Encephalitozoon a cuniculi III törzs az Encephalitozoonosis egyik oka mind az emberekben, mind a kutyákban

absztrakt

a Mikrosporidiák kötelező intracelluláris eukarióta organizmusok, amelyek gerinces és gerinctelen gazdaszervezetekben találhatók. Az Encephalitozoon cuniculi gyakran megtalálható házi nyulakban és rágcsálókban, valamint kutyákban, más kutyákban és főemlősökben, beleértve az embereket is. A riboszomális RNS gének DNS-szekvenálását alkalmazták ezen paraziták fajszintű azonosítására és az E. cuniculi I., II. és III.törzsek meghatározására. nyolc új kutyaizolátumot jellemeztek E. cuniculi III. törzsként molekuláris módszerekkel. Ezt a törzset immunhiányos emberek izolátumaiban is azonosították, ami arra utal, hogy ennek a parazitafaj zoonotikus potenciálja van. A tünetmentes kutyákból elhúzódó mikroszporidiális spórahulladékról is beszámoltak.

az Encephalitozoon cuniculi a Microspora törzs kötelező intracelluláris protozoonja, és a házinyulak és rágcsálók gyakori parazitája. Esetenként ezeket a parazitákat más gazdaszervezetekben is jelentették, beleértve a kutyákat, a kék rókákat (Alopex lagopus) és néhány más vadon élő ragadozót . Egyre több jelentés írja le az E. cuniculi által okozott humán klinikai betegséget is, de az emberi fertőzés forrása(I) ismeretlen .

történelmileg a parazita Azonosság morfológiai és néha ultrastrukturális tulajdonságokon alapult. Az utóbbi időben az Encephalitozoon nemzetség morfológiailag hasonló tagjait az immunológiai jellemzők és a riboszomális RNS gének molekuláris jellemzése alapján specializálták . Az E. cuniculi izolátumait tovább osztottuk I., II vagy III törzsként, a riboszomális RNS gén belső átírt távtartó (ITS) régiójában lévő 4-bázis szekvencia (5′-GTTT-3′) ismétléseinek száma alapján . Két kutya E. cuniculi izolátumot jelöltek ki III törzs 4 szekvencia ismétlés jelenléte alapján . Ezt követően 4 humán izolátumot azonosítottak III törzsként (“Donovan” GenBank X98466, CDC:V282 és IPZ:MX-H5 izolátumok) és I törzsként két európai jelentésben . Ez a tanulmány kiterjeszti ezt a munkát az azonosítással 8 további kutya izolátumok E. cuniculi tól től 4 járványok törzsként III. bár epidemiológiai adatok nem igazolták közvetlenül a kutya-ember átvitelét, a molekuláris adatok arra utalnak, hogy a kutyák paraziták potenciális tározóiként szolgálhatnak. Ezenkívül dokumentálták a spórák tünetmentes kutyák általi hosszú távú leválását, ami tovább erősíti a parazita zoonózisos átvitelének valószínűségét.

anyagok és módszerek

Parazitaizolátumok

7, 3 nem rokon alomból és 1 kutyából származó kölyök testét 18 hónap alatt a Texasi Állatorvosi diagnosztikai laboratóriumba küldték postmortem értékelésre. Az állatok négy független forrásból származtak Texas különböző régióiból. Az encephalitozoonosis diagnózisát minden esetben szövettani eredmények alapján állapították meg. Nyolc parazita izolátumot állapítottak meg az állatok friss szöveteiből: 5 izolátumot nyertek az 5-7 hetes Boston terrier kiskutya alomtársainak agy – vagy veseszöveteiből (2 férfi, 3 nő), akik neurológiai betegségben haltak meg (1-5 izolátum, 1.alom). Izolátum 6 származik az agy egy 10 hetes hím Máltai terrier volt 1 4 alomtestvérek (alom 2), hogy meghalt neurológiai betegség. A 7-es izolátumot egy 10 hetes nőstény miniatűr uszkár kiskutya (3.alom) agyából nyerték, amely neurológiai betegségben halt meg. A 8-as izolátumot egy 18 hónapos nőstény miniatűr tacskó veséjéből származtatták, amely veseelégtelenségben halt meg (1.táblázat).

a halál után a szöveteket aszeptikusan gyűjtöttük és homogenizáltuk (Ten Broeck tissue homogenizer; Corning, Corning, NY) PBS, pH 7 alkalmazásával.2, plusz 2 db antibiotikus-antimikotikus oldat (Gibco, Gaithersburg, MD). A mikroszporidiális spórákat a gazdaszövet homogenizátumából egy korábban leírt Percoll sűrűség gradiens módszerrel tisztítottuk, amelyet a centrifugálási sebesség 600 g-ra változtatásával módosítottunk . A mikroszporidiumokat RK-13 sejtekben (ATCC CCL-37) tenyésztettük RPMI 1640 táptalaj felhasználásával, kiegészítve 5% magzati szarvasmarha szérummal és 2 db antibiotikus-antimikotikus oldattal (gibco), amint azt korábban leírtuk . A parazitakultúrát és a DNS-elemzést több hónapon keresztül végezték a különböző esetminták beérkezése alapján, így a véletlen keresztszennyeződés lehetősége elhanyagolható volt.

DNS izolálás

Az 1-6.és 8. izolátumokban parazitákat tenyésztettek rövid távú tenyészetben, hogy megfelelő spórákat hozzanak létre a molekuláris jellemzéshez. A 7. izolátum esetében a parazitákat közvetlenül megtisztítottuk a friss kölyökkutya agyszövetéből DNS-izolálás céljából. A legtöbb izolátum esetében a DNS-t tisztított spórákból extraháltuk Instagene mátrix (BioRad, Hercules, CA), a gyártó baktériumtenyészetekre vonatkozó protokollját követve . A 6.és 8. izolátummal végzett molekuláris munka egy részében a spórákat a korábban leírtak szerint dolgozták fel, és a DNS-t a spórákból standard fenolkloroform extrakciós módszerrel extrahálták egy particionáló gél mikrofugacsöves rendszer alkalmazásával (light phase Lock Gel system; 5 Prime 6 Prime Manufacturer , Westchester, PA) a DNS-helyreállítás optimalizálása érdekében. A DNS-t etanolból kicsapták, a pelletet te-ben reszuszpendálták (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7,6), és a DNS-koncentrációt UV spektrofotometriával A260 : A280 arányokkal becsülték meg (Ultraspec Plus; Pharmacia, Piscataway, NJ). Az Encephalitozoon hellem szövetkultúrából származó spóráiból kivont DNS—t pozitív kontrollként használták, és minden extrakciós és szekvenálási reakcióban csak reagens negatív kontrollt alkalmaztak.

DNS részleges szekvenálása és a kis alegység riboszomális DNS (SSU rRNS) génjének elemzése

az SSU rRNS gén 5′ végének egy részét mind a 8 izolátumból pmp1 és PMP2 primer pár alkalmazásával amplifikáltuk, amint azt korábban leírtuk . A polimeráz láncreakciót (PCR) minden izolátum esetében a gyártó utasításainak megfelelően hajtottuk végre (GeneAmp PCR core reagents, N808-0009; Perkin-Elmer Cetus/Roche Molecular Systems, Branchburg, NJ). Az erősítést termikus ciklerben végeztük (PTC-200 Peltier; MJ Research, Watertown, MA). A kezdeti denaturálás után 5 percig 95 CAC-n, Taq polimerázt (0,5 U)adtunk minden 25-oC-os reakcióhoz. A mintákat ezután 35 denaturációs cikluson (94 60 C, 30 s), hőkezelésen (60 C, 30 s) és hosszabbításon (72 C, 1 perc), majd 10 min 72 C, a végső meghosszabbítás érdekében. A Be nem épített nukleotidokat kromatográfiás oszlopokkal (Micro Bio-Spin 30; BioRad) távolítottuk el. A mintákat 4CC-n tartottuk, amíg automatizált szekvenálás céljából feldolgozták.

az ITS régió DNS-analízise

az egyes izolátumok riboszomális RNS génjének its régiójának egy részét PCR-rel amplifikáltuk az int530f és int580r primer párral , a fent leírt amplifikációs módszerek alkalmazásával. A kapott PCR-terméket egy automatizált DNS-szekvencerben szekvenáltuk (377.modell; Perkin-Elmer Applied Biosystems/Roche Molecular Systems, Branchburg).

DNS automatizált szekvenálás

az egyes izolátumok PCR-amplifikált DNS-ét automatizált szekvencia céljából amplifikáltuk egy kereskedelmi készlettel (ABI Prism Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready-Reaction Kit; Promega, Madison, WI) a gyártó utasításait követve. Az összes reakciót egy termociklerben (MJ Research Minicikler) futtattuk. A mintákat ezután 35 denaturációs cikluson (94 60 C, 30 s), hőkezelésen (60 C, 30 s) és hosszabbításon (72 C, 1 perc), majd 10 min 72 C, a végső meghosszabbítás érdekében. A hosszabbító termékeket kromatográfiás oszlopokkal tisztítottuk (Micro Bio-Spin; BioRad), vákuumcentrifugában szárítottuk (Savant Instruments, Holbrook, NY), és -20 C-on tároltuk, amíg egy automatizált szekvenszerben szekvenáltuk (Perkin-Elmer 377 ABI Applied Biosystems).

az összehangoló szoftver (Sequencher; Génkódok, Ann Arbor, MI)használatával az SSU rRNS gén egy részéhez konszenzusos szekvenciákat kaptunk minden egyes parazita izolátumhoz. Ezeket a szekvenciákat homológia szempontjából értékelték a korábban jelentett Encephalitozoon szekvenciákkal szemben az NCBI GenBank adatbázisban egy egyszerű BLASTN keresés segítségével.

kettős szálú DNS heteroduplex mobilitási vizsgálat

a 6-os izolátum DNS-ét PCR-rel amplifikáltuk az int530f és int580r primer párral, amint azt korábban leírtuk . A PCR-amplifikált termékeket heteroduplexek és homoduplexek előállítására vizsgáltuk különböző gazdaszervezetekből származó E. cuniculi korábban jellemzett izolátumainak felhasználásával.

eredmények

szövetkultúrában összesen 8 parazita izolátumot állapítottak meg 4 különálló klinikai kitörésből. Mind a könnyű mikroszkopikus jellemzők, mind az in vitro növekedési jellemzők arra utaltak, hogy E. cuniculi, egy mikroszporidián, amelyet korábban kutyákban és más gazdaszervezetekben jelentettek. Az egyes izolátumok SSU rRNS génjének 5′ végének részleges szekvenálása (GenBank AF144246–AF144253) megerősítette a paraziták azonosságát E. cuniculi, mivel minden minta 100% – os homológiát mutatott a korábban közzétett szekvenciákkal (GenBank L39107dEZORGOA, L17072¦EZORGSMALL; X98470¦ECDSSRR2).

a riboszomális RNS gén its régiójának Heteroduplex analízise és szekvenálása tovább jellemezte az összes kutya izolátumot III-as törzsként, megerősítve a korábbi jelentéseket az E. cuniculi különféle rágcsáló, nyúl és emberi gazdaszervezetek izolátumai közötti finom eltérésekről. Az 1. ábra a 6. kutya izolátum és egy korábban jellemzett III. törzs izolátum közötti DNS homoduplex képződést, valamint a 6. izolátum és a többi E. cuniculi törzs közötti heteroduplex képződést szemlélteti.

Vita

az E. cuniculi több törzsének biológiai jelentősége még nem tisztázott; azonban a parazita törzsek megkülönböztetésének képessége eszközt nyújthat a fertőzés forrásainak nyomon követésére epidemiológiai vizsgálatok. A molekuláris adatok azonosító 8 mikrosporidian izolátumok kutyák E. cuniculi törzs III egyetértenek egy korábbi tanulmány, amely besorolt 2 kutya izolátumok törzs III . Nyúl, egér és róka izolátumokat jelentettek I. vagy II. törzsként . Ezek az adatok arra utalnak, hogy a III-as törzs túlnyomórészt kutyákkal hozható összefüggésbe. Az emberi izolátumokat a nyugati féltekén III. törzsként, Európában pedig I. törzsként azonosították . Bár az emberi expozíció forrása(I) E. a cuniculi ismeretlen, egyre több bizonyíték van arra, hogy az állatok fertőzéshordozóként szolgálhatnak, és fennáll a zoonózis átvitelének lehetősége az állatok és az emberek között. Érdekes lehetőség, hogy a kedvtelésből tartott állatok tulajdonjogának földrajzi és kulturális különbségei szerepet játszhatnak az emberi expozícióban, mivel a kutyák az Egyesült Államokban gyakori háziállatok, míg a nyulakat Svájcban és más európai országokban gyakran háziállatként vagy táplálékként tartják.

a klinikailag normális bostoni terrier szülőktől és az 1. alomból származó 1 kölyöktől származó széklet-és vizeletminták vizsgálata alacsony spóraszintet mutatott az alomtársak halála után 4 hónappal (1-5 izolátum; nem publikált adatok). Ez a megfigyelés azt is sugallja, hogy lehetséges mechanizmus a paraziták közvetlen vagy közvetett átvitelére a kutyákról az emberekre a lokalizált környezet szennyeződése révén a kutya vizeletével és székletével. Bár egyetlen epidemiológiai vizsgálat sem értékelte a kedvtelésből tartott állatok tulajdonjoga/expozíciója és a humán mikroszporidiális fertőzések közötti kapcsolatot, egyetlen esetben, amikor a gyermekeket nyílt encephalitozoonosisban szenvedő kölyökkutyáknak tették ki, 1 gyermek közül 3 szerokonvertált. A különféle gazdaszervezetekből származó további E. cuniculi izolátumokat elemezni kell a potenciálisan fertőzött háziállatok fenntartásának kockázatának további értékelése érdekében a mikroszporidiális fertőzések magas kockázatának kitett immunhiányos személyek háztartásaiban.

Köszönetnyilvánítás

Köszönjük Jay Hoffman, Joanne Mansell és Bruce Abbitt texasi Állatorvosi diagnosztikai laboratóriumi patológusoknak, hogy kutyaszöveteket biztosítottak ehhez a tanulmányhoz.