A. Nayak, P. Khare, M. K. Chourasia, O. Silakari és D. V. Kohli*
gyógyszerészeti tudományok Tanszék, Dr. Hari Singh Gour Vishwavidyalaya, Sagar-470 003, India
*megfelelő szerző: D. V. Kohli
gyógyszerészeti tudományok Tanszék, Dr. hari Singh gour Vishwavidyalaya, Sagar-470 003, INDIA
E-mail:
| Date of Submission | 25 March 2004 |
| Date of Revision | 06 July 2006 |
| Date of Acceptance | 05 November 2006 |
| Indian J Pharm Sci, 2006, 68 (6): 697-704 |
DOI: 10.4103/0250-474X.30999
Abstract
DNA triple helices offer new perspectives towards oligonucleotide-directed gene regulation. A kettős szálú DNS-hez kötődő hármas hélixképző oligonukleotidok különösen érdekesek, mivel inkább magára a génre irányulnak, mint annak mRNS-termékére (mint az antiszensz stratégiában). Ezen struktúrák némelyikének gyenge stabilitása azonban korlátozhatja azok használatát fiziológiai körülmények között. A specifikus ligandumok interkalálódhatnak a DNS hármas spiráljaiba, és stabilizálhatják őket. Ez az áttekintés összefoglalja a legújabb előrelépéseket ezen a területen, miközben kiemeli azokat a főbb akadályokat is, amelyeket még le kell küzdeni, mielőtt a triplex technológia terápiás génjavításra alkalmazható.
hármas spirál kialakulása (ábra. 1) a közelmúltban jelentős érdeklődés középpontjában állt az új molekuláris biológiai eszközök, valamint a terápiás szerek kifejlesztésének lehetséges alkalmazása, valamint a H-DNS struktúrák biológiai rendszerekben való lehetséges relevanciája miatt . Az intermolekuláris struktúrákban a DNS duplex oligopirimidin-oligopurin szekvenciáját egy harmadik szál oligonukleotid köti a fő horonyban .
1 .ábra: DNS hármas spirál
a hármas spirál két fő típusát írták le, a harmadik szál tájolásától függően. Az első jelentett hármas spirális komplexek pirimidikus harmadik szálat érintettek, amelynek kötődése a Hoogsteen hidrogénkötésein nyugszik a T-a bázispár és a timin, valamint a C-G bázispár és a protonált citozin között . A (T, C) tartalmú oligonukleotid az úgynevezett pirimidin motívumban párhuzamosan kötődik az oligopurin szálhoz. A hármas hélixek második kategóriája purinokat tartalmaz a harmadik szálban, amely az oligopurin szálhoz képest párhuzamosan orientált. C * G (G) és T * A (A)) a bázis hármasok egy reverz hoogsteen hidrogénkötési sémát követően alakulnak ki . A T-t és G-t tartalmazó oligonukleotidok hármas spirálokat is képezhetnek, amelyek orientációja az alapszekvenciától függ .
a hármas hélixképződés közvetlen eszközt kínál a génexpresszió szelektív manipulálására azokban a sejtekben, ahol a DNS hármas hélixek új perspektívákat kínálnak az oligonukleotid által irányított génszabályozás felé (ábra. 2). A szintetikus hármas hélixképző oligonukleotidok (tfos) nagy affinitással és specifitással kötődnek a purin szálhoz a homopurin – homopirimidin szekvencia fő barázdájában a kettős szálú DNS-ben .
2. ábra: A TFO-k megakadályozzák a mutált gén transzkripcióját
a TFO-k jó jelöltek arra, hogy helyspecifikus DNS-kötő szerként használják őket, és potenciális terápiás szerként való felhasználásukat vizsgálják. Antiszensz alkalmazásokban tanulmányozták őket, ahol az mRNS-ek megcélzására tervezték őket, antigén alkalmazások, ahol hármas hélix képződéssel szabályozzák a génexpressziót, valamint olyan alkalmazásokban, amelyek fehérjéket céloznak meg, ahol aptamer-ként használják őket .
a TFOs alkalmazható génterápiában is, ahol a mutált gén DNS-szekvenciáját célozzák meg annak megakadályozása érdekében transzkripció. A purinban gazdag traktusok gyakran megtalálhatók a gén promoter régiókban, és kimutatták, hogy az ezekre a szabályozó helyekre irányított TFO-k szelektíven csökkentik a megcélzott gének transzkripcióját, valószínűleg a transzkripciós aktivátorok kötődésének blokkolásával és/vagy iniciációs komplexek képződésével. A transzkripció Triplex által közvetített modulációja potenciálisan alkalmazható a terápiában, mivel felhasználható; például a betegség folyamataiban fontosnak tartott fehérjék szintjének csökkentésére. A TFO-k molekuláris eszközként is használhatók a génexpresszió tanulmányozására, és bizonyítottan hatékonyak az élő sejtek különböző géncélzási stratégiáiban. A TFO-k szekvenciaspecifikus módon kötődhetnek a DNS polipurin/polipirimidin régióihoz. Ennek a kötésnek a sajátossága felveti annak lehetőségét, hogy Triplex képződést alkalmazzanak az irányított genommódosításhoz, azzal a végső céllal, hogy javítsák az emberi sejtek genetikai hibáit. Számos tanulmány kimutatta, hogy az emlős sejtek TFO-val történő kezelése kiválthatja a DNS helyreállítását és rekombinációját olyan módon, amely felhasználható a kívánt szekvenciaváltozások bevezetésére. Számos olyan vizsgálatról számoltak be, amelyekben oligonukleotidokat használtak antigénvegyületekként a sejtekben .
hármas hélix DNS képződése
a hármas hélixképződés annak az eredménye, hogy az oligoinukleotidok nagy felismerési specifitással kötődnek a kettős spirális DNS fő barázdájához, hoogsteen típusú kötéseket képezve a Watson-Crick bázispárok purinbázisaival, a vegyületet racionálisan tervezték a génexpresszió mesterséges szabályozására . A Triplex képződéshez Mg2 + ionok szükségesek, míg a K+ ionok gátolják.
a hármas hélixben vagy antigénstratégiában az oligonukleotid hoogsteen-hidrogénkötés útján kötődik a kettős szálú DNS fő barázdájába, hogy hármas hélixet képezzen . A TFO-k megkötik a homopurin-homopirimidin szekvenciákat a kettős szálú DNS-ben. A triplex képződésnek négy szerkezeti motívuma van, amelyeket a harmadik szál összetétele és a duplex purinban gazdag szálához viszonyított orientációja alapján írtak le. A purin motívumú TFO-k (amelyek G-ből és A-ból állnak) G*G:C és A*A:T hármasokat alkotnak, és antiparallel orientációban kötődnek a duplex purinszálához képest. Másrészt a pirimidin motívumú TFO-K (C/T) triplexeket képeznek párhuzamos orientációban és általában csak alacsony pH-értéken, mivel a citozin bázisokat protonálni kell a Hoogsteen-kötések kialakításához; C+*G:C és T*A:T hármasokat alkotnak. Végül a kevert purin és pirimidin TFO-k párhuzamos vagy antiparallel orientációban kötődnek, és G*G:C és T*A:T hármasokat alkotnak. Az orientáció, amelyben a vegyes motívumú TFOs kötődik, a homopurin traktusban lévő GPA és ApG lépések számától függ . Az antiparallel orientációt nagyobb számú lépés részesíti előnyben, míg az alacsony lépések a párhuzamos orientációt részesítik előnyben .
miután meghatározták az adott célszekvencia kötésének legjobb motívumát, a természetes foszfodiészter oligonukleotidokkal kapcsolatos problémák korlátozzák az antigén megközelítés sikerét és általában az oligonukleotidok terápiás alkalmazását. A természetes foszfodiészter gerincű oligonukleotidok érzékenyek az endo-és exonukleázokra. Az oligonukleotidokat lebontó domináns aktivitás a 3 ‘ – exonukleáz aktivitás, de bizonyos körülmények között endonukleáz aktivitást is megfigyeltek . Így terápiás alkalmazásként in vivo a TFO-knak képesnek kell lenniük ellenállni mind az exonukleáz, mind az endonukleáz aktivitásnak a cél elérése érdekében. A tfos in vivo alkalmazásaihoz gerincmódosításra van szükség, amely nukleázrezisztenciát biztosít, de lehetővé teszi a nagy affinitású kettős szálú DNS-hez való kötődést.
a foszforodiamidát morfolino oligomerek módosított gerinc oligonukleotidok, amelyeket korábban antiszensz szerként vizsgáltak . A morfolino oligonukleotidok töltetlen gerincvel rendelkeznek, amelyben a DNS dezoxiribózcukrát hattagú gyűrűvel, a foszfodiészter-kötést pedig foszforodiamidát-kötéssel helyettesítik (ábra. 3). A morfolino oligonukleotidok rezisztensek az enzimatikus lebomlással szemben, és úgy tűnik, hogy antiszensz szerként működnek azáltal, hogy megállítják a transzlációt vagy zavarják a pre-mRNS splicinget, nem pedig az RNáz H aktiválásával . Sikeresen eljuttatták őket a szövettenyészet sejtjeibe olyan módszerekkel, amelyek fizikailag megzavarják a sejtmembránt, és egy tanulmány, amely összehasonlította ezeket a módszereket, megállapította, hogy a kaparásterhelés volt a leghatékonyabb szállítási módszer; mivel azonban a morfolino gerinc töltetlen, a kationos lipidek nem hatékonyak a morfolino oligonukleotid felvételének mediátorai a sejtekben . Egy nemrégiben készült jelentés Triplex képződést mutatott morfolino oligonukleotiddal, és a nem ionos gerinc miatt ezek a vizsgálatok azt mutatták, hogy a morfolino oligonukleotid magnézium hiányában képes triplex képződésre .
3.ábra: a foszfodiészter DNS és a morfolino szerkezeti bemutatása
a kationok fontos szerepet játszanak a hármas hélixképződésben. Amikor foszfodiészter oligonukleotidokat használnak TFO-ként, általában magnéziumra van szükség a triplex képződéséhez purinnal és vegyes motívumú TFO-kkal; felgyorsítja a reakciót és stabilizálja a pirimidin motívumú TFO-kkal képződött triplexet . Kimutatták, hogy más kétértékű kationok ugyanolyan kapacitással működnek, mint a magnézium a triplex képződés tekintetében . A magnézium a sejtben ~0,8 mM, a vérben ~1,5 mM koncentrációban fordul elő, de a legtöbb in vitro triplex reakciót 5-10 mM MgCl2-ben hajtják végre. A kálium a sejtben ~140 mM, a vérben pedig 4 mM koncentrációban fordul elő. A magas káliumkoncentrációk gátolhatják a triplex képződést guaninban gazdag oligonukleotidokkal, amelyeket TFO-ként terveztek más másodlagos DNS-struktúrák, például dimerek és quadruplexek előnyben részesítésével . Szükséges lesz leküzdeni a foszfodiészter tfos korlátozott képességét, hogy triplexet képezzen alacsony magnéziumban és magas káliumszintben, hogy élettani körülmények között hatékonyak legyenek. A morpholino TFOs egy nemrégiben végzett vizsgálatában a triplex képződést magnézium és kálium hiányában igazolták. Ezek a tulajdonságok teszik a morpholino TFOs-t jó jelöltekké a további vizsgálatokhoz antigénterápiaként.
molekuláris modellezés
a DNS triplex szerkezetét molekuláris modellezési technikákkal lehet felépíteni olyan koordináták felhasználásával,amelyek helyesen veszik figyelembe a (T, C) motívumú hármas hélixek cukor konformációját . Ez a szerkezet közelebb áll a B-formájú DNS-hez , amint azt az NMR vizsgálatok jelentették, összehasonlítva a javasolt szerkezettel, szálas röntgen-diffrakció alapján. A JUMNA program lehetővé teszi a DNS-struktúrák felépítését spirális paramétereik szerint . Az interkalációs hely könnyen létrehozható a triplexben, ha megduplázza az emelkedési paramétert két szomszédos T * A-Ra (emelkedés = 6,8!), majd ezt követően a két hármas közötti csavarási paramétert 34-ről 16-ra csökkenti a kötéstávolság-korlátok csökkentése érdekében.
molekuláris modellezéssel bemutatható egy párhuzamos hármas spirál kialakításának lehetősége, amelyben az egyszálú kölcsönhatásba lép a kisebb horonyban lévő ÉP duplexsel, új bázis kölcsönhatások révén .
a jumna spirális és belső koordináták (vegyérték és dihedrális szögek) keverékét használja a nukleinsav rugalmasságának leírására. A spirális paraméterek mindegyik 3 ‘ monofoszfát nukleotidot egy rögzített tengelyű rendszerhez viszonyítva helyezik el. Az egymást követő nukleotidok közötti csomópontokat másodfokú korlátozásokkal tartják fenn az O5′ – C5’ távolságokon. A Descartes-féle koordináta-programokkal kapcsolatos változók csökkentett száma mellett a fizikailag értelmes változók megválasztása nagy, összehangolt konformációs lépéseket tesz lehetővé a minimalizálás során, a szerkezet hatékony ellenőrzésével és a korlátok vagy korlátozások egyszerű bevezetésével együtt. A rendelkezésre álló eszközök magukban foglalják mind az adiabatikus leképezést, mind a kombinatorikus kereséseket a kiválasztott szerkezeti paraméterek tekintetében. A Flex erőtér sajátosságai közé tartozik egy adott kifejezés jelenléte a hidrogénkötés szögfüggőségének figyelembevételére, valamint az elektrosztatikus energia szűrésének lehetősége szigmoidális dielektromos funkcióval, 6 (R) =D-(D-D0)/2 exp (-RS), ahol R a két töltés közötti távolság. A meredekség S, a fennsík értéke nagy távolságra Dés a kezdeti érték D0 a függvény alapértelmezett értéke 0,16, 80, illetve 1,A kisebb horonyú hármas spirál felépítéséhez már alkalmazott két feltételezés felhasználásával . Először is, az alap hármasokat visszafogják, hogy koplanárisak legyenek, hogy elkerüljék az esetleges interbase triplet kölcsönhatásokat. Az ilyen kölcsönhatások könnyen kialakulnak a kifeszített hélixek felépítése során, de nem játszhatnak szerepet a felismerésben vagy a szálcserében, mivel ezek a folyamatok függetlenek a teljes szekvenciától. Megvizsgáltuk, hogy a kisebb horonyú triplex optimalizált szerkezete független-e ezektől a korlátozásoktól. A második feltételezés, összhangban a RecA/ DNS komplexek sztöchiometriájával, amely RecA monomerenként három nukleotidot mutat, a trinukleotid spirális szimmetriájának alkalmazása. Ezért az előzetes vizsgálatok a trinukleotid ismétlődésű szekvenciákra korlátozódtak.
speciális korlátozásokra vagy korlátozásokra van szükség a triplex felépítéséhez és manipulációjához. Ezek közé tartoznak a korábban leírt” plató ” korlátozások és a trinukleotidszimmetria korlátok . A “fennsík” visszatartás fenntartja a hármas halmazt alkotó bázisok co-planaritását, miközben lehetővé teszi az alappár kapcsolásához szükséges forgásokat és elmozdulásokat. A trinukleotid szimmetriakorlátja magában foglalja a három nukleotid egymást követő csoportját leíró változók ekvivalenciáját. A dsDNS nyújtását úgy, hogy a csavar csökken, és a kisebb horony kinyílik, korábban a trinukleotid szimmetriaegység O3′ terminális atomjai közötti távolság korlátozásával sikerült elérni. Ezt a rögzítést kissé módosították, mivel az O3 ‘- O3 ‘ távolság megváltoztatható a gerincek oldalirányú elmozdulásával a szálcsere során. Egy nemrégiben végzett munkában csak az O3’ – O3 ‘ vektor komponense volt a hélix tengelyével párhuzamos. A horony szélességének korlátozásait numerikus Poisson-Boltzmann elektrosztatikus számítások segítségével kalibrálták, hogy elkerüljék a horony szűkülését az explicit oldószermolekulák hiánya miatt .
az Alappár kapcsolását alapforgatással tanulmányozzuk, a Bernet et al. Ez magában foglalja a glikozid kötés (purin: C1′-N9 vagy pirimidin: C1′-N1) és a bázispár két C1′ atomját összekötő vektor közötti, a helyi spirális tengelyre merőleges síkra vetített szöget. θ értéke 55° kanonikus B-DNS-t. Modellező bázis pár váltás a kiválasztott alap magában foglalja egy adiabatikus változás a θ-tól 65° – ig 10° – ig lépéseket a 2° miközben mind a “plató” nyújtás korlátozások.
a hármas hélix kialakulása során tapasztalt akadályok és korlátok
a TFO-K biológiai alkalmazásait alapvető biofizikai megfontolások, valamint a fiziológiai körülmények által előírt korlátozások veszélyeztetik. A Triplex kialakulása magában foglalja a negatív töltésű harmadik szál megközelítését és kötését egy kettős negatív töltésű duplexhez. A töltésvisszataszítás semlegesítését általában kísérletileg Az Mg++ (5-10 mM) szintje biztosítja, amely sokkal magasabb, mint amiről azt gondolják, hogy elérhető a sejtekben . Ezenkívül a triplex képződés konformációs változásokat von maga után a harmadik szál részéről, valamint az alatta lévő duplex némi torzulását . A pirimidin motívum triplexek fiziológiai pH-n instabilak a citozin protonáció igénye miatt, amely viszonylag savas pH-n történik (pKa = 4,5). Ez szükséges a második Hoogsteen hidrogénkötéshez, bár az ebből eredő pozitív töltés nyilvánvalóan fontosabb hozzájárulást jelent a triplex stabilitásához . A szomszédos citozinokat tartalmazó pirimidin motívum triplexek gyakran kevésbé stabilak, mint az izolált citozinokkal rendelkezők. Hagyományosan ezt a töltés-töltés taszító hatásoknak tulajdonítják, bár egy nemrégiben készült tanulmány szerint a szomszédos citozinok hiányos protonálása lehet a kritikus tényező . Ezenkívül a purin motívum harmadik szálai (amelyek G gazdagok) g tetrádokat képezhetnek a K+ fiziológiai szintjén, amelyek gátolják a triplex képződését . Mindezek a tényezők kinetikus korlátokat szabnak a triplex kialakulására, és csökkentik a triplexek stabilitását (a legtöbb Triplex, még optimális körülmények között is in vitro, kevésbé stabil, mint a mögöttes duplex .
stratégiák a korlátozások ellensúlyozására
a hármas spirális antigén stratégiában felmerülő első és legfontosabb probléma a tfos által létrehozott triplex instabilitása fiziológiai körülmények között, ami következésképpen korlátozza ennek a nagyon érdekes stratégiának a felhasználását, amely a génkorrekcióra szolgál változó mértékben. Ezért különböző megközelítéseket és stratégiákat javasoltak a kialakult hármas spirális szerkezet stabilitásának biztosítására.
az oligonukleotid irányított hármas spirálok stabilizálhatók nukleinsav ligandumok alkalmazásával, amelyek szelektíven stabilizálják a hármas spirálokat. Például az etidium-bromidról kimutatták, hogy megköti és stabilizálja a poli (dT)·poly (dA) (dt) három hélixet, amely csak t·a (DT)) t hármasból áll . Ez a vegyület azonban rosszul stabilizálja (vagy akár destabilizálja) azokat a hármas hélixeket, amelyek mind T·A-t, mind C·G-t tartalmaznak C+ bázis hármasok, valószínűleg az elektrosztatikus taszítás eredményeként . A benzopiridoindol-származékok voltak az első molekulák, amelyekről azt jelentették, hogy erősen stabilizálják ezt az utóbbi típusú hármas hélixet, annak ellenére, hogy előnyben részesítik a T·A T szakaszokat . Számos más interkalátorról, valamint különféle DNS kisebb horony ligandumokról is kimutatták, hogy kötődnek a DNS hármas spiráljaihoz. Például a hármas hélixek stabilizálhatók az oligonukleotidok kémiai módosításával, például az oligonukleotidokhoz kapcsolódó psoralénről kimutatták, hogy fokozza biológiai aktivitásukat az UV besugárzást követően . Az interkalátorok általában nagyobb mértékben stabilizálják a T·A-t tartalmazó hármas hélixeket, míg a kisebb horonykötők általában destabilizálják a triplexeket, kivéve azt az esetet, amikor a hármas hélix RNS-szálat tartalmazott . Mivel a hármas hélix-ligandum komplexekről nem állnak rendelkezésre szerkezeti adatok, nem sokat tudunk azokról a kölcsönhatásokról, amelyek a specifikus interkalációt hármas hélixekké irányítják. Kimutatták, hogy a BPI-származékok Interkalálnak a T·A A T Bázistriplettek között a fluoreszcencia energia gerjesztésével az alaptriplettekről a ligandumokra, valamint lineáris és körkörös dikroizmussal . Megállapították, hogy a pirimidin-párhuzamos morfolino oligonukleotidok képesek triplexet képezni duplex célponttal. Ahogy az várható volt, ez a motívum alacsony pH-t igényelt a triplex képződéshez, amint azt a pirimidin-párhuzamos motívum foszfodiészter TFO megköveteli. Lehetséges, hogy ezt a pH-függőséget olyan szubsztitúciókkal lehet leküzdeni, mint a TFO citozinjainak 5-metil-citozinja .
alternatív megközelítés, amellyel a hármas hélixek stabilizálhatók, az oligonukleotidok kémiai módosításai, például egy akridin molekula kovalens kötődése révén . Kimutatták, hogy az akridin szubsztitúció erősen fokozza a restrictin enzim hasításának gátlását, és nem rontja a triplex képződésre vonatkozó szekvencia specificitást .
a hármas hélix DNS alkalmazása
az intermolekuláris DNS hármas hélixek kialakulása lehetőséget kínál kiterjedt szekvenciafelismerő tulajdonságokkal rendelkező vegyületek tervezésére, amelyek antigénként vagy eszközként hasznosak lehetnek a molekuláris biológiában . Az elmúlt évtizedben egy új megközelítés, amely a DNS-analógokat terápiás szerként használja, megjelenik a gyógykémiában. Ennek alapja a betegséggel kapcsolatos fehérjék/enzimek génjeinek expressziójának szabályozása transzkripciójuk (antigén) vagy transzlációjuk (antiszensz) blokkolásával (ábra. 4). A komplementer oligonukleotidok szekvenciaspecifikus kötődése a DNS duplexhez triplex képződéssel, hogy gátolják az mRNS termelését, vagy zavarják az utóbbi fehérjékké történő transzlációját. Mivel az oligonukleotidok nem jutnak könnyen a sejtekbe, és a sejtmagok elpusztíthatják őket, az oligonukleotidok különféle kémiailag módosított analógjait tervezik, szintetizálják és értékelik terápiás szerként történő kifejlesztés céljából.
4. ábra: Az antigén és antiszensz terápiák alapelvei
a homopurin-homo pirimidin régiók specifikus felismerése a duplex DNS-ben triplexképző oligonukleotidokkal (TFOs) vonzó stratégiát nyújt a genetikai manipulációhoz, amelynek végső célja az emberi sejtek genetikai hibáinak kijavítása. A mutációk megcélzásának képessége hasznosnak bizonyulhat a DNS-javítás tanulmányozásának eszközeként, valamint a génterápia és a géntechnológia technikájaként .
hármas spirálokon alapuló hatékony eszközöket fejlesztettek ki különféle biokémiai alkalmazásokhoz, például nagyon specifikus mesterséges nukleázok kifejlesztéséhez. Az antigénstratégia továbbra is a triplex alkalmazásának egyik legérdekesebb területe a génexpresszió szelektív szabályozására (1.táblázat). A genomi szekvenciák célzása ma már értékes koncepciónak bizonyult még mindig korlátozott számú tanulmány esetében; a helyi mutagenezis ebben a tekintetben a triplexképző oligonukleotidok érdekes alkalmazása sejttenyészeteken .
| Target gene | Cell line | Oligomersize, andmodifications |
|---|---|---|
| Transfected genes CAT gene/ IL ?2Rpromoter CAT gene/(6-16) IRECAT gene/tkpromoter PRE upstream Endogenous genes IL-2R c-myc SV 40 T Ag Antivirals SV 40 HIV-1 |
HSB2 cells (T-cell) HeLacells cv-1 cells Human lymphocytes HeLacells Tsa 8 cells CV-1 MT4 |
15-mer acridine orpsoralenlinked 21-mer 38-mer colesterol 28-mer 27-mer 15,20-mer PNAs 8-mer, acridine 31,38-mers |
Table 1: Antigén nukleinsav vizsgálatok eukarióta Sejtekben80
az Antigénstratégiák elsősorban a homológ rekombinációval vagy hármas hélixképző oligodeoxinukleotidokkal történő géncélzásra összpontosítanak . Számos technikai okból, beleértve a nagyon korlátozott génhozzáférhetőséget az erősen maláriakondenzált, fehérjébe csomagolt kromoszómaszerkezeten belül, ezeknek a módszereknek a klinikai alkalmazása nem haladt gyorsan. Kielkopf és munkatársai a közelmúltban egy alternatív megközelítést írtak le, amely poliamidokat használ, amelyek diffundálhatnak a magba, és felismerik a specifikus DNS-szekvenciákat . Bár nagyon izgalmas, ez a módszertan még gyerekcipőben jár, és végső klinikai hasznossága továbbra sem ismert .
az antigén technológia terápiás alkalmazásai
A Triple helix DNS felkeltette a figyelmet, mivel a TFO-k terápiás szerként alkalmazhatók, például intracelluláris géncélzásra, racionális kémiai oldatokként a DNS-duplex szekvencia specifikus felismerésére és a sejtnövekedésért és a rosszindulatú transzformációért felelős gének azonosítására . Ezzel a tudással jött a természetes vágy, hogy lefordítani ezt az információt az új, cél-specifikus terápiás stratégiák a rák kezelésére, szív-és érrendszeri betegségek, és más gyakori betegségek az emberiség (2.táblázat). A BCR/abl fehérje tirozin kináz viszonylag specifikus biokémiai inhibitorának közelmúltbeli fejlesztése krónikus mielogén leukémiában szenvedő betegeknél lenyűgöző példa erre a küldetésre . A közvetlenül a betegséget okozó gének pótlására, javítására vagy letiltására irányuló terápiák esetében a fejlődés sokkal lassabb volt, és a biokémiai bcr/abl inhibitorral egyenértékű sikert még el kell érni. Ennek okai összetettek, és az alkalmazott gén-irányított terápia típusától függően változnak .
| Disease | Cause |
|---|---|
| Cancer Viral infection Endocrinological Bacterial Neurological Autoimmune Parasite |
Uncontrolledcellgrowthfrommutationalactivation and activation of oncogenes Replication of virus in host cellse.g., HIV,HSC, influenza Abnormallevels of-renin, angiotensinaseorvasopressin precursor (highbloodpressure)-transforminggrowth factor(kidneyfailure)-growth hormone(acromegaly)-gastrins (ulcers) Antibioticresistant tuberculosis, mycoplasmas-blocking of 3’terminus of16s RNA Lesins in β-amyloid gene (Alzhiemer’sdisease) Inadvertantproduction of antibodiesagainst normal tissues (degradation of host tissue -arthritis, myasthenia gravis), blocking β-cell, Igcellor T-cell receptor genes byantisense Haempolymeraseproduction (malariablockingexpressions of haempolymerase), alvási betegség(trypansoma) |
2.táblázat: néhány betegség, amely DNS-terápiákkal kezelhető
Stephenson és Zamecnik kimutatta, hogy egy rövid (13nt) DNS-oligonukleotid reverz komplementer szekvenciában (antiszensz) a Rous szarkóma vírussal szemben gátolja a vírus replikációját a tenyészetben. Az antiszensz és antigén oligonukleotidok egyik legfontosabb tulajdonsága terápiás alkalmazásukban a nukleázrezisztencia. A foszforotioát oligonukleotidok a viszonylag magas nukleázrezisztenciával rendelkező oligonukleotidok leggyakoribb típusa, amelyeket citomegalovírus által kiváltott retinitis elleni gyógyszerként vezettek be a piacra . A 2′-O,4′-C – etilén nukleinsav (ENA) maradékkal rendelkező oligonukleotidok a 3′ végtől a második helyen sokkal nagyobb nukleázrezisztenciát mutatnak, mint az azonos helyzetben lévő zárt nukleinsav (LNA) maradékkal rendelkezők .
bár Kurreck et al arról számolt be , hogy az LNS oligonukleotidok stabilak voltak a humán szérumban, a részben módosított ena oligonukleotidok sokkal nukleáz-rezisztensebbek voltak, mint a patkány plazmában lévő lna oligonukleotidok. Ezenkívül a 3′ és 5′ végén ena-maradékokkal összefüggő oligonukleotidok nagyobb stabilitást mutatnak, mint a részlegesen módosított oligonukleotidok. Így az ENA oligonukleotidok nagy potenciállal rendelkeznek, mint antiszensz és antigén szerek, amelyek in vivo alkalmazhatók . A szekvencia-specifikus triplex képződést géncélzásra, géncsendesítésre és mutagenezisre lehet alkalmazni .
jövőbeli kilátások
az oligonukleotidok hármas hélixképződéssel köthetik a helyet-kifejezetten egy érdekes célgénhez. A Triplex-képző oligonukleotidokat jelenleg úgy tervezték, hogy kötődjenek a HER-2 (humán epidermális növekedési faktor receptor 2)/ neu génhez, egy olyan génhez, amely túlzottan expresszálódik számos emberi daganatban, beleértve a nem kissejtes tüdőrákot, emlőrákot, petefészekrákot és GI tumorokat. Ez a stratégia széles körben alkalmazható számos onkogén vagy más rákkal kapcsolatos gén expressziójának megakadályozására. Ezeket az” antigén ” oligonukleotidokat most arra használják, hogy DNS-alkilező szereket juttassanak a HER-2/neu promoter és kódoló szekvencia specifikus bázisaihoz, hogy megakadályozzák a transzkripció iniciációját és megnyúlását. Különösen triplexképző oligonukleotidokat alkalmaztak nitrogén mustár, például klórambucil, a HER-2/neu gén specifikus guaninbázisához a génexpresszió megakadályozása érdekében. A DNS-aktív gyógyszerekhez kapcsolt antigén oligonukleotidokat érintő célspecifikus rákellenes stratégia mérföldkőnek bizonyul a közeljövőben.
- Thuong, N. T. és Helene, C., Angew. Kémia. Int., 1993, 32, 666
- Mirkin, S. M. és Frank-Kamenetskii, M. D., Annu. Biophys Tiszteletes.Biomol. Struct., 1994, 23, 541.
- Patrizia, A., Paola B. A., Jean-Louis, M., Therese G., Claude H. andJian-Sheng S., Nucl. Sav. Res., 2002, 30, 5407.
- Sun, J. S. és Helene, C., Curr. Opin. Struct. Biol., 1994, 3, 345.L. A., L. A., L. A., L. A., L. A., L. A., L. A., L. A., L. A., L. A., L. A., L. A., L. A., L. A., L. A., L. A., L. A., L. A., L. A., Helene, C., Nucl. Sav. Res., 1987,15, 7749.
- Moser, H. E. és Dervan, P. B., Science, 1987, 238, 645.
- Beal, P. A. és Dervan, P. B., Tudomány, 1991, 251, 1360.
- Pilch, D. S., Levenson, C. és Shafer, R. H., Biokémia, 1991, 30,6081.B. A., B. A., B. A., B. A., B. A., B. A., B. A., B. A., B. A., B. A., B. A., B. A., B. A., B. A., B. A., B. A., B. A., B. A., B. A., B. A., B. A., B. A.. Sav. Res., 1996, 24, 1136.
- McGuffie, E. M. és Catapano, C. V., Nucl. Sav. Res., 2002, 30,12, 2701.
- Basye, J., Trent, J. O., Gao, D. és Ebbinghaus, S. W., Nucl. Sav.Res., 2001, 29, 4873.
- Helene, C. és Toulme, J. J., Biochem. Biophys. Acta., 1990,1049, 99.
- Helene, C., Eur. J. Rák, 1994, 30, 1721.
- Stein, C. A. és Cheng, Y. C., Tudomány, 1993, 261, 1004.
- Wagner, R. W., Természet, 1994, 372, 333.
- Praseuth, D., Guieysse, A. L., Helene, C., Biochem. Biophys.Acta., 1999, 1489, 181.G. G., Duval-Valentin, G., Montay-Garestier, T. és Helene, C., C. R. Acad. Sci., 1991, 313, 585.
- Gamper, H. B. J., Kutyavin, I. V., Rhinehart, R. L., Lokhov, S. G., Reed,M. W. és Meyer, R. B., Biokémia, 1997, 36, 14816.Eder, P. S., DeVine, R. J., Dagle, J. M. és Walder, J. A., AntisenseRes. Dev., 1991, 1, 141.Fischer, T. L., Terhorst, T., Cao, X. és Wagner, R. W., Nucl. Sav.Res., 1993, 21, 3857.
- Stein, D., Foster, E., Huang, S. B. ,eller AcidDrugDev., 1997, 7, 151.
- Summerton, St AcidDrugDev., 1997, 7, 63. Summerton, Antis AcidDrugDev., 1997, 7, 187.
- Hudziak, R. M., Barofszk. AcidDrugDev., 1996, 6,267.
- Ghosh, C., Stein,D. ,eller, 2000, 313, 135.
- Giles, R.V., Spiller, D.G., Clark, R.E. and Tidd, D.M., AntisenseNucl. AcidDrugDev., 1999, 9, 213.
- Ghosh, C. and Iversen, P.L., AntisenseNucl. AcidDrugDev.,2000, 10, 263.
- Lacroix, L., Arimondo, P.B., Takasugi, M., Helene, C. and Mergny,J.L., Biochem. Biophys. Res. Commun., 2000, 270, 363.
- Rougee, M., Faucon, B., Mergny, J.L., Barcelo, F., Giovannangeli, C.,Garestier, T. and Helene, C., Biochemistry, 1992, 31, 9269.
- Maher, L.J., Dervan, P.B. and Wold, B.J., Biochemistry, 1990, 29,8820.
- Singleton, S.F. and Dervan, P.B., Biokémia, 1993, 32, 13171.B. A., B. A., B. A., B. A., B. A., B. A., B. A., B. A., B. A.,B. A., B. A., B. A., B. A., B. A., B. A., B. A., B. A., B. A., B. A., B. A., B. A., B. A., B. A., B. A., B. A., B. A., B. A., B. A., B. A., B. A., B. A., B. A., B. A., B. A., B. A. Sav. Res., 1999, 27, 695.
- Darnell, J., Lodish, H. és Baltimore, D., in; molekuláris sejtbiológia Tudományos amerikai könyvek, New York, 1990, 531.suda, T., Misima, Y., Asakura, H. és Kominami, R., Nucl. Sav.Res., 1995, 23, 3771.
- Olivas, W. M. és Maher, L. J., Nucl. Sav. Res., 1995, 23, 1936.a második világháború után az Egyesült Államok és az Egyesült Államok is részt vett a harcokban.Sav. Res., 1996, 24, 3858.
- Faruqi, A. F., Krawczyk, S. H., Matteucci, M. D. és Glazer, P. M.,Nucl. Sav. Res., 1997, 25, 633.
- Blume, S. W., Guarcello, V., Zacharias, W. és Miller, D. M., Nucl.Sav. Res., 1997, 25, 617.
- Ouali, M., Letellier, R., Adnet, F., Liquier, J., Sun, J. S., Lavery, R. andTaillandier, E., Biokémia, 1993, 32, 2098.
- Macaya, R. F., Schultze, P. és Feigon, J., J. Amer. Kémia. Soc.,1992, 114, 781.
- Radhakrishnan, I. és Patel, D. J., Biokémia, 1994, 33, 11405.
- Arnott, S., Bond, P. J., Selsing, E. és Smith, P. J. C., Nucl. Sav.Res., 1976, 3, 2459.
- Lavery, R. és Sklenar, H., J. Biomol. Struct. Dyn., 1988, 6, 63.
- Bertucat, G., Lavery, R. és Prevost, C., J. Biomol. Struct. Dyn.,1998, 16, 535.
- Lavery, R., Peyrard, M., Szerk. In; nemlineáris gerjesztés inbiomolekulák, Springer-Verlag, Editions de Physique, Berlin and NewYork, 1995, 57.Hingerty, B. E., Richtie, R. H., Ferrell, T. L. és Turner,je, Biopolimers, 1985, 24, 427.
- Bernet, J., Zakrzewska, K. és Lavery, R., J. Mol. Struct.Theochem., 1997, 398-399, 473.
- Pesco, J., Salmon, J. M., Vigo, J. és Viallet, P., Anális. Biochem.,2001, 290, 221.
- Gilbert, D. E. és Feigon, J., Curr. Opin. Struct. Biol., 1990, 9, 305.
- 50. Simizu, M., Konishi, A., Simada, Y., Inoue, H. és Ohtsuka, E.,FEBS. Lett., 1992, 302, 155.
- Asensio, J. L., Carr, R., Brown, T. és Lane, A. N., J. Amer.Kémia. Soc., 1999, 121, 11063.
- Asensio, J. L., Lane, A. N., Dhesi, J., Bergqvist, S. és Brown, T., J. Mol. Biol., 1998, 275, 811.
- Volker, J. és Klump, H. H., Biokémia., 1994,33, 13502 .Sugimoto, N., Wu, P., Hara, H. és Kawamoto, Y., Biokémia.,2001, 40, 9396.
- Arimondo, P. B., Garestier, T., Helene, C. és Sun, J. S., Nucl. AcidRes., 2001, 29, 15.
- Michael, M., Seidman, M. M. és Peter, M. G., J. Clin.Fektessen be., 2003,112, 487.Panas Scaria, P. V. és Shafer, R. H., J. Biol. Kémia., 1991, 266,5417.
- Mergny, J. L., Collier, D., Rougee, M., Montay-Garestier, T. andHelene, C., Nucl. Sav. Res., 1991, 19, 1521.
- 59. Mergny, J. L., Duval-Valentin, G., Nguyen, C. H., Perrouault, L., Faucon, B., Rougee, M., Vintay-Garestier, T., Bisagni, E. andHelene, C., tudomány, 1992, 256, 1681.
- Lee, J. S., Latimer, L. J. P. és Hampel, K. J., Biokémia, 1993, 32,5591.
- Park, Y. W. és Breslauer, K. J., Proc. NAT. Acad. Sci. USA,1992, 89, 6653.
- Durand, M., Thuong, N. T. és Maurizot, J. C., J. Biol. Kémia., 1992,267, 24394.
- Durand, M., Thuong, N. T. és Maurizot, J. C., J. Biomol. Struct.Dyn., 1994, 11, 1191.
- Kulka, M., Smith, C. C., Aurelian, L., Meade, K., Miller, P. és Ts ‘ o,P. O. P., Proc. NAT. Acad. Sci. USA, 1989, 86, 6868.
- Chang, E. H., Miller, P. S., Cushman, C., Devdas, K., Pirolo, K. F., Ts ‘ op. O. P. és Yu, Z. P., Biokémia, 1991, 30, 8283.
- Pilch, D. S. és Breslauer, K. J., Proc. NAT. Acad. Sci. USA,1994, 91, 9332.ez az első alkalom, hogy a világ minden tájáról, a világ minden tájáról, a világ minden tájáról, a világ minden tájáról, a világ minden tájáról, a világ minden tájáról, a világ minden tájáról, a világ minden tájáról, a világ minden tájáról, a világ minden tájáról, a világ minden tájáról, a világ minden tájáról., Garestier, T. és Helene, C., J. Mol. Biol., 1993, 232, 926.
- Kim, S. K., Sun, J. S., Garestier, T., Helene, C., Bisagni, E., Rodger, A. és Norden, B., biopolimerek, 1997, 42, 101.
- Lin, S. B., Kao, C. F., Lee, S. C. és Kan, L. S., AnticancerDrugDes., 1994, 9, 1.
- Grigoriev, M., Praseuth, D., Robin, P., Hemar, A., Saison-Behmoaras,T., Dautry-Varsat, A., Thuong, N. T. és Helen, C., Proc. NAT.Acad. Sci. USA, 1991, 88, 3389.Grigoriev, M., Praseuth, D., Robin, P., Hemar, A.,Saison-Behmoaras, T., Dautry-Varsat, A., Thuong, N. T., Helen,C. és Harel-Bellan, A., Proc. NAT. Acad. Sci. USA, 1992, 267, 3389.Gowers, D. M. és Fox, K. R., Nucl. Sav. Res., 1999, 27, 1569.
- 73. Nagatsugi, F., Sasaki, S., Miller, P. S. és Seidman, M. M., Nucl.Sav. Res., 2003, 15, 31.
- Melton, D. W., BioEssays, 1994, 16, 633.Helene, C., rák, 1994, 30, 1721.
- Majumdar, A., Khorlin, A. és Dyatkina, N., Nat. Genet., 1998, 20,212.
- Kielkopf, C. L., Baird, E. E. és Dervan, P. B., Nat. Struct. Biol.,1998, 5, 104.
- Alan, M. és Gewirtz, M. D., J. Clin. Onkol., 2000, 18, 1809.
- Rao, N. R. és Nalluri, B. N., Ind. J. Pharm. Edu., 2003, 37, 132.
- Varmus, H. E., I. Biosci. Ismétlés, 1990,10,413.
- Fearon, E. R. és Dang, C. V., Current Biol., 1999, 9, R62.
- Hahn, W. C., Counter, C. M. és Lundberg, A. S., Természet, 1999, 400 464.
- Druker, B. J. és Lydon, N. B., J. Clin. Fektessen be., 2000, 105, 3.
- Stephenson, M. L. és Zamecnik, P. C., Proc. NAT. Acad. Sci.U. S. A., 1978, 75, 285.
- gear ge Farmakokinet.,2002, 41, 255.
- Morita, K., Hasegaw Med. Kémia.Lett., 2002, 12, 73.
- Kurreck, Nu sav.Res., 2002, 30, 1911. K. K., K. K., K. K., K. K., K. K., K. K., Abe, K., Obika, S. és Imanishi, T., Nucl. Sav. Res., 2003, 31, 3267.