megbeszélés
eredményeink azt mutatják, hogy a reagensek és protokollok gondos tervezésével, képzésével és szabványosításával egy transznacionális laboratóriumi hálózat képes következetes és összehasonlítható HAI vizsgálati eredményeket előállítani. A tanulmányban részt vevő öt Közegészségügyi és tudományos laboratórium a pcirn részét képezte, amelyet azért fejlesztettek ki, hogy növelje Kanada nemzeti kapacitását a vakcina és más influenza kutatások támogatására pandémia esetén. Pandémiás helyzetben, nagy volumenű, nagynyomású és földrajzilag szétszórt influenzavizsgálatok esetén a Hai-vizsgálat szabványosítása kiemelkedően fontos lesz az eredmények laboratóriumok közötti összehasonlíthatóságának biztosítása érdekében. A pcirn laboratóriumok magas szintű laboratóriumon belüli reprodukálhatóságot mutattak, 99,8% – os pontossággal (99.2%-100% laboratóriumonként), a titerek 97,8%-a A 2-szeres tartományon belül az ismételt vizsgálati napokon (laboratóriumonként 93,3% – 100%), valamint a vizsgálati Szérumok 91,1% – a, amely titer reprodukálhatóságot mutat a hatvizsgálati protokoll minden egyes ismétlése során (laboratóriumonként 60% – 100%). A laboratóriumok közötti reprodukálhatóság szintén magas volt, a négy nem referencia laboratórium összes replikációjának medián titerei a referencialaboratórium 2-szeresén belül a vizsgált Szérumok 100% – ánál. Laboratóriumi alapon a titerek 94,3% és 98.A minták 9% – át a referencialaboratórium és a konszenzus titerek egyetlen hígításán belül határozták meg (85% – tól 100% – ig, illetve 95% – tól 100% – ig). Ezek a százalékok megfelelnek a HAI-vizsgálati variabilitás tipikus elfogadhatósági küszöbértékeinek (azaz a minták legalább 80%-a A névleges értékek és/vagy az összes vizsgálati GMT-érték 1 hígításán belül van ). A HAI vizsgálat specificitása (100%) és érzékenysége (87,5% – 100%) a pcirn laboratóriumokban hasonlóan jócskán megfelelt a korábbi vizsgálatok elfogadási kritériumainak (pl., A negatív minták 100% – ának a mennyiségi szint alatt kell lennie, a pozitív minták legalább 80% – ának pedig pozitívnak kell lennie ).
A HAI vizsgálat intralaboratóriumi komponensének variabilitása tekintetében a pcirn laboratóriumokon belüli ismételhetőség hasonló a többi vizsgálatban kimutatotthoz (5, 22). Ezeknek a korábbi vizsgálatoknak az egyik figyelmeztetése az volt, hogy legfeljebb három ismétlést vizsgáltak, annak ellenére, hogy a közös immunvizsgálat validációs gyakorlata hat vagy több ismételt vizsgálat vizsgálata (24-27). Mint ilyen, nem világos, hogy adataik közvetlenül összehasonlíthatók-e az ebben a vizsgálatban hat vizsgálat során meghatározott eredményekkel. Ennek ellenére a vizsgálatok 0-6, 7%-os (medián, 0%) eredményei, amelyek eredményei több mint 2-szer különböznek a többi vizsgálati ismétléstől, összehasonlíthatónak tűnnek a korábban egy laboratóriumban (22) és a 0-15% (medián, 2%) kilenc laboratóriumban (5).
a földrajzilag szétszórt PCIRN laboratóriumok közötti magas hai titer reprodukálhatóságra vonatkozó megállapításaink ellentétben állnak a korábbi jelentésekkel, amelyek jelentős változékonyságot mutatnak a vizsgálatot végző nemzetközi laboratóriumok között (5, 6, 9-12). Például egy nagy együttműködési vizsgálat (11 laboratórium) adatai szerint a GCV-k mintánként 84% – tól 803% – ig terjedtek (medián GCV vírusonként 138%, 155% és 261% ). Más vizsgálatok A H1N1 és H5N1 minták 95-345%-OS (11) és 22-582%-os (6) GCV-jét jelentették, és a GMT-k akár 80-szoros (11) vagy 128-szoros (9) eltérést mutattak a laboratóriumok között. Míg a korábbi jelentések gyakran nagyobb számú részt vevő laboratóriumot tartalmaztak, mint a jelenlegi tanulmány, még akkor is, ha csak hat laboratórium járult hozzá az adatokhoz, a laboratóriumok közötti GCV mediánja öt H1N1 minta esetében 83% volt, 80%-uk meghaladta a laboratóriumok közötti 4-szeres különbséget (11). Ezzel szemben a jelenlegi vizsgálat azt mutatta, hogy a medián GCVs vírusonként csak 39% és 17% volt, a minták 95%-a 4-szeres különbség volt a laboratóriumok között. Egy minta meghaladta a 4-szeres különbséget; a titer egy laboratóriumban nem volt számszerűsíthető erre a mintára, ezért a legalacsonyabb értéket határozták meg, nem pedig mérték. Ha ezt a mintát kihagynák az elemzésekből, a maximális GCV 75,5% lenne, ami alacsonyabb értéket képviselne, mint a többi vizsgálatban a minimális GCV. Bár ez a minta nagyobb variabilitást mutatott, mint mások, ez az alacsony mérési tartomány általában kevésbé pontosnak tűnt, mint a magasabb tartományok. Például a GCV 43,4% – tól 156,4% – ig terjedt a 10 és 80 közötti titereknél, szemben a magasabb titereknél 11,1% – tól 53,1% – ig (ábra. 3). Az alacsonyabb titerű minták nagyobb variabilitását korábban is leírták (23), és valószínűleg hozzájárult az inkongruens szeroprotekciós osztályozáshoz a jelenlegi vizsgálatban a három H1N1 minta esetében, amelyek titerei a 40-es küszöbértékhez legközelebb vannak (22-es, 24-es és 43-as konszenzus titerek). Ennek ellenére a szeroprotekció diagnosztikai pontossága a PCIRN laboratóriumokban összességében magas maradt (93,6%, ha konszenzusos titereket alkalmaztak a szeroprotekció meghatározására, és 89,5% a referencia laboratóriumi értékekhez képest).
a laboratóriumok közötti HAI titerek magas szintű egyetértése a HAI vizsgálati eljárások és reagensek gondos harmonizációjához kapcsolódhat a PCIRN-ben. A korábbi vizsgálatok résztvevői, amelyek magas laboratóriumok közötti variabilitást mutattak, általában hai vizsgálati módszereket alkalmaztak, amelyek laboratóriumok között változtak. A vizsgálati változók, amelyekről úgy gondolják, hogy hozzájárulnak az eredmények változékonyságához, magukban foglalták a hozzáadott vírus mennyiségét, a vírustenyésztési rendszert (pl., embrionált tyúktojás versus szövettenyészet), az RDE-kezelés időtartama, a kezdeti szérumhígítás, az alkalmazott vörösvértestek típusa és Életkora, valamint a vörösvértestek ülepedésére engedélyezett idő (5, 11, 12). Meglepően, azonban, amikor Wood et al. a szezonális influenza elleni vakcinák európai tesztelésében részt vevő kereskedelmi és nyilvános laboratóriumi résztvevők számára részletes, követendő működési eljárást és közös reagenseket/anyagokat biztosítottak, arról számoltak be, hogy a laboratóriumok közötti variáció nem javult jelentősen (10). A szerzők feltételezték, hogy a tartós “helyi technikai eltérések”, valamint a különböző RBC-beszállítók befolyásolhatták a laboratóriumok közötti reprodukálhatóságot, de megjegyezték, hogy a további szabványosítás meghaladja a tanulmány megvalósíthatóságának határait. A későbbi publikációk úgy értelmezték ezeket a megállapításokat, hogy a Hai-vizsgálatok laboratóriumok közötti szabványosítása általában nem megvalósítható megközelítés a HAI-eredmények különböző laboratóriumok közötti harmonizálására (8, 12), és legalább egy csoport megpróbált egy módosított és robusztusabb HAI-vizsgálatot kidolgozni a megbízhatóbb és reprodukálhatóbb adatok előállítása érdekében (22).
a jelenlegi vizsgálatban a pcirn laboratóriumok szigorúan betartották a szabványt, nyilvánosan elérhető Egészségügyi Világszervezet HAI vizsgálati protokoll, amelyben a technikai vagy értelmező variációknak kitett pontokat harmonizálták a laboratóriumok között a vizsgálat megkezdése előtt. A kulcsfontosságú reagenseket (például RDE, RBC, víruskészletek) a lehető legnagyobb mértékben ugyanazoktól a beszállítóktól szereztük be. Ezenkívül a tesztelés korlátozása egyetlen technológusra minden teszthelyen lehetővé tette a fokozott szabványosítást. Az egyes laboratóriumokban több személyzet alkalmazásának lehetséges hatását ebben a vizsgálatban nem tesztelték. Bár több operátor alkalmazása potenciálisan növelheti a variabilitást, az egyetlen tanulmány, amely a HAI-vizsgálat lehetőségét vizsgálta, nem mutatott szignifikáns különbséget az ugyanazon laboratóriumban végzett két operátor eredményei között (22).
a vizsgálatban való felhasználásra termesztett vírustörzsek laboratóriumai közötti lehetséges eltéréseket minimálisra csökkentették a PCIRN laboratóriumok között azáltal, hogy egyetlen forrásból származó vírusmag-készleteket használtak, amelyeket ugyanabban a sejtvonalban termesztettek hasonló körülmények között minden laboratóriumban. Úgy gondoljuk, hogy a laboratóriumok közötti reprodukálhatóság még további fejlesztésekre is alkalmas lehet, ha a vírusmunka-készleteket központilag állítják elő és elosztják a részt vevő laboratóriumok között. A vírustörzsek variációinak fontosságát a HAI végpont titerek szempontjából jól szemlélteti az egyik vizsgálatban bemutatott 2-3-szor alacsonyabb titerek, amikor a HAI assay a/Cal pH1N1 törzset használt az X179A reasszortánshoz képest, amely még mindig egyenértékű hemagglutininekkel és neuraminidázokkal rendelkezett (11). Sajnos az állományokat nem szekvenálták e tanulmány részeként, ezért nem tudjuk ellenőrizni, hogy minden laboratórium azonos hemagglutinin szekvenciájú vírusokat használt-e. Még akkor is, ha a vírusállományok helyi szaporításával kisebb szekvenciaváltozásokat vezettek be, a laboratóriumok közötti változékonyság ebben a tanulmányban kicsi volt, ezért nehéz elképzelni, hogy az azonos HA szekvenciájú állományok használata hogyan csökkentheti tovább a variabilitást. Bár a különbségek nem haladták meg a 2-szeres ebben a kis mintakészletben, a vírusállományok helyi szaporításával bevezetett ha-szekvencia kisebb eltérései lehetnek az egyik lehetséges magyarázat a H1N1 titerek alulbecslésének és a H3N2 titerek túlbecslésének tendenciáira.
különböző vizsgálatok arról számoltak be, hogy az eredményeket a nemzetközi standardok (6, 11-13) alapján kalibrálva csökkentették a laboratóriumok közötti variabilitást a HAI-titerekben; ilyen szabványok azonban nem léteznek a jelenlegi szezonális influenza B és influenza A H3N2 vírustörzsekre, és a szezonális törzsek állandó antigéndrift-je, amely a vakcinák éves újrafogalmazását eredményezi, szükségessé teheti új szabványok folyamatos kidolgozását és validálását. Ebben a tanulmányban a laboratóriumok közötti összehasonlíthatóság jobbnak tűnik, mint a leghatékonyabb kalibrációs szabványok alkalmazásával. Például az IS 09/194 kalibrálást követően Wood et al. (11) arról számoltak be, hogy a különböző laboratóriumokban alkalmazott GMT-K közötti maximális különbségek 80-szorosról 64-szeresére csökkentek (azaz az érték még mindig észrevehetően magasabb, mint a jelenlegi vizsgálatban alkalmazott maximális 11—szeres), és hogy a laboratóriumok közötti GCV-tartományok 95% – ról 345% – ra (medián, 105%) 34% – ról 231% – ra (medián, 109%) csökkentek-vagyis jóval meghaladták a 0% – ról 156% – ra (medián, 27%). Hasonlóképpen, a csere használata 10/202 csökkentette a GCV-t a laboratóriumok között 108%-ról 157% – ra, 24% – ról 144% – ra öt minta között, és a laboratóriumok közötti maximális különbségeket 43-szorosról 21-szeresre (13), és a 07/150 szabvány alkalmazásával Stephenson et al. (6) a 15 NIBRG-14 H5N1 clade 1 minták medián GCV-jét 125% – ról (tartomány, 31% – ról 582% – ra) 61% – ra (34% – ról 535% – ra) csökkentette.
bár a pcirn laboratóriumok közötti magas szintű egyetértés pontos oka(i) a korábbi vizsgálatokhoz képest nem állapítható meg, sikerünket elősegítette az az ösztönzés, hogy nemzeti hálózatként a reprodukálható folyamatok létrehozásának közös célja felé törekedjünk. A helyszínek közötti részletes és szigorú folyamat-és reagensharmonizáció talán az egyetlen” új ” szempont, amelyet ebbe a tanulmányba hoztunk, összehasonlítva a laboratóriumok közötti gyenge hai-reprodukálhatóságot mutató szakirodalommal. Adataink azonban azt sugallják, hogy gondos szabványosítással, a Hai titerek laboratóriumok közötti variációi az egyes laboratóriumokban megfigyeltekhez hasonló szintre csökkenthetők. A laboratóriumokban a Hai titerek variációinak minimalizálása érdekében a következő lehetséges lépések a hálózatok/konzorciumok mozgósítása, a szabványos eljárások és reagensek használatára vonatkozó iránymutatások és/vagy szabályozási követelmények végrehajtása, a reprodukálhatóság biztosítására szolgáló szabványosított képzés, valamint a laboratóriumok támogatása és/vagy ösztönzése a “szabványosítás” koncepciójának elfogadására.