kísérleti
címkézése RuBisCo:
Aedans(454): donor F(58): elfogadó
kötelező vizsgálatok:
feltételek:
ADP bullet: GroEL komplex kötött GroES és ADP
ApoGroEL: csak GroEL COMLEX (használt korábbi kötési vizsgálatok rubisco szubsztrát)
Lin et al. megállapította, hogy:
1. Különbség volt a BOSSZANKODÁSBAN, amikor a szubsztrát az ADP golyó transz gyűrűjéhez kötődik az apoGroEL gyűrűhöz.
– ez nyilvánvaló volt a donor fluoreszcencia (B.)
– Ez a fehérje szubsztrát konformációjának különbségét jelezte.
 |
 |
2. Talált egy” passzív ” kibontakozó szubsztrát fehérjék kötődik apoGroEL gyűrű.
– Ez a kibontakozás azonban sokkal lassabban történt, mint GroEL funkcionális reakcióciklusa.
3. Az ADP bullet transz-gyűrűhöz kötött hordozó kevésbé “passzív” kibontakozása van.
– megerősítette ezt a proteáz emésztési vizsgálatok.
– Ez azonban a fiziológiailag relevánsabb komplexum.
– tehát ez egy maximálisan hatékony szint, vagy csak a reakcióciklus első lépése?
a fiziológiai relevancia teszteléséhez ATP-t adtak az ADP Golyóreakcióhoz, és megfigyelték a FRET-et
 |
ATP hozzáadása után ATP-t találtak: – egy kezdeti gyors, kényszerített konformáció bővítése a szubsztrát – majd egy lassabb tömörítési fázis – nyilvánvaló ábra b |
 |
 |
-A C ábra azt jelzi, hogy a tömörítési fázis kinetikája függ a Groes koncentrációjától, Vagyis függ a komplex ezen mechanizmusától.
– míg a tágulási fázis független GroES koncentráció.
arra a következtetésre jutott, hogy a kibontakozásnak két fázisa van:
– lassú passzív kibontakozás a szubsztrát miatt kötődik a GroEL kamra transz gyűrűjéhez (az első kötési kísérletből)
– gyors, ATP-vezérelt kibontakozás a GroEL kamra konformációs változása miatt.
gyors kibontakozó nem GroES függő:
– feleslegben egy gyűrűs GroEL variáns, SR1 használtuk GroES csapda.
– az SR1 nem képes megkötni a szubsztrátot és katalizálni a kibontakozó reakciót, de képes megkötni és megkötni a GroES-t, hogy meghatározza a reakció függőségét a szubsztrát megkötésétől.
– megállapították, hogy a FRET által figyelt gyors kibontakozás a GroES sapka jelenléte nélkül történt, az ezt követő tömörítési szakasz pedig nem.
– Ez azt jelzi, hogy a gyors expanziós fázis az ATP-kötés által kiváltott GroEL konformációs változásától függ.
így .. szükséges-e az aljzat kibontása a produktív hajtogatáshoz?
– Ez egy lényeges lépés, és fontos, hogy GroEL / GroES összecsukható mechanizmus?
– azt találták, hogy a nem natív RuBisCo frakciója, amely a natív állapotban jelenik meg, arányos a kibontakozás mértékével.
– ennek vizsgálatához meg akarták mérni a szubsztrát lassú, passzív kibontakozását önmagában a GroEL kötés miatt (nem ATP
függő)
– ismét az SR1 kötődését használták a szubsztrátumhoz, ezúttal nem atrap – ként, hanem a szubsztrát passzív kibontakozó kötőhelyeként.
– Az SR1 inkubációs ideje korrelál a kibontás mennyiségével, mivel a kibontás csak a szubsztrát kötődésének köszönhető.
– megállapították, hogy összefüggés van a natív fehérje kibontakozásának mennyisége között.
– így a kényszerű kibontakozása GroEL / GroES egy hatékony módja annak, hogy támogassák a kibontakozó mechanizmus
szükséges a megfelelő fehérje összecsukható.
 |
 |
 |
 |