fluoreszcens címkézés

meghatározás

a fluoreszcens címkézés a fluoreszcens színezékeknek a biomolekulákban található funkcionális csoportokhoz való kötésének folyamata, hogy fluoreszcens képalkotással (fluoreszcens képalkotással) láthatóvá váljanak nature.com). az új fluoroforok elérhetősége drámaian megváltoztatta a biomolekulák érzékeny detektálásának lehetőségeit és kölcsönhatásaik elemzését. A továbbfejlesztett fluoreszcens festékek lehetővé teszik a sejtszerkezetek és sejtfolyamatok korábban lehetetlen tanulmányozását. A fluoreszkáló címkék számos előnnyel járnak, mivel alacsony koncentrációban is nagyon érzékenyek, hosszú ideig stabilak, és nem zavarják a célmolekulák működését. A címkézett sejtek célzott képalkotása lehetővé teszi azok in vitro és in vivo nyomon követését. Különböző fluoroforok használata ugyanabban a mintában lehetővé teszi több molekula egyidejű megfigyelését is. A leggyakrabban használt fluoroforok a fluoreszcein izotiocianát (FITC), a rodamin (TRITC), a kumarin és a cianin származékai. Ezeket a szintetikus szerves színezékeket használják a biomolekulák fehérjék, peptidek, antitestek, nukleinsavak, baktériumok vagy élesztő jelölésére. A természetben előforduló fluorokrómok, például a zöld fluoreszcens fehérje (GFP) szintén felhasználhatók az élő sejtek genetikai címkézésére.

• fluoreszcens fehérje címkézés
  a fluoreszcens címkézés lehetővé teszi a kutatók számára, hogy megvizsgálják a fehérjék konformációs dinamikáját és molekuláris kölcsönhatásait, vagy nyomon kövessék mozgásukat annak érdekében, hogy jobban megértsék biológiai funkcióikat (Modesti M, 2011). A receptor-ligandum kötődés, a fehérje struktúrák és az enzimaktivitás jobb megismerése érdekében az egyes peptidek is címkézhetők. A fluorokróm jelölt antitesteket széles körben használják az orvosbiológiai kutatásokban az antigének kimutatására immunfluoreszcens vizsgálatokban, és az immundiagnosztika alapvető eszközei is. A megbízható eredmények biztosítása érdekében a fluorofor konjugáció nem befolyásolhatja az antitest antigénkötő tulajdonságait (Nath N et al, 2016).
• nukleinsavak fluoreszcens jelölése
  a fluoreszcencia alapú vizsgálatok fontos szerepet játszanak a nukleinsavak szerkezetének, funkciójának és dinamikájának biofizikai vizsgálataiban. A címkézési módszerek és képalkotó rendszerek legújabb fejlődése lehetővé tette a DNS és az RNS közvetlen in vivo megfigyelését, valamint a más sejtkomponensekkel való kölcsönhatásukat. A nukleinsavak élő sejtes képalkotása új utakat nyitott meg a kromatin szerveződésének és a génexpresszió szabályozásának jobb megértéséhez. (Dirks RW et al, 2018).
• a poliszacharidok fluoreszcens címkézése
  komplex poliszacharidok, például heparin az extracelluláris mátrix szerkezeti komponensei. Ezek a poliszacharidok elengedhetetlenek a sejtek adhéziójához, migrációjához és növekedéséhez (Prigent-Richard S. et al, 1998). Egyes vegyületek antikoaguláns, antitrombotikus, gyulladáscsökkentő, antivirális és antiangiogén tulajdonságaikról is ismertek. A fluoreszcencia alapú módszerek megkönnyítik az új bioaktív poliszacharidok azonosítását és biológiai funkcióik jellemzését (Roger O et al, 2002).
• a lipidek fluoreszcens címkézése
  a celluláris lipidek döntő szerepet játszanak a sejtben az energiatárolásban, a sejtmembránok kialakulásában és az intracelluláris jelátviteli folyamatokban (Maekawa M. and Fairn G, 2014). A nílusvörös lipofil festéket széles körben használják az intracelluláris lipidek festésére, hogy elemezzék helyüket és szervezetüket (Greenspan P et al, 1985). Ezenkívül a lipiddinamika tanulmányozásához az élő sejtek specifikus címkézése is lehetséges (Schultz C et al, 2010).

fluoreszcens Címkézési technikák

az általánosan használt fluoreszcens címkézési módszerek kémiai, enzimatikus, peptid / fehérje címkét és genetikai címkézési technikákat alkalmaznak (Sahoo H, 2012 , Toseland CP, 2013).

• kémiai címkézési technikák: a Fluoroforok kémiai módosítással (kovalens vagy nem kovalens kötés) dokkolnak a célmolekulákhoz. A kémiai címkézési módszereknek számos előnye van, mivel robusztusak, könnyen végrehajthatók és nagyon hatékonyak a fluoroforok széles választékával. Inkább in vitro vizsgálatokra alkalmasak, mint in vivo.
• enzimatikus címkézési technikák: az enzimatikus reakciók gyors, rendkívül hatékony és szelektív címkézést tesznek lehetővé in vivo és in vitro, és felhasználhatók fehérjék vagy egész sejtek megcélzására. A címkék nagy mérete miatt azonban interferenciák léphetnek fel a célmolekulák funkciójával.
• peptid/fehérje címke: egy nemrégiben kifejlesztett és nagyon ígéretes technika lehetővé teszi a fehérjék specifikus és szelektív címkézését rövid fluoreszcens címkék beépítésével, amelyek nem zavarják a molekula hajtogatását vagy működését. Ez a technika könnyen elvégezhető, és felhasználható az egyes fehérjék különböző helyeinek vizsgálatára a peptidcímke specifitásától függően.
• genetikai címkézés: a genetikai címkézés protein domének, kis peptidek vagy egyetlen aminosav felhasználásával érhető el, amelyek fluoreszcens színezékekkel vannak jelölve, és specifikusan kapcsolódhatnak a kromoszómák mentén lévő helyekhez in vivo. Ez a megközelítés lehetővé teszi a kromoszóma rendellenességek, például deléciók vagy duplikációk kimutatását.
• Többszínű címkézés: Az élő sejt képalkotás és az áramlási citometria alkalmazásainak általános követelménye az a képesség, hogy egyszerre több fluoreszcensen címkézett fehérjét kövessenek vagy detektáljanak. Erre a célra kifejezetten nagyon nagy Stokes-eltolódású festékeket lehet használni, amelyek lehetővé teszik a különböző biokémiai folyamatok egyidejű megfigyelését.

fluoreszcencia alapú vizsgálatok

a fluoreszcencia alapú vizsgálatok a fluoroforok azon képességére támaszkodnak, hogy a fényrészecskéknek vagy fotonoknak való kitettség után újra fényt bocsátanak ki. A gerjesztő fény és az emissziós fény hullámhosszának különbsége, az úgynevezett Stokes-eltolódás mikroszkópokban és képalkotó rendszerekben kimutatható. Minden fluorofornak van egy specifikus Stokes-eltolódása. A különböző vizsgálatok lehetővé teszik a kutatók számára, hogy lokalizálják a biomolekulákat, valós időben megfigyeljék őket, megvizsgálják kölcsönhatásaikat és tanulmányozzák az enzimatikus aktivitást.

• fluoreszcens mikroszkópia
  a fluoreszcens mikroszkópia lehetővé teszi a sejtek és a sejtkomponensek azonosítását, valamint a sejtek fiziológiájának nagy specificitású monitorozását. A fluoreszcens mikroszkópia optikai szűrők segítségével választja el a kibocsátott fényt a gerjesztő fénytől. Két mutató használata lehetővé teszi a különböző biomolekulák egyidejű megfigyelését is. Míg a hagyományos képalkotó rendszerek a fizikai diffrakciós határértékek miatt 200-300 nm felbontást tesznek lehetővé, az új szuperfelbontású fluoreszcens mikroszkópok, mint STED (stimulált emisszió-kimerülés), leküzdik ezeket a határokat, és betekintést nyújtanak a molekulák nanoméretű világába (Sanderson MJ et al, 2014).
• áramlási citometria
  Az áramlási citometriát széles körben használják az alapkutatásban és a klinikai gyakorlatban a specifikus fluoroforok jelének mérésére. A sejteket és a részecskéket ” valós időben “elemzik és sorolják, amikor áthaladnak a detektorok fénysugarán, amelyek számszerűsítik a jelölt antitestek vagy ligandumok által termelt fluoreszcenciát. Ezek a markerek specifikus molekulákhoz kötődnek a sejt felszínén vagy a sejt belsejében, lehetővé téve azok kimutatását és számszerűsítését. Számos paraméter, például méret és térfogat mérhető egyetlen sejten, és különböző sejttípusok izolálhatók és jellemezhetők (Nolan JT and Condello D, 2013). Az áramlási citometria széles körben alkalmazható olyan területeken, mint az immunológia, a hematológia, a transzplantációs orvoslás, az onkológia és a genetika.
• fluoreszcencia in situ hibridizáció (FISH)
  a fluoreszcencia in situ hibridizáció (FISH) lehetővé teszi specifikus DNS-szekvenciák lokalizálását a kromoszómákon. Fluoreszcens DNS-vagy RNS-próbákat használnak a hibridizáláshoz és a komplementer cél DNS-szekvenciák azonosításához. A halakat hagyományosan a kromoszómák génjeinek feltérképezésére használják, például az emberi genom projekt során. Ma a fluoreszcencia in situ hibridizációt elsősorban diagnosztikai célokra használják a kromoszóma rendellenességek kimutatásában vagy a rákos sejtek elemzésében (O ‘ Connor C, 2008).
• fluoreszcencia korrelációs spektroszkópia (FCS)
  fluoreszcencia korrelációs spektroszkópia (FCS) lehetővé teszi a fluorokrómok fluoreszcencia intenzitásának időbeli változásainak elemzését, amelyeket kémiai, biológiai vagy fizikai hatások okoznak. Az FCS – t először a gyógyszerek és a DNS közötti kölcsönhatás vizsgálatára vezették be, és ma már érzékeny eszköz a fehérjék koncentrációjának és aggregációjának meghatározására, valamint a molekuláris kölcsönhatások megfigyelésére (Tian Y et al, 2011).
• mikroarray
  a mikroarray lehetővé teszi a génexpresszió vizsgálatát különböző körülmények között. Több ezer gén vizsgálható egyszerre a DNS-chipeken. Ezek olyan mikroszkopikus diák, amelyek apró foltokkal vannak nyomtatva, amelyek ismert DNS-szekvenciákat tartalmaznak, amelyek szelektíven kötődnek a fluoreszcens jelölt mRNS / cDNS molekulákhoz. A hibridizáció után a DNS-chipet kiolvassák, és az adatokat génexpressziós profilok létrehozására használják (Hoen PAC et al, 2003).

fluoreszcens címke: élő sejtes képalkotás

a sejtes folyamatok kinetikus megfigyelése time-lapse fluoreszcens mikroszkóppal a sejtbiológia alapvető technikájává vált, mivel az élő sejtes képalkotás nagyon értékes betekintést nyújthat a sejtnövekedésbe és a transzport mechanizmusokba. A time-lapse mikroszkópia egyik fő kihívása a fototoxikus hatások minimalizálása fotobleaching. A fénykibocsátás fokozatosan elpusztítja a fluoreszcens molekulákat, ami a fluoreszcencia jel csökkenéséhez és szabad gyökök képződéséhez vezet, amelyek károsíthatják a sejteket. Ezért az élő sejtes képalkotás módszere szempontjából döntő fontosságú, hogy megtalálja az egyensúlyt a fényexpozíció lehető legnagyobb mértékű csökkentése és a sejtek megfigyelésére szolgáló hasznos jelek megszerzése között. A tudósoknak olyan fiziológiai környezetet is létre kell hozniuk, amely lehetővé teszi az in vivo dinamika szoros megismétlését. (Ettinger és Wittmann T, 2014).

PromoCell fluoreszcens címkézés

az új fluoroforok elérhetősége drámaian megváltoztatta a biomolekulák érzékeny detektálásának lehetőségeit és kölcsönhatásaik elemzését. A továbbfejlesztett fluoreszcens festékek lehetővé teszik a sejtszerkezetek és sejtfolyamatok korábban lehetetlen tanulmányozását. A PromoCell kiváló minőségű fluoroforok széles skáláját kínálja a különféle biomolekulák fluoreszcens címkézéséhez: fehérje címkézés, antitest címkézés, nukleinsav címkézés (DNS címkézés, RNS címkézés), valamint teljes címkézési készletek és használatra kész fluoreszcens konjugátumok.

PromoFluor színezékeink költséghatékony alternatívái a jól ismert, vezető fluorofóroknak, és a kéktől a távoli vörösig terjedő hullámhosszú spektrumot fedik le. Kiemelkedő fluoreszcens intenzitást és fotostabilitást, erős fényelnyelést, magas fluoreszcens kvantumhozamot és jó vízoldhatóságot mutatnak, és felhasználhatók fluoreszcens mikroszkópiához, fluoreszcens in situ hibridizációhoz (Fish), fluoreszcens korrelációs spektroszkópiához (FCS) és mikroarray-khez (fehérje, DNS). Némelyikük extra nagy Stokes váltást kínál, ami ideálissá teszi őket Többszínű címkézéshez vagy áramlási citometriás alkalmazásokhoz. PromoFluor színezékek állnak rendelkezésre pl. NHS-észterekként, maleimidekként és amino-módosított címkékként készen állnak a kovalens kapcsolásra, vagy konjugátumként biotinnal, falloidinnal és dezoxinukleotidokkal (dutp-k). Ezenkívül kiváló minőségű fehérjét is kínálunk & antitest címkéző készletek különböző PromoFluor színezékekkel.