Vita
Az ebben a munkában javasolt image citometriás módszer bemutatja az élő sejtek autofágiájának gyors és hatékony elemzésének képességét olyan potenciális gyógyszerek szűrésére, amelyek indukálhatják vagy gátolhatják az autofágikus tevékenységeket, például elősegítik a neurodegenerációval összefüggő rosszul összehajtott fehérjék clearance-ét, vagy gátolják a rákkal kapcsolatos gyógyszerrezisztenciát. A jelenlegi módszerek korlátozását képcitometriával és egyedi reagensekkel lehet leküzdeni az autofágia kimutatására szolgáló új módszer kifejlesztése érdekében. A Cellométer látását korábban fluoreszcens sejtalapú vizsgálatokhoz használták (Chan et al., 2011, 2012b; Robey et al., 2011), és kimutatták, hogy a CITO-ID autofágia festék specifikusan festi az autofágoszómákat az élő sejtekben. Ebben a munkában kimutatták, hogy a CITO-ID festék kolokalizálódik RFP-LC3 éhezett HeLa sejtekben, amelyek tovább igazolják a festék specifitását. A kifejlesztett képalapú autofágia detektálási módszert összehasonlítjuk a standard áramlási citometriával az autofágia aktivitás eredményeinek összehasonlításával tápanyaghiányos Jurkat sejtekben. Az eredmények a fluoreszcens intenzitás növekedését mutatták a tápanyaghiányos sejtekben, és a visszanyert Jurkat sejtek csökkenését. A képcitometria mért AAF-értékei azonban lényegesen magasabbak, mint az áramlási citometria, ami a műszerek és a módszerek közötti különbségeknek tudható be. A Cellometer Vision image citométer töltéshez kapcsolt eszközt használ a fluoreszcencia méréséhez, míg a FACS Calibur áramlási citométer fotoszorzócsövet (PMT) használ. Ezenkívül a fluoreszcens intenzitás elemzésének módszere is különbözött a két rendszer között. Az áramlási citométer az egyes sejtekből származó összes fluoreszcencia jelet méri, míg a képalapú rendszer képeket gyűjt és elemzi a sejteken belüli fluoreszcensen festett autofágoszómákat, ami pontosabb mérést biztosít az autofágia aktivitásáról. A Cellométer szoftver elemezheti a sejtek fluoreszcenciáját az egyes cellák összes fluoreszcens pixelének összegzésével, vagy csak az egyes cellákon belüli autofágoszómák magas fluoreszcens intenzitású pixeleinek mérésével. Egy másik különbséget az áramlási citometria nyírófeszültsége okozhat, amely befolyásolja a célsejtek életképességét (Robey et al., 2011).
az Autofágikus fluxus szintén fontos vizsgálat egy új detektálási módszer kifejlesztéséhez. A CQ-t az autofágoszómák lizoszomális lebomlásának gátlására alkalmazzák, ahol az autofágikus aktivitás a tápanyaghiányos Jurkat-sejtek esetében lenne a legmagasabb CQ jelenlétében a kezelések közötti szinergikus kölcsönhatás miatt. A következő legmagasabb lenne Jurkat sejtek éhezés nélkül CQ. A Jurkat sejtek csak enyhe növekedést mutatnak autofágikus aktivitás CQ-val csak a kontrollhoz képest, a bazális autofagolizoszómák felhalmozódása miatt. Mindkét műszer autofágikus fluxus eredményei hasonló tendenciákat mutattak, de a képcitometriában mért AAF értékek szignifikánsan magasabbak. Ezek az eredmények azt mutatták, hogy a kép citometriás detektálási módszer könnyen megvalósítható az autofágia aktivitásának vizsgálatára, annak ellenére, hogy az AAF értékek potenciálisan műszerspecifikus mennyiségi különbségei vannak.
annak bizonyítása érdekében, hogy a kép citometria potenciális gyógyszerfelfedezési szűrési technológia lehet, meg kell vizsgálni a minták többféle körülmények közötti elemzésének képességét. A kép citometriáját a rapamicinnel kezelt Jurkat sejtek autofág aktivitásának mérésére használják különböző koncentrációkban, annak bemutatására, hogy a kép citometria képes–e mérni a dózis-válasz hatásokat egy időfolyamos vizsgálat során. Ennek eredményeként a képalapú citometria képes kimutatni az autofágikus aktivitás különbségeit a különböző kísérleti körülmények között. Ábra. 8.6, az autofágikus aktivitás (AAF értékekkel mérve) a legmagasabb 18 óra inkubáció után. Az AAF értékek enyhe csökkenését mutatják az inkubáció 8-4 órája között, ami annak tudható be, hogy a sejtek nem tudnak teljesen felépülni a kezdeti gyógyszeres kezelés után. Ezenkívül a tapadó sejtek, például az emberi prosztatarák sejtvonala (PC-3) is mérhetők a kép citometriás módszerrel. A Cellométer látásának képalkotó felbontása elemezheti a fluoreszcensen jelölt autofágoszómákat (puncta), mind a fluoreszcens képeken, mind a fluoreszcencia intenzitású hisztogramokon megfigyelhető.
fontos bemutatni a különböző gyógyszervegyületek jellemzésének képességét azáltal, hogy összehasonlítjuk autofág dózis–válasz hatásukat a gyógyszerfelfedezési kampányokban. A tamoxifen és a rapamicin dózis–válasz hatásait közvetlenül hasonlítják össze image citometriával. A 18 órás inkubáció eredményei azt mutatták, hogy a rapamicin magasabb szintű autofágia aktivitást indukált, mint a tamoxifen. Fontos megjegyezni, hogy a tamoxifen 100 MHz-nél erősen citotoxikus, ami a Jurkat sejthalálhoz és a 18 órás inkubáció utáni széteséshez vezet. A nagy koncentrációjú tamoxifen citotoxicitási hatásának képalapú igazolása rendkívül hasznos lehet a bizonytalanságok kiküszöbölésében csak a szórásábra és a hisztogram eredményei alapján.
a Képcitometria összehasonlítható eredményeket mutatott a fluoreszcens sejtalapú elemzés standard áramlási citometriájával (Chan et al., 2011; Robey et al., 2011). A képalapú citometriás módszer számos előnyt kínálhat az áramlási citometriával szemben. Például az egyes mintákhoz szükséges sejtek száma (10-20 ~ l) lényegesen kisebb, mint egy hagyományos áramlási citométer (300-500 ~ l). Az áramlási citométer kezdeti beállítása megköveteli, hogy a célcellák egy részét a PMT feszültségek és a kompenzáció beállításához használják. Másrészt sok kép citométer pipettázza a sejteket egy számlálókamrába, amelyet többször át lehet szkennelni. Ezért a célsejtminták nem pazarolódnak el az expozíciós idő beállításának és a fókuszálásnak a kezdeti optimalizálása során. Ennél is fontosabb, hogy a BR és fluoreszkáló képek rögzítésének előnye lehetővé teszi a kutatók számára, hogy vizuálisan ellenőrizzék a megszerzett fluoreszcencia adatokat. Ez segíthet azonosítani a citotoxicitást, mint az autofágiát indukáló gyógyszeres kezelési vizsgálat komplikáló mellékhatását.
Autofluoreszcencia Cito-ID Zöld autofágia festékkel fordulhat elő a műanyag számlálókamra miatt, de a szoftver automatikusan eltávolíthatja a háttérjelet a tényleges cél fluoreszcencia elérése érdekében az AAF számítás megváltoztatása nélkül. Ezenkívül a fluoreszcens szondák fényfehérítése a sejtalapú vizsgálatokban minimálisra csökken, mivel a Cellométer látása alacsonyabb teljesítményű LED-eket használ, mint a más műszerekben használt nagy teljesítményű lézerek. A Cellométer kép citométerének jövőbeli fejlesztése egy nagyobb áteresztőképességű automatizált rendszer kifejlesztése lenne, amely több sejtet képes elemezni a jobb statisztikai elemzés érdekében, valamint több minta egyidejű elemzésének képessége, megkönnyítve az autofágia, apoptózis, nekrózis és más érdekes fiziológiai jelenségek inhibitorainak és aktivátorainak nagyobb áteresztőképességű sejtalapú gyógyszerszűrését.