ha elegendő ideje és rezgésmentes környezete lenne, türelmesen várhatna, és a gravitációs erő a legtöbb szuszpendált részecskét a centrifugacső aljára hozná. A legkisebb részecskék valószínűleg szuszpenzióban maradnak a Brown-mozgás miatt, és a legtöbb makromolekula egyenletesen oszlik el, mert inkább oldatban, mint szuszpenzióban lennének. Nem tudom, ti hogy vagytok vele, de nekem nincs elég türelmem ahhoz, hogy kizárólag a gravitációra hagyatkozzak a szilárd anyag és a folyékony komponensek elválasztásában. Ezenkívül gyakorlati célokra a kapott pellet túl könnyen megzavarható lenne a szilárd anyag hatékony elválasztásához a felülúszótól. A gravitáció nem lenne szörnyen hatékony módszer a felfüggesztett anyagok méret vagy egyéb jellemzők alapján történő elválasztására.
Centrifugálási feltételek leírása
amikor egy Centrifugálási folyamatot anyagokban és módszerekben írunk le, ritkán szükséges a centrifugálás erejénél, idejénél és hőmérsékleténél többet jelenteni. A szükséges fordulatszám (rpm) az alkalmazott centrifugától és rotortól függ, amely laboratóriumonként változik. Így ritkán releváns a centrifuga gyártmányának,a rotor típusának vagy a sebességnek a jelentése.
A Centrifugálási folyamat
A centrifugálás olyan centripetális erőt eredményez, amely a gravitációs erő sok száz vagy ezerszerese lehet, ezáltal jelentősen felgyorsítja a folyamatot. Minél nagyobb a percenkénti fordulatszám (RPM), annál nagyobb a gravitációs erő. A centrifugálás hasznossága a sejtfrakcionálásban korlátozott lenne, ha csak annyit tehetnénk, hogy a szuszpendált részecskéket egy cső aljára vezetjük. A kutatók azonban a szuszpenzióban lévő részecskék fizikájának köszönhetően képesek ellenőrizni a lehozott részecskék méretét.
azonos sűrűségű, de különböző átmérőjű kerek részecskék szuszpenziójában az adott részecskét az aljára hajtó erő megegyezik annak tömegével, szorozva az alkalmazott gyorsulással. A részecske térfogata a sugár függvénye, tömege megegyezik a térfogatával, szorozva a sűrűségi együtthatójával, amely állandó. A gömb térfogata megegyezik a pi (állandó) 4/3-szorosával a sugár kockájának szorzatával. Az azonos sűrűségű gömb alakú részecskék szuszpenziójához meghatározott körülmények között az egyetlen változó, amely meghatározza az adott részecskére gyakorolt erőt, annak sugara.
az oldaton keresztüli mozgással szembeni ellenállás arányos a felület azon részével, amely áthalad a közegen. Hasonló alakú részecskék esetén a kisebb részecskék kevésbé ellenállnak, mint a nagyobbak. Mivel egy gömb felülete 4-szer pi-szerese a sugár négyzetének, és 4-szer pi állandó, akkor az azonos összetételű gömb alakú részecskék esetében az egyetlen változó, amely meghatározza az ellenállást egy adott körülmények között, a részecske sugara.
a hajtóerő a sugár kockájával arányosan növekszik. A mozgással szembeni ellenállás A sugár négyzetével arányosan növekszik. Nem nehéz belátni, hogy ahogy egy részecske sugara növekszik, úgy növekszik az alsó rész megközelítési hajlama is. Ha hozzáadunk egy jelentős mennyiségű ‘húzóerőt’, akkor a Galileo-nak tulajdonított gravitációs kísérlet végül is nem működik olyan jól. Mivel a nagy részecskék gyorsabban üledékeznek, mint a kis részecskék, a nyomozó elválaszthatja a nagyokat a kis organelláktól, sejtektől stb. egyszerűen a centrifuga menetidejének és fordulatszámának szabályozásával.
frakcionálás differenciál centrifugálással
egy tipikus sejt homogenizátum esetében 10 perc. spin alacsony sebességgel (400-500 x g) eredményez pellet álló töretlen szövet, egész sejtek, sejtmagok, és a nagy törmelék. Az alacsony sebességű pelletet hagyományosan nukleáris pelletnek nevezik. Egy 10 perc. a Spin mérsékelten gyors sebességgel, 10 000-20 000 x G erőkkel hozza le a mitokondriumokat a lizoszómákkal és a peroxiszómákkal együtt. Ezért a hagyományos sejtfrakcionálási séma második pelletjét mitokondriális pelletnek nevezzük.
a differenciális centrifugálással történő további sejtfrakcionáláshoz ultracentrifuga használata szükséges. Az ilyen műszert úgy tervezték, hogy forgórészeket forgasson nagy szögsebességgel, hogy nagyon nagy G erőket generáljon. A levegőt ki kell pumpálni a kamrából, hogy elkerülhető legyen a levegő súrlódása miatti hőfelhalmozódás. Valójában sok olyan rotor, amelyet ultracentrifugához terveztek, még aerodinamikailag sem épül fel, mivel vákuumban forognak. Egy órás nagy sebességű ultracentrifuga futás, amely 80 000 x g nagyságrendű erőt generál, mikroszomális pelletet eredményez. A mikroszómák közé tartoznak a membrán fragmensei, beleértve a sejtmembránt és az endoplazmatikus retikulumot. A membránfragmensek vezikulákat képeznek, ha vizes közegben megszakadnak, így a vizsgálat számos különböző méretű membrán vezikulát tárna fel. Maguk a vezikulák sűrűség alapján elválaszthatók a változó fehérjetartalom miatt. De ez egy másik dokumentum tárgya.
Spin néhány órán keresztül 150.000 x g, vagy úgy, és akkor hozza le riboszómák és még a legnagyobb makromolekulák. A fennmaradó felülúszó a citoplazma oldható komponenseiből áll, beleértve a sókat, a kis makromolekulákat és prekurzor molekulákat, valamint az oldott gázokat.