Bevezetés
A Co-immunprecipitáció, röviden A Co-IP, széles körben alkalmazott technika a fiziológiailag releváns fehérje-fehérje kölcsönhatások azonosítására célfehérje-specifikus antitestek felhasználásával közvetetten elfogni az ehhez a specifikus célfehérjéhez kötött fehérjéket. Az IP kiterjesztéseként a Co-IP nemcsak az elsődleges célpontot képes megragadni és megtisztítani, hanem más makromolekulákat is, amelyek natív interakciók révén kötődnek a célhoz. Az IP és a co-IP közötti különbség a kísérlet középpontjában áll. Az IP az elsődleges célpontra összpontosít, amely megköti az antitestet. Míg a Co-IP az antitest helyett a másodlagos célpontokat célozza meg, amelyek kölcsönhatásba lépnek az elsődleges fehérjékkel. Az immunprecipitációt követően a gyöngyökön rekedt fehérjéket megmossák és eluálják, hogy tisztított elsődleges és másodlagos célfehérjéket nyerjenek. Ezeket a célfehérjéket különféle módszerekkel lehet jellemezni, mint például a WesternBlot és a tömegspek analízis a shotgun stratégia alapján, a partner fehérje ID-k, a kötési affinitások, a kötődés kinetikája és az elsődleges fehérje felfedezetlen funkcióinak azonosítására.
kritikus tényezők a Co-IP-vel kapcsolatban:
hatékony technikaként a co–IP-t rendszeresen használják a biokémikusok a fehérje-fehérje kölcsönhatások feltárására. Míg a Co-IP módszertan egyszerű, a fiziológiás fehérje-fehérje kölcsönhatások azonosítása a Co-IP reakción keresztül nem könnyű, az interakció instabilitása, az IP reagensekhez való nem specifikus kötődés és az antitest szennyeződés miatt. A fenti problémák mindegyike negatív hatással lehet a fehérje-fehérje kölcsönhatások kimutatására.
fehérje komplexek Co-IP-je
mivel a co-IP függ a fehérje-fehérje kölcsönhatásoktól a kötött fehérjék kimutatásához, a fiziológiai kölcsönhatások kötési affinitása és stabilitása a teljes Co-IP folyamat során nagyon fontos. A nem megfelelő kötési idő és a kiterjedt mosási lépések csökkenthetik a kötési hatékonyságot, és a fehérje kölcsönhatás kimutatásának kudarcát okozhatják. Ezért olyan fehérjék esetében, amelyek várhatóan heti kötési affinitással vagy dinamikus kölcsönhatásokkal rendelkeznek, a fehérje-fehérje kölcsönhatások előzetes stabilizálására van szükség, például térhálósítási folyamatok végezhetők a Co-IP előtt.
nem specifikus kölcsönhatások
a sejtmembrán és az organellák törése nagy mennyiségű, a határ által elválasztott fehérje felszabadulását okozza. Ezért elkerülhetetlen, hogy nem specifikus kölcsönhatások, más szóval hamis pozitív kölcsönhatások lépjenek fel, amelyek zavarják az adatelemzést. Ez különösen gyakori azoknál a fehérjéknél, amelyek kibontott vagy rugalmas régiókkal rendelkeznek, amelyek viszonylag ragadósak és specifikusan kötődnek más fehérjékhez. Az ilyen problémák átélésének módjai lehetnek a lizátum preclearanciája primer antitestek felhasználásával a nem specifikus fehérjék eltávolítására, valamint a puffer Ionos erősségének megváltoztatása a nem specifikus kötődés csökkentése érdekében.
a Creative Proteomics egyedi kísérleti tervezést biztosít és finomítja a Co-IP paramétereket az ügyfelek igényei alapján. Megbízható Co-IP elemzést ígérünk a fehérje-fehérje kölcsönhatásokról tapasztalt tudósainkkal és technikusainkkal.
jellemzői Co-IP szolgáltatás:
- tanulmány közötti kölcsönhatások fehérjék és fehérje komplex
- Monitor dinamikája fehérje kölcsönhatás
- tanulmány fehérje-fehérje kölcsönhatás egy nem denaturáló állapotban, amely szinte fiziológiai
- feltérképezése kölcsönhatásban lévő domének fehérjék
A Co-IP szolgáltatás tartalmazza:
- kísérlet tervezés alapján a konkrét projekt igényeinek: pufferek, gyöngyök, antitestek, stb.
- paraméterek optimalizálása, például kötési idő
- Cellalízis, IP, mosás & elúció
- WesternBlot/ tömegspektrometria, a projekt igényeitől függően
- Adatelemzés & jelentés kézbesítése
rendelési eljárás:
