4.3 BBB-keresztező bsAbs egydoménes antitestekkel tervezve
az sdab-k kicsi (15 kDa), az antitestek monomer antigénkötő fragmensei, amelyek különféle előnyöket nyújtanak más antitest fragmensekkel szemben, mint a bsab-k “építőelemei”. A természetben a tevefajok (VHH) és a porcos halak (vnar) nehéz láncú antitestjeinek antigénkötő részeként fordulnak elő, vagy hagyományos IgG-kből előállíthatók monomer, stabil VH vagy VL domének megszerzésével vagy tervezésével (Hamers-Casterman et al., 1993; Hussack et al., 2012; Kim et al., 2014; Nuttall, 2012; Ward, G Xhamssow, Griffiths, Jones, & tél, 1989). az sdab-k rendkívül stabilak és tömörek, és hozzáférhetnek a fehérjék süllyesztett epitópjaihoz, például a receptor üregekhez vagy az enzimek aktív helyeihez, amelyek gyakran “el vannak rejtve” a hagyományos IgG-ktől, és a hagyományos antitestekhez hasonló célkötési affinitást érhetnek el (Lauwereys et al., 1998; Staus et al., 2014). Ezek a monomer antigénkötő egységek nem párosulnak könnyű láncokkal, amelyek kiváló építőelemekké teszik őket a heterodimerizált bsab-k számára, mivel elkerülik a nem megfelelő fénylánc-párosítás nehézségeit (Hamers-Casterman et al., 1993; Saerens, Ghassabeh, & Muyldermans, 2008). A heterodimer bsab-k létrehozhatók úgy, hogy az egyik vagy mindkét “kar” sdAb, az utóbbi szerkezetében hasonló a teve nehézláncú antitestekhez (ábra. 3E). az sdab-k különféle mono -, bi-vagy tetravalens fúziókban is alkalmazhatók hagyományos terápiás antitestekkel vagy Fab-kkal (ábra. 3E), amelyek általában kisebb, kevésbé összetett molekulákat eredményeznek, összehasonlítva az scfv-kkel vagy Fab-kkal, mint építőelemekkel, amelyek általában biofizikailag jól viselkednek és könnyen előállíthatók (Holliger & Hudson, 2005). A vhhs humanizálása, valamint az sdab-k tervezése jól le van írva, lehetővé téve az emberi(ized) sdab-k optimális cél affinitással és kivételes biofizikai tulajdonságokkal történő előállítását (Vincke et al., 2009).
a camelid VHH FC5 BBB vivőanyagként való lehetséges alkalmazásának értékeléséhez a bispecifikus központi idegrendszeri célzott antitesteken belül az FC5 humán Fc – vel való monovalens és kétértékű fúzióit (N-és C-terminális) tervezték és értékelték in vitro és in vivo (Farrington et al., 2014). A kétértékű fc5fc fúzió látszólagos kötési affinitása (Kdapp) a patkány BEC-hez 75 nM volt, míg a monovalens FC5Fc kötés a mikromoláris tartományban volt. A látszólagos transzmigrációs arányok (Papp) elemzése in vitro BBB modellen, a szisztémásan beadott antitest konstrukciók szérum/CSF farmakokinetikájából származó látszólagos központi idegrendszeri expozíció, valamint a kémiailag konjugált BBB-át nem eresztő neuroaktív peptidek által kiváltott farmakológiai válaszok elemzése Hargreaves pain modellben, feltéve, hogy bizonyíték van ezeknek a nagy (75 kDa) antitestmolekuláknak az FC5 által közvetített fokozott BBB transzportjára: (1) az in vitro Papp értékek ~ 200 cm/perc voltak mind a mono -, mind a kétértékű N-terminális Fc fúziós molekulák (FC5Fc) esetében összehasonlítva 4-8 cm/perc kontroll VHH A20.1Fc vagy EG2Fc fúziók; (2) az FC5Fc fúzió látszólagos központi idegrendszeri expozíciója 30-szor magasabb volt a kontroll domén antitest–Fc fúziókhoz képest; (3) az fc5fc konjugátumok dalargin vagy galanin neuropeptidekkel történő szisztémás farmakológiai hatékonysága a Hargreaves gyulladásos fájdalommodellben akár 60-szor magasabb volt a monomer FC5–neuropeptid konjugátumokhoz képest. Ezt az eredményt az FC5Fc hosszú keringési felezési idejének (~ 96 óra) tulajdonították-összehasonlítva az FC5-neuropeptid konjugátumokkal; (4) a különféle kontroll VHH-Fc neuropeptid konjugátumok nem mutattak szisztémás hatékonyságot; (5) az FC5 fúziója az Fc C-végéhez gyengített BBB-keresztezési kapacitást eredményezett. A TFR-t célzó BBB-hordozó antitestekkel ellentétben mind a mono -, mind a bivalens fc5fc fúziós fehérjék hasonló transzcitózis arányt mutattak in vitro, hasonló plazma/CSF farmakokinetikai profilokat és hasonló szisztémás hatékonyságot mutattak a farmakodinamikai modellben in vivo, a látszólagos kötési affinitás és vegyérték különbségei ellenére (Farrington et al., 2014). Ezek a vizsgálatok kimutatták, hogy a BBB-keresztező egydoménes FC5 antitest platform BBB hordozóként használható mind a heterodimerizált “fél antitestekben”, mind pedig a hagyományos IgG-kkel való könnyebben skálázható bi-vagy tetravalens fúzióként (Farrington et al., 2014).
a VHH-k, mint BBB-hordozók másik lehetséges előnye a természetes ellenállás a szélsőséges biofizikai kihívásokkal szemben, mint például a hőmérséklet és a pH, valamint a proteáz lebomlása (Kim et al., 2014), gyakran találkoznak különböző endocitikus rekeszekben a transzcitózis során. Mind az FC5, mind az FC5Fc fúziók Bec-be internalizálódnak a clathrin-bevonatú vezikulákon keresztül, és korai endoszómákba rendeződnek. Érdekes módon az FC5-ről azt is megállapították, hogy stimulálja az extracelluláris mikrovezikulák (exoszómák) leadását a BEC-ből (Haqqani, Caram-Salas, et al., 2013; Haqqani, Delaney, et al., 2013), amelyben mind az FC5, mind a feltételezett Cdc50A receptor megnövekedett szintjét Western blot és célzott tömegspektrometria segítségével detektálták. Ez a tanulmány azt sugallta, hogy a shed exoszómák lehetnek az RMT út végső vezikuluma, amely a receptor-antitest komplexet hordozó abluminális felületről szabadul fel (vázlatosan az ábrán látható. 4). Az RMT útvonal és az exoszóma kialakulása néhány figyelemre méltó hasonlóságot mutat. Amint azt az exoszómák első felfedezésében vázoltuk, egy anti-TFR antitestet elektronmikroszkóppal követettünk nyomon retikulocitákban (TH!, 2011) a sejtek felszínéről, a klathrin bevonatú gödrökbe, a korai endoszómák belsejében, a multivesicularis endoszómák belső vezikulumainak felületén, végül a felszabadult exoszómákon, miután a multivesicularis endoszómák összeolvadtak a plazmamembránnal (ábra. 4). Úgy tűnik, hogy az RMT hasonló módon bontakozik ki, és kimutatták, hogy a BEC extracelluláris mikrovezikulák számos olyan receptort tartalmaznak, amelyekről ismert, hogy makromolekulákat hordoznak a BBB-n keresztül az RMT-n keresztül, beleértve a TfR-t, az LRPs-t, az LDLR-t és az IR-t (Haqqani, Delaney, et al., 2013).
a leírt vizsgálatokból nyilvánvaló, hogy a CNS-t célzó bsAb BBB hordozó karja gondos optimalizálást igényel minden RMT receptor esetében. A CNS-t célzó bsab-k tervezésének fontos szempontjait az alábbiakban tárgyaljuk, figyelembe véve a TfR-BACE1 bsAb fejlesztésének “tanulságait”, valamint az FC5-tel mint BBB-hordozó antitesttel végzett saját munkánkat.