az Escherichia coli-ból származó hemolizin endogén amplifikációt alkalmaz a p2x receptor aktiválásával a hemolízis indukálásához

eredmények

A HlyA által kiváltott hemolízis purinerg receptorok aktiválását igényli.

felülúszó az E. coli-t (hlya) termelő E. coli–törzs ARD6 lizes ló–, ember-és egérvérsejtjeiből (ábra. 1). Az 1. ábra a HlyA által kiváltott hemolízist mutatja az idő függvényében. Egérrel és humán vörösvérsejtekkel végzett Time-lapse kísérletek kimutatták, hogy a HlyA által kiváltott hemolízis szekvenciális folyamat. Az első 20 percben a hlya a vörösvértestek krenációját indukálta a sejtek zsugorodása következtében, amelyet fokozatos térfogatnövekedés, végül a sejtek lízise követett (ábra. 1A és 1b, S1 film). Ez a szekvenciális zsugorodás és duzzanat az egysejtű szinten is érvényes. Így nem a vörösvértestek különböző populációi zsugorodnak vagy duzzadnak, hanem inkább az, hogy egyetlen vörösvértest először zsugorodik, majd megduzzad a HlyA alkalmazás következtében. Az eritrocita szuszpenziót (1,25%) híg E. coli felülúszóval inkubáltuk (50 ~ ml · ml−1). A három vizsgált faj eritrocitái jelentős különbséget mutattak a HlyA-ra adott válaszkészségben (ábra. 1C) a humán eritrocitákban a legalacsonyabb érzékenységgel a HlyA-val szemben. A következő kísérletek mindegyikében a hozzáadott E. coli felülúszó mennyiségét úgy állítottuk be, hogy 50% – os hemolízist állítson elő 60 perc inkubálás után.

általában szűrt E. coli (ARD6) felülúszót használunk a hemolízis kiváltására, hacsak másként nem jelezzük. Ezt a megközelítést választották annak biztosítására, hogy eredményeink in vivo is alkalmazhatók legyenek, ahol a HlyA felszabadul az E. coliból, különféle egyéb komponensekkel együtt. Ennek a megközelítésnek a kiválasztásakor azonban meg kellett győződnünk arról, hogy a hlya-termelő E. coli által kiváltott hemolízis valójában a HlyA-nak tulajdonítható. Ezért megtisztítottuk HlyA-t az ARD6-kultúránkból. Tisztítás után a tisztított HlyA szuszpenzióját 5-15% – os nátrium-dodecil-szulfát (SDS) gélen választottuk el. Egyetlen 100 kDa sáv jelent meg a Coomassie r festés után, és a tömegspektroszkópia hlya-ként azonosította a sávot (ábra. S1 A és B). Kiegészítő kontrollként az E. coli D2103 törzsből származó felülúszót használtuk, amely az E. coli nem patológiás laboratóriumi törzse, amely nem termel HlyA-t. Ezeknek a baktériumoknak a felülúszója nem indukált hemolízist humán, egér vagy ló eritrocitákban (ábra. S1D). Továbbá, összehasonlítottuk megállapításainkat a Hlya-val, amelyet Prof. Sucharit Bhakdi, mainzi Egyetem, Németország (10 ng·ml−1 aktivitással 60% – os hemolízis esetén, ábra. S2). A következőkben, amikor a tisztított HlyA-t említik, ez a készítményre vonatkozik. A hlya biológiai aktivitásának kezdeti tesztjei során felfedeztük, hogy az ATP-scavenger apiráz teljesen gátolta a ló eritrociták HlyA által kiváltott hemolízisét. Ez a megállapítás valóban meglepő volt, mivel magában foglalta az extracelluláris ATP-t, amely a hlya-termelő E. coli által okozott hemolízishez szükséges. Mivel az extracelluláris ATP egy jelátviteli molekula, amely aktiválja a P2 receptorokat, eredményeink arra utalhatnak, hogy a hlya által kiváltott hemolízis uralkodó pórusmodellje egyszerűsítés lehet. Ezért alaposabban teszteltük az ATP-Tisztítás hatását. Azt találtuk, hogy az apiráz teljesen gátolta hemolízis nem csak a ló, hanem az egér és az emberi eritrociták (ábra. 2A). Ezenkívül a hexokináz, amely gyorsan lebontja az adenozin-trifoszfátot (ATP) adenozin-difoszfáttá (ADP), hasonlóan csökkentette a hlya által kiváltott hemolízist az egér és az emberi eredetű vörösvértestekben koncentrációfüggő módon (ábra. 2B). Ezt a megállapítást tisztított HlyA igazolta (ábra. 2B, betét). Érdemes megjegyezni, hogy az emberi eritrocitákban mind az apiráz, mind a hexokináz alacsonyabb koncentrációban fokozta a HlyA által kiváltott hemolízist. A megkülönböztetés arra utalhat, hogy a P2 receptor expressziós mintázata eltér a vörösvértesteken a fajok között.

ennek a megállapításnak a relevanciájának igazolásához fontos volt megtudni, hogy a P2 receptor antagonisták befolyásolták-e a HlyA által kiváltott hemolízist. A nem szelektív P2 receptor antagonista PPAD-k koncentrációfüggő módon csökkentették a HlyA-termelő E. coli által kiváltott hemolízist ló -, egér-és humán eritrocitákban (ábra. 2C). Az EC50 érték a PPAD-k esetében 520, az egér és a ló vörösvérsejtjei esetében 400, míg a vörösvérsejtek esetében 180, míg a vörösvérsejtek esetében 520, a vörösvérsejtek esetében pedig 400, a vörösvérsejtek esetében pedig 180, a vörösvérsejtek esetében. Ezt a megállapítást a HlyA-koncentrációk teljes tartományára igazolták (ábra. 2D) tisztított HlyA-nak kitett humán eritrocitákban tesztelték. A koncentráció-válasz összefüggés összeegyeztethető volt a Kompetitív antagonizmussal, és meg kell jegyezni, hogy még a maximális toxinkoncentráció hatását is csökkentette a P2 receptor blokkoló. Így úgy tűnik, hogy a P2 receptor aktiválása részt vesz a HlyA által kiváltott hemolízisben. A nem szelektív P2 receptor antagonista suramin szintén koncentrációfüggő módon csökkentette a HlyA által kiváltott hemolízist mindhárom fajban (az adatok nem jelennek meg). Magasabb koncentrációban azonban a suramin drámai vörösvérsejt-zsugorodást okoz, ezért nem biztos, hogy alkalmas a P2 receptor vörösvértestekre gyakorolt hatásának értékelésére.

annak értékelésére, hogy a purinerg antagonista hemolízisre gyakorolt hatása csupán a megnövekedett ozmolalitás eredménye volt-e, teszteltük az extracelluláris szacharóz hatását a HlyA által kiváltott hemolízisre (az adatok nem láthatók). A szacharóz (1 mM) csak kismértékben csökkentette a hemolízist (5,1% 6,7%), míg a 10 mM-es és 75 mM-es szacharóz jelentősen csökkentette a hemolízist (28.5% ± 5.0%, 82.8% ± 5.2%). Mivel az ebben a vizsgálatban alkalmazott antagonisták és Atpázok koncentrációja soha nem haladta meg az 1 mM-t, a hatás nem lehet a megnövekedett ozmolaritás eredménye. Az eredményeink sem tükrözték az antagonisták és a toxin közötti szelektív kötődést. Ezt ló vörösvérsejtjein tesztelték, amelyeket HlyA-val előinkubáltak 10-15 percig 37 6-os c-n vagy 30-as 4-es c-n, alaposan megmosták, majd újra szuszpendálták antagonistákkal vagy anélkül. Mivel a HlyA beépül a membránba az előinkubáció során, az eritrociták szabad HlyA hiányában lízisbe kezdtek. Fig. Az S2 azt mutatja, hogy a különféle farmakológiai beavatkozások csökkentették a hemolízist, miután a hlya előkerült az eritrocitákhoz. Az antagonisták azonban kevésbé voltak hatékonyak, ha mosott eritrocitákhoz adták, amelyekben a litikus folyamat már megkezdődött.

melyik P2 Receptor(ok) vesz részt a HlyA által kiváltott Hemolízisben?

az eritrociták különböző típusú P2 receptorokat expresszálnak. Az érett humán eritrocitákban expresszálódó P2 receptorok közé tartozik a P2Y1 (14), A P2Y2 (15), a P2Y13 (15), a P2X1 (15) és a P2X7 (16), míg a P2Y1, P2X1, P2X4 és P2X7 jelen van az eritroid progenitor sejtekben (17). Annak tesztelésére, hogy ezek közül a purinerg receptorok közül melyik vesz részt a HlyA által kiváltott hemolízisben, külön-külön foglalkoztunk a kérdéses receptorokkal. Mivel a p2y1 receptor szerepet játszik a plazmodiummal fertőzött humán és egér eritrociták szorbit által indukált hemolízisében (14), megvizsgáltuk, hogy ez a receptor felelős-e a HlyA által kiváltott hemolízisért. A P2Y1 receptor antagonista MRS2179 nem befolyásolta a HlyA által kiváltott hemolízist (ábra. S3A) koncentrációban (legfeljebb 500 Ft) meghaladja azt, ami szükséges volt a hemolízis gátlásához Plasmodium berghei-fertőzött eritrocitákban (14). Mivel a P2Y2 receptorokra nincsenek specifikus antagonisták, megvizsgáltuk a hlya hatását transzgenikus egerekben. A HlyA-indukált hemolízis hasonló volt a p2y2−/− és P2Y2+/+ egerek eritrocitáiban (ábra. S3B). A P2Y13 esetében teszteltük az mrs2211 antagonistát, amelyről beszámoltak arról, hogy bizonyos szelektivitást mutat a P2Y13 receptor felé (18). Az MRS2211 szignifikánsan csökkentette a HlyA-indukálta hemolízist humán és egér eritrocitákban (ábra. S3C). Ez a megállapítás ellentmond a hexokinázzal (az ATP ADP-re történő lebontásával) elért eredményeinknek, amelyeknek stimulálniuk kell, nem pedig gátolniuk kell az ADP-érzékeny P2Y13 receptort. Ezért a hexokináznak és az MRS2211-nek ellentétes eredményeket kell adnia, ha a P2Y13 receptor érintett. Mivel nem ez a helyzet, a P2Y13 receptor valószínűtlen jelölt a HlyA által kiváltott hemolízisben részt vevő P2 receptorra. Nem zárhatjuk ki annak lehetőségét, hogy az MRS2211 által termelt gátlást egy másik P2 receptor közvetíti.

elvileg ez csak a P2X receptorokat veszi figyelembe. Fig. A 3A azt mutatja, hogy a P2x receptorok nem szelektív blokkolója az Evans blue erőteljesen csökkentette a HlyA által kiváltott hemolízist, ami arra utal, hogy egy p2x-receptor vesz részt ebben a hemolízisben. Az eritrocitákban expresszált P2X-receptorok közül a P2X7-et tekintettük a HlyA által kiváltott hemolízis legvalószínűbb mediátorának a következő okok miatt. A P2X7 receptorokról ismert, hogy nagyobb permeabilitási állapotba kerülnek, ami végül bizonyos sejtekben lízishez vezet (12). A jelentések szerint a P2X7 receptor kölcsönhatásba lép a pannexin1 (12) csatornafehérjével, és a komplex jelentős pórusáteresztő képességet hoz létre a nagyobb molekulák, például az etidium-bromid (13) számára. A Pannexin1 az emberi vörösvérsejtekben expresszálódik (19), és nemrégiben javasolták ATP felszabadulási csatornaként az eritrocitákban (20). Annak tesztelésére, hogy a P2X7 receptorok részt vesznek-e a HlyA-indukált hemolízisben, relatív szelektivitású antagonistákat használtunk a P2X7-re: Brilliant Blue G (BBG), ATP-2′,3′ – dialdehid (OxATP) és KN-62 (21). Az összes antagonista koncentrációfüggő módon csökkentette a hemolízist lovak, egér és humán eritrocitákban (ábra. 3). A lovak és a humán eritrociták érzékenyebbek voltak az összes vizsgált anyagra, mint az egér eritrocitái. Ebben az összefüggésben meg kell említeni, hogy az egér P2X7 receptorról ismert, hogy kevésbé érzékeny a KN-62-re, mint az emberi receptor (22). A hemolízis elleni védelmet P2X receptor antagonizmussal ismét igazolták a tisztított HlyA teljes koncentrációtartományára humán eritrocitákban, BBG-t használva p2x7 antagonista példájaként (ábra. 3D). Az antagonista ismét jelentős hatást mutat a HlyA által kiváltott hemolízisre még a maximális hemolízist eredményező HlyA koncentrációk alatt is. A hemolízis OxATP általi gátlását egér és humán eritrocitákban tisztított HlyA-val igazolták (ábra. 3e, betét). Az új szelektív, kompetitív p2x7 receptor antagonista A438079 csökkentette a hemolízist humán eritrocitákban, de kevésbé volt hatékony egér eritrocitákban (ábra. 3F). A p2x7 receptor plazmamembrán-frakcióinak immunblotjai megerősítik, hogy a humán és az egér eritrociták megfelelő méretű fehérjét expresszálnak (66 kDa, ábra. 3G, teljes egészében az ábrán. S4B). További vizsgálatokra lesz szükség a p2x receptorok relatív hozzájárulásának teljes megállapításához a HlyA által kiváltott hemolízisben. Jelenlegi eszközeinkkel nem zárhatjuk ki a többi p2x receptor hozzájárulásának lehetőségét a hlya által kiváltott hemolízisben a vizsgált fajok bármelyikében.

ábra. Az S4A a hlya által kiváltott hemolízist mutatja egér (P2X7+/+ és P2X7−/−) eritrocitákban. Az egér eritrociták hasonló mértékű hemolízist mutatnak a HlyA-ra adott válaszként, genotípusuktól függetlenül. A P2X7−/− egereket és a P2X7+/+ egereket eredetileg a Pfizer generálta, és balb/C háttérbe kerültek. A Balb/c és a C57BL/6 egerekből izolált eritrocitákban Nem találtunk eltérést a HlyA-indukált hemolízis iránti érzékenység között (az adatok nem szerepelnek), annak ellenére, hogy a C57BL/6 törzsről ismert, hogy genetikai variációja van a P2X7 receptor C terminálisában (23). Ezek az adatok összhangban vannak az a438079 egér eritrocitákra gyakorolt csekély hatásával, valamint a p2x7 receptor alacsony fehérje expressziójával egér eritrocitákban (ábra. 3F és 3G).

Ezek az eredmények azt sugallják, hogy legalább egy további P2 receptor vesz részt a hlya által kiváltott hemolízisben egér eritrocitákban. Mivel a P2X1 és a P2X7 hasonló inhibitor profilokkal rendelkezik a BBG, a KN-62 és az OxATP (24) esetében, teszteltük a P2X1 antagonistákat MRS2159 és NF449. MRS2159 koncentráció-függő módon gátolta a hemolízist a ló (EC50:150) és az egér (EC50: 650) vörösvérsejtjeiben. A humán eritrociták viszonylag érzéketlenek voltak az antagonistára, de 250 MHz feletti koncentrációban kis és statisztikailag szignifikáns csökkenést tapasztaltunk (ábra. 4A). Ez a hatás sokkal kifejezettebb volt, ha tisztított HlyA – t használtunk (ábra. 4C). Ez azt jelenti, hogy különbségek lehetnek a sejtválaszban abban a tekintetben, hogy tiszta formában vagy más E. coli összetevőkkel kombinálva HlyA-nak vannak-e kitéve. NF449 koncentráció-függő módon gátolja a HlyA által kiváltott hemolízist emberben (ábra. 4B). Az NF449 sokkal kevésbé volt hatékony az egér eritrocitáiban, egyetértésben azzal, hogy az egér P2X1 receptor relatíve rezisztens ezzel az inhibitorral szemben (25). Hangsúlyozni kell, hogy annak ellenére, hogy az NF449 suramin-származék, nem váltott ki ugyanolyan térfogatváltozást az eritrocitákban, mint a suramin. A P2X1 receptor immunblotjairól ismert, hogy 4 sávot mutatnak a különböző szövetekben; egy 45 kDa nem glikozilezett, egy 60 kDa glikozilált és egy 95/120 kDa sáv, amely a receptor polimerizált formája lehet (26, 27). Kezünkben a P2X1 receptor antitest következetesen felismerte a 45 KD sávot és egy nagyon gyenge 60 kDa sávot az egér és az emberi eritrociták plazmamembránjainak blotjaiban (ábra. 4D). Érdekes módon azt tapasztaltuk, hogy az expressziós szint 60 kDa sáv sokkal magasabb volt a P2X7−/− egerekben a kontrollokhoz képest (hasonló három készítményben, ábra. 4D). Ebben az immunoblotban a fehérje szintjét úgy állítjuk be, hogy elkerüljük a p2x7−/− egerek sávjainak túlterhelését, ami a 60 kDa sávot szinte kimutathatatlanná teszi a P2X7+/+ egerekben. A P2X1 receptor ezen látszólagos up-szabályozása potenciálisan elrejtheti a hemolitikus fenotípus a P2X7 receptorhiányos egerekben. Ezek az adatok együttesen alátámasztják azt a hipotézist, miszerint mind a P2X1, mind a P2X7 receptor releváns a HlyA által kiváltott hemolízis szempontjából. Eredményeink jelentős Fajok közötti variációkra mutatnak, amelyekben a p2x7 receptor fontosabb az emberi eritrociták hemolízisében.

a HlyA-indukált hemolízist a Pannexin1 antagonisták megakadályozzák.

Karbenoxolont (28), mefloquint és probenecidet (30) alkalmaztak antagonistákként, relatív szelektivitással a pannexin1-re. A karbenoxolon szignifikánsan csökkentette a hemolízis szintjét mindhárom hasonló érzékenységű fajban (ábra. 5A). A karbenoxolon hatását ismét a HlyA koncentrációk teljes tartományára tesztelték (tisztított toxin, ábra. 5B), amelyek szintén jelentős hatást mutatnak a maximális HlyA-koncentrációk mellett. A mefloquint és a probenecidet csak egér és humánus eritrocitákban tesztelték. Az EC50 a mefloquin esetében 25, az egér vörösvérsejtjeiben pedig 18 volt. A Probenecid gátolta a hemolízist az emberi eritrocitákban, EC50 2 mM-rel, de kevésbé volt hatékony egér eritocitákban. A közelmúltban kimutatták, hogy az ismert CL-csatorna antagonisták, az NPPB és a nifluminsav gátolják a pannexin csatornákat is (31). Mindkét anyag csökkentette a HlyA által kiváltott hemolízist, lényegesen kifejezettebb hatással az emberi eritrocitákra (ábra. S5).