9 a fehérjék szerepe a Spliceosomal katalitikus magban
az snrns-ek méretének összehasonlítása a sokkal nagyobb II.csoportú intronokkal felveti annak lehetőségét, hogy az evolúció során több II. csoport intron doménjét helyettesíthették fehérjék a spliceoszómákban, ami a modern ribonukleoprotein (RNP) eukarióta splicing gépeket eredményezte. Bár még nem létezik egy-egy levelezés, könnyen azonosítható olyan spliceosomális fehérjék, amelyek a II.csoportba tartozó intronok RNS-elemei által közvetített funkciót látnak el. Például számos U2-asszociált fehérje működik az U2 snrns–ág hely kölcsönhatásának elindításában és stabilizálásában (ábra. 6.3).5,85 a II. csoportba tartozó intronokban az U2 ekvivalens (a VI domén része) kovalensen kapcsolódik az elágazási helyhez egy hiperstabil hajtűhurokon keresztül, olyan elrendezésben, amely biztosítja kölcsönhatásuk kialakulását és stabilitását (ábra. 6.2). Ebből az evolúciós szempontból nem meglepő, hogy a spliceosomális fehérjék nagy része közvetlenül kapcsolódik az snrns-hez, gyakran segítve annak működését.5,85 azonban számos spliceosomal protein szerepet játszik az önhasító intron esetében nem szükséges szabályozó funkciók ellátásában, és valószínűleg a spliceosomal protein KOMPLEMENT újabb kiegészítései.
mint fentebb említettük, úgy gondolják, hogy az eukarióták utolsó közös ősének magasan fejlett, teljesen működőképes spliceosoma volt, amely hasonlított a modern eukariótákban találhatókhoz.1,2 bár ez a spliceosome valószínűleg lényegesen kevesebb komponenst tartalmazott, mint a legkisebb modern spliceosomák, az adatok azt mutatják, hogy a kulcskomponensek többsége a spliceosomák legkorábbi verzióiban volt jelen.1-4 valójában a spliceosomal proteom egy részhalmaza, amely magában foglalja a katalitikus maghoz kapcsolódó fehérjéket, jelentős mértékű megőrzést mutat a különböző eukarióta Fajok között, számos spliceosomal fehérje a leginkább konzervált sejtfehérjék közé tartozik.85,86
mint fentebb említettük, számos jól jellemzett ribozim in vivo olyan fehérjékhez kapcsolódik, amelyek számos ismert mechanizmus révén javítják katalitikus aktivitásukat.83 ezek közé tartozik az RNS-ek funkcionális szerkezetének stabilizálása, a szubsztrátok kötésének és pozicionálásának segítése, valamint a funkcionálisan fontos fémionok kötődésének segítése. A katalízisben való közvetlen részvételt azonban eddig nem figyelték meg a vizsgált ribozim-asszociált fehérjék egyikében sem.83,87 ha feltételezzük, hogy a spliceosoma egy RNS enzim, akkor a spliceosomal snrns-ek sok szempontból szokatlan ribozimok. Talán a legfontosabb, hogy szokatlanul kicsiek egy ribozim számára, amely katalizálja a foszfodiészter kötés hasítását egy nem szomszédos nukleofil aktiválásával. Az ilyen reakciókat katalizáló egyéb természetes ribozimok, nevezetesen az I. és II. csoportba tartozó intronok és az RNáz P, legalább kétszer hosszabbak, mint az emberi U6 és U2 snrns-ek együttes hossza. Ezek a ribozimok szintén sokkal nagyobbak, mint azok a nukleolitikus ribozimok, amelyek a szomszédos 2′-hidroxil nukleofilt aktiválják a foszfodiészter kötés hasításához.24,88,89 úgy gondolják, hogy a nagyobb méret lehetővé teszi, hogy ezek a ribozimok összetett struktúrákba hajtódjanak, amelyeket több tercier kölcsönhatás stabilizál, ami viszont lehetővé teszi számukra, hogy kifinomult aktív helyeket hozzanak létre, amelyek képesek pontosan elhelyezni a hasítási helyet, az aktív hely fémionjait és a távoli nukleofilt az in-line nukleofil támadáshoz. Elképzelhető, hogy az U6 és U2 snrns-ek rövid hosszúságuk miatt legjobb esetben is nem hatékony splicing ribozimot képeznek, amely más spliceosomális faktorokat igényel az aktív helyelemek és a reagáló csoportok stabil pozicionálásához.
Prp8, amely a leginkább konzervált spliceosomal fehérje, úgy gondolják, hogy ilyen szerepet játszik a spliceosomal aktív helyén. A prp8 vitathatatlanul a legérdekesebb a spliceosomal fehérjék közül, mivel szokatlanul konzervált az élesztő és az ember közötti 61% – os azonossággal.86 a ~ 2300 aminosav hosszában azonban kevés jól megkülönböztethető funkcionális motívuma van, és az eddig észlelt funkcionális domének degeneráltak, és valószínűleg olyan funkciókat látnak el, amelyek nem kapcsolódnak az eredeti alapító motívum sejtes szerepéhez.86 másrészt a Prp8 egyértelműen nagyon kritikus szerepet játszik a spliceosomalis aktív helyen. Az U5 és U6 snrns-ek mellett térhálósították az 5′ és 3′ splice helyekkel és a premessenger RNS-ek elágazási helyével, ami azt jelzi, hogy jelen van a spliceosomalis katalitikus magban, és közvetlenül érintkezik a splicing reakció kritikus szereplőivel.86,90 továbbá kimutatták, hogy a Prp8 kölcsönhatásba lép számos kulcsfontosságú spliceosomalis fehérjével, beleértve az Snu114-et és a Brr2-t (lásd alább).86,91,92
a Prp8 mutációi a spliceosomalis defektusok széles spektrumával társulnak, beleértve a spliceosomák azon képességének megváltozását, hogy elutasítsák a szuboptimális splice helyeket, valamint az egyéb spliceosomalis faktorok, például a Prp28, Brr2, U4 és U6 snrns mutációi által okozott defektusok elnyomását.86,93,94 a Prp8 mutánsok egy részhalmaza szelektíven modulálja a splicing első vagy második lépésének hatékonyságát, különösen a szuboptimális szubsztrátokban.58,86,95-97 ezeket a megfigyeléseket legjobban egy hipotézis magyarázza, amely szerint a Prp8 részt vesz az alternatív, egymást kizáró aktív helykonformációk stabilizálásában, amelyek vagy készen állnak a splicing első vagy második lépésének katalízisére, és hogy bizonyos Prp8 mutánsok ezen állapotok egyikének szelektív hiperstabilizációjához vezethetnek.58,96,98 míg jelentős bizonyítékok arra utalnak, hogy a Prp8 valószínűleg részt vesz a szubsztrátok pozicionálásában és az aktív hely stabilizálásában, jelenleg nincs olyan közvetlen bizonyíték, amely a fémionok koordinációjában való további részvételét vagy a spliceosomalis katalízisben való közvetlen részvételét sugallná vagy cáfolná.
Ez a bizonytalanság abból a tényből fakad, hogy nagyon keveset tudunk arról, hogy a Prp8 hogyan látja el funkcióját. Egy innovatív transzpozon által közvetített szűrővizsgálat azt mutatta, hogy a Prp8 nagy régiói nagyon érzékenyek a transzpozonok beillesztésére, és valószínűleg egyetlen szerkezeti egységként működnek, bár lehetséges volt transzpozonok beillesztése vagy akár a Prp8 két részre osztása számos más helyzetben az életképesség elvesztése nélkül.90,92 eltekintve egy degenerált nukleáris lokalizációs szignáltól közel az N terminálisához és egy degenerált RRM (RNS felismerési motívum) motívumtól a fehérje közepén, csak két másik funkcionális domént azonosítottak ebben a ~ 2300 aminosav hosszú fehérjében.86
az MPN/Jab1 domén degenerált változata, amely deubiquitináló enzimekkel társul, a Prp8 C terminálisának közelében található.86 az ezt a domént tartalmazó Prp8 fragmentum nagy felbontású szerkezetének elemzése kimutatta, hogy az izopeptidáz központ fémionkötő helye károsodott, ezért valószínűleg nem működik deubiquitináló enzimként.99 100 In vitro a prp8 ezt a domént tartalmazó fragmentuma közvetlenül kötődhet az ubiquitinhez olyan affinitással, amely hasonló volt más ismert ubiquitin-kötő fehérjékhez.101 számos ismert prp8 mutáció, amely megzavarta a splicinget, szintén megzavarta az in vitro ubiquitin kötődést, ezáltal felvetve az ubiquitináció funkcionális szerepének lehetőségét a splicing szabályozásában. Fontos, hogy a proteomikus elemzések azt mutatták, hogy számos spliceosomal faktor, köztük az Sad1, Snu114, Rse1 és maga a Prp8 in vivo ubiquitinált, továbbá a spliceosomal magfehérje Prp19 in vitro E3 ubiquitin ligáz aktivitást mutat.101-105 továbbá az ubiquitin szerepet játszik a tri-snRNP kialakulásában és fenntartásában, esetleg a Brr2.102 funkciójának prp8 által közvetített szabályozásának modulálásával.Alternatív megoldásként az is lehetséges, hogy az MPN/Jab1 domén fehérje-fehérje interakciós platformként működik. A Prp8 számos,ebbe a tartományba eső mutációja örökletes vakságot eredményez retinitis pigmentosa, 86 és ezek a mutációk gyengítették a Prp8 és a Brr2 és Snu114 kölcsönhatását.99
meghatározták a Prp8 egy másik fragmensének nagy felbontású szerkezetét, amely egy erősen konzervált régiót foglal magában (69% aminosav azonosság az élesztő és az ember között), amely a C-terminális domén közelében helyezkedik el. A szerkezet elemzése során kiderült, hogy a riboszomális fehérjékben találhatókhoz hasonló, 6-os számú hajtűujj és egy degenerált RNáz-H-szerű domén is jelen van.106-108 míg az RNáz H-szerű motívum általános geometriája a szekunder és tercier szerkezet szintjén jól konzervált volt, az elsődleges szekvencia sokkal alacsonyabb szintű megőrzést mutatott, és a három katalitikus maradék közül csak az egyik van jelen az aktív helyen. A konzervált maradék, egy aszpartát, részt vesz két katalitikus fémion koordinálásában a kanonikus RNáz h domének aktív helyén. Egy vizsgálatban ennek a maradéknak a mutációja a prp8-ban élesztőben nem eredményezett kimutatható növekedési hibát, ami redundanciára vagy kritikus funkció hiányára utalhat.108 egy másik vizsgálatban a hatását nem lehetett megvizsgálni, mivel a mutáció a fehérje fragmentum hibás összehajtását okozta.107 az RNáz H domén aktív helyének megfelelő régióban nem figyeltek meg fémionkötést, amikor a kristályokat akár 200 mM MgCl2-ben termesztettük, ami azt jelzi, hogy a degenerált aktív hely nem rendelkezik fémionkötő képességgel. Továbbá az ezt a domént tartalmazó Prp8 fragmens nagyon gyenge RNS-kötő képességet mutatott, a vizsgált RNS-fajoktól függően a Kd 20-200 fő között volt.106-108 bár a fragmens nagyon alacsony affinitást mutatott az RNS-ek kötéséhez, előnyben részesítette a négyirányú csomópontokat tartalmazó duplex RNS-ek kötését.108 az aktivált humán spliceoszómákban az U2 és U6 snrns-ek várhatóan ilyen struktúrát alkotnak.53,69 ami különösen érdekessé tette ezt az RNáz H-szerű domént, az az volt, hogy az aktív helyének megfelelő aminosavak a prp8-ban lévő olyan maradékokkal szomszédos helyen helyezkednek el, amelyekről korábban kimutatták, hogy térhálósodnak az 5′ – splice helyre a prekatalitikus spliceoszómákban.109 ennek a térhálósodásnak a kialakulásának hatékonysága azonban csökkent, mivel a prekatalitikus spliceosomák katalitikusan aktív spliceosomalis komplexekké váltak.109 a térhálósítás hatékonyságának megfigyelt csökkenése úgy értelmezhető, hogy ez a kölcsönhatás megszakadt az aktivált spliceoszómákban. Alternatív megoldásként az interakció fennmaradhat, de maga a térhálósítás kialakulása megszűnik a térhálósított maradékok környezetének kisebb változása miatt. Ha ez a degenerált RNáz H-szerű domén valóban az 5′ splice hely közelében helyezkedik el a katalitikusan aktív spliceoszómákban, lehetséges, hogy részt vehet az snrns-ek aktív konformációjának stabilizálásában, a szubsztrátok elhelyezésében az aktív helyen és/vagy a katalitikus fémionok koordinálásában. Míg a domén önmagában nem képes megkötni az RNS – t vagy a fémionokat, lehetséges, hogy más aktív helyelemek jelenlétében a szubsztrát vagy a fémionkötő zsebek részét képezheti. Ezen érdekes lehetőségek ellenére a Prp8 szerepe a spliceosomalis katalízisben továbbra is bizonytalan.