expresszáló Foxp3-nak bármilyen szabályozó funkciója volt, gátolnia kellett volna sejtproliferáció a tenyészet során in vitro. A B/I-indukált T-sejt aktivációhoz hasonlóan az MLR-ben a T-sejt fenotípusai közé tartoztak a CD44+ effektor (16%) és a CD44+CD62L+ memória T-sejtek (84%) (ábra. 3B). Ismét az összes CD4 + Foxp3 + T sejt CD44-et expresszált, amelyek közül 90% CD62L-t is expresszált (ábra. 2B). Ezek az adatok azt mutatják, hogy a CD4+Foxp3+ T sejtek 10% – a effektor, 90% – a memória fenotípus. Hasonló fenotípusos tendenciát észleltek a CD8 + Foxp3 + T-sejtek esetében is, amelyek 100% – a CD44+, amelynek 76% – a CD62L+ T-sejt volt. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a CD8+Foxp3+ T sejtek 24% – a effektor, 76% – a memória fenotípus. A szabályozási funkció hiánya ezekben a Foxp3 + T-sejtekben az effektor/memória fenotípusuk miatt lehet, mivel arról számoltak be, hogy a Foxp3 expressziója az emberi memória T-sejtjeiben csökkent szuppresszor aktivitást eredményezett . Ezenkívül a Treg 1 .típusú (Tr1) sejtek szuppresszor funkciót biztosítanak FoxP3 expresszió hiányában. Tekintettel a Foxp3 szerepére, mint a Treg lineage elkötelezettség és karbantartás fő szabályozója az egérben, úgy tűnik, hogy nem rendelkezik ilyen jóhiszemű szabályozó funkcióval a Treg lineage elkötelezettség szempontjából az emberi T-sejtekben.
Foxp3 kifejezés allogén MLR után. A sejteket áramlási citometriával elemeztük egy 8 napos MLR után. A BrdU beépülését kapuzott CD4+CD25+ vagy CD8+CD25+ T cellákon határoztuk meg (a; felső panel). Kapuzott CD4 + vagy CD8 + T sejteket elemeztünk a CD25+Foxp3+ sejtek kimutatására (a; Alsó panel). Zárt CD4 + T sejteket (B; felső panel) vagy CD8+ T sejteket (B; Alsó panel) elemeztünk a CD44, CD62L, Foxp3 expressziójára. A CD44 + és CD62L + T sejteket CD4 + Foxp3 + vagy CD8 + Foxp3 + t sejteken történő kapuzással határoztuk meg. Két donor reprezentatív adatait két kísérletben mutatjuk be.