a biotint és kötő partnerét, az avidint ma a molekuláris biológiában széles körben használják különböző technikák és protokollok számára. Ebben a bejegyzésben megvitatjuk a biotin természetes szerepét, a biotinilezést, a biotin-avidin kölcsönhatás felfedezését és a biotinilezés felhasználását a molekuláris biológiában!
Ismerje meg a bakteriális fúziós fehérjék in vivo biotinilezését
A Biotin az élet nélkülözhetetlen vitaminja
bár a biotin leggyakrabban a molekuláris biológiában betöltött szerepéről ismert, a biotin (H-Vitamin vagy B7-Vitamin) először egy esszenciális koenzim, amelyre minden szervezetnek szüksége van az élethez. A biotint csak a növények, a legtöbb baktérium és néhány gomba szintetizálja, így az emlősöknek külső forrásokból kell beszerezniük a vitamint. Az emberek felszívják a vékonybélben szükséges biotin nagy részét az ott lakó mikroflórából.
A Biotin egy kofaktor, amely aktív formájában kovalensen kapcsolódik a kulcsfontosságú metabolikus enzimek aktív helyéhez, beleértve a biotin-karboxilázt és a dekarboxilázokat. Ezek az enzimek katalizálják a karboxilcsoportok szerves savakká történő átvitelét fontos celluláris metabolitok előállításához. A Biotin karboxil hordozóként működik egyik vegyületről a másikra. Ezek a biotin-függő enzimek nélkülözhetetlenek az olyan folyamatokhoz, mint a glükoneogenezis, a lipogenezis, az aminosav-anyagcsere és az energiaátvitel.
a Biotinilezés az az általános folyamat, amelynek során biotint adnak egy fehérjéhez vagy makromolekulához. A biotint enzimatikusan vagy kémiailag adhatjuk hozzá. Az enzimatikus biotinilezés természetes módon történik a sejtekben, és ez az a folyamat, amelynek során a biotin kovalensen kötődik egy specifikus lizinhez az újonnan szintetizált enzim aktív helyén. A Biotin fehérje ligáz (BPL) felelős ezért a nagyon specifikus poszttranszlációs fehérje módosításért. A legtöbb organizmusnak kevesebb, mint öt enzimje van a teljes proteomban, amelyek biotinilezettek. Ban ben E. coli például a BPL, a BirA felelős azért, hogy az egész szervezetben csak egy lizint biotinilezzen a biotin-karboxil-hordozó fehérjén (BCCP).
A biotin-avidin kölcsönhatás felfedezése
az 1930-as évek végén megfigyelték, hogy az elsősorban tojásfehérjével táplált állatoknál bőrelváltozások és más szörnyű egészségügyi problémák alakulnak ki. Ezt a betegséget “tojásfehérje sérülésnek” nevezték, és megállapították, hogy a H-Vitamin hiányának köszönhető, amelyet később B7-Vitamin/biotinnak neveztek el. A tojásfehérje sérülése akkor is sújtja ezeket az állatokat, ha étrendjüket biotinnal egészítik ki. Így valami a tojásfehérjében elválasztotta a biotint a felszívódástól. 1940-ben Esmond E. Snell képes volt megtisztítani a biotin kötődéséért felelős fehérjét, az avidint. Az avidint találóan nevezték el a csirkéről, “madár”, tojás, amelyből megtisztították. Snell később megerősítette, hogy avidin valóban a tettes tojásfehérje sérülés etetésével patkányok tisztított avidin (Kresege et al., 2004). Az Avidin egy glikoprotein, amely négy azonos alegységből áll, amelyek mindegyike képes megkötni egy biotin molekulát.
A Biotin és az avidin rendkívül erős affinitással rendelkeznek egymás iránt. Valójában a köztük lévő kötés az egyik legerősebb nem kovalens fehérje-ligandum kölcsönhatás a természetben. A kötés kialakulása után a pH, a hőmérséklet vagy a szerves oldószerek változása nem befolyásolja.
A biotin felhasználása a molekuláris biológiában
A Biotin egy viszonylag kicsi, vízben oldódó molekula, amely nem zavarja a hozzáadott makromolekulákat. A biotinnak van egy kitett oldallánca is, amely könnyen manipulálható reaktív Fajok előállítására anélkül, hogy befolyásolná az avidin kötőhelyét. Mindezekkel a tulajdonságokkal nem meglepő, hogy a tudósok elkezdték kihasználni a biotint és az avidinnel való erős kölcsönhatását molekuláris biológiai és biotechnológiai célokra.
miután egy polipeptid biotinilezett (erről bővebben alább), inkubálható vagy együtt expresszálható avidinnel vagy egy szerkezetileg hasonló fehérjével, amelyet az 1960-as években fedeztek fel, strepavidin. A Biotin-avidin komplex ezután felhasználható és / vagy manipulálható a tudós rendeltetése szerint. A biotinilezés két leggyakoribb felhasználási területe a fehérjetisztítás és az immunprecipitációs kísérletek. A biotinilezett fehérjék vagy komplexek könnyen tisztíthatók avidinnel bevont oszlopok vagy gyöngyök segítségével.
a biotin-avidin kölcsönhatást az immunhisztokémia és az ellenanyagok címkézésére is adaptálták. Ezekben a kísérletekben biotint adnak egy elsődleges vagy másodlagos antitesthez,amely megcélozza az érdeklődésre számot tartó fehérjét vagy az elsődleges antitestet. Ezután a riporterhez kötött avidint hozzáadjuk a reakcióhoz a könnyű észlelés érdekében. Az avidinen található több biotinkötő hely is ideális a jel erősítésére ezen kísérletek során. A kimutatás során egy biotinilezett riporter enzimet adhatunk a mintához, amelyet szabad avidinnel előre inkubáltunk. Bármely szabad biotinkötő hely ezen a komplexen kötődhet a biotinilezett antitesthez. Ez létrehoz egy nagy háló biotin-avidin komplexek kötődik a fehérje érdekes, ami amplifikációja a riporter jel és könnyebb észlelése. Ezt a stratégiát Avidin-Biotin komplexnek (ABC) nevezik immunhisztokémia (IHC). Az ABC-vel és az IHC-vel kapcsolatos további információkért olvassa el a Thermo Fisher Scientific útmutatóját.
számos más molekuláris biológiai alkalmazás létezik a biotin és az avidin számára. Az alábbiakban felsorolunk néhány más gyakori alkalmazást, valamint a vonatkozó dokumentumokra és weboldalakra mutató linkeket.
- EMSA (Electrophoretic Mobility Shift Assays)
- ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay)
- Southern/Northern Blotting
- Cell surface labelling
- Attaching polypeptides to a substrate
- Flow cytometry/fluorescence-activated cell sorting (FACS)
- In situ hybridization
Methods for biotinylating your macromolecule of interest
To utilize the natural binding of biotin és avidin, makromolekulák érdekes először biotinilezni kell. A tudósok számos módszert fejlesztettek ki az érdekes makromolekulák kémiai biotinilezésére mind in vitro, mind in vivo.
Biotinilációs reagensek:
A Biotin kitett oldallánca speciális vegyi anyagok (biotinilező reagensek) segítségével in vivo térhálósítható az aminosav funkciós csoportokkal. Különféle biotinilező reagensek állnak rendelkezésre, amelyek különböznek a megcélzott funkcionális csoportokban vagy maradékokban, valamint oldhatóságukban, ezért a különböző reagensek hasznosak a biotinilezéshez különböző mikrokörnyezetekben. Vannak reverzibilis és hasítható biotinilező reagensek is, amelyek segítenek a biotinilezett fehérjék specifikus elúciójában. Ha segítségre van szüksége annak meghatározásához, hogy melyik biotinilező reagenst használja, nézze meg a Thermo Fisher Scientific Biotinilező reagens kiválasztó eszközét.
AviTag és BirA:
a fehérjék biotinilezhetők az e specificitásának kihasználásával.coli BPL, BirA. Ha emlékszel, a BirA csak egy lizint biotinilál az egész E. coli proteomban. Ezen ismeretek felhasználásával a tudósok azonosították a BirA felismeréshez és a biotinilezéshez szükséges 13 aminosav-szekvenciát. Ezt a 13 aminosav-szekvenciát AviTag-nak nevezik. Az AviTag használatával meg lehet jelölni egy érdekes fehérjét biotinnal, egyszerűen létrehozva egy fúziót, amelyben az AviTag hozzáadódik a fehérje N vagy C végéhez. A BirA-ról kimutatták, hogy hatékonyan biotinilálja az AviTag expresszáló fehérjéket baktériumokban, élesztőben, rovarokban és emlős sejtekben. Nézze meg Kay et al., 2009 a biotinilező fehérjék BirA-val történő módszereiről.
olyan plazmidokat találhat, amelyek mind AviTag-ot, mind BirA-t tartalmaznak az Addgene-nél!
oligonukleotid címkézés:
biotint adhatunk a DNS-szekvencia bármelyik végéhez egy polimeráz láncreakció (PCR) során biotinilezett primer alkalmazásával. A Biotin enzimatikusan is beépíthető a PCR során egy biotinnal jelölt dUTP alkalmazásával. Többféle biotin címke létezik, amelyek hozzáadhatók egy oligonukleotidhoz az Ön későbbi alkalmazásától függően. A biotinnal jelölt oligonukleotidok számos alkalmazásban alkalmazhatók, beleértve, de nem kizárólagosan az in situ hibridizációt, a blotolást (északi és Déli) és az affinitáskötést.
Fotobiotinilezés:
a Fotobiotin felhasználható a DNS és az RNS nem szelektív jelölésére. A fotobiotin-acetát egy biotin molekulából áll, amely egy fotoreaktív arilazid csoporthoz kapcsolódik. Erős látható fény alatt az arilazidcsoport reaktív lesz, és kapcsolatot képez a közeli nukleinsavakkal (McInnes et al., 1990). A fotobiotinilezés néha könnyebb és olcsóbb, mint más enzimatikus módszerek. A tudósok gyakran használják ezt a módszert fehérjék vagy polipeptidek szilárd szubsztrátumhoz történő kötésére (Holden and Cremer, 2003).
1. Chapman-Smith, A., & Cronan, je” a biotin fehérjékhez való kötődésének molekuláris biológiája; szimpózium: a Biotin táplálkozása, biokémiája és molekuláris biológiája ” J. Nutr, 129 (2009a): 477-484. PubMed PMID: 10064313.
2. Chapman-Smith, A., & Cronan, je ” a fehérjék enzimatikus biotinilezése: kivételes specificitás poszttranszlációs módosítása.”A biokémiai tudományok trendjei, 24.9 (1999b): 359–363. PubMed PMID: 10470036.
3. Mondta, H. M. ” Biotin: az elfelejtett vitamin.”American Journal of Clinical Nutrition 75.2 (2002): 179-180. PubMed PMID: 11815306.
4. Nicole Kresge, R. D. S. és R. L. H. ” az Avidin felfedezése Esmond E. Snell által.”J Biol Chem 279.e5 (2004). PubMed PMID: 20353954.
5. Kay, B., Thai, S., & Volgina, V. ” A fehérjék nagy áteresztőképességű Biotinilezése.”Módszerek Mol Biol, 498 (2009): 185-196. PubMed PMID: 18988027. PubMed központi PMCID: PMC3223083.
6. McInnes, J. L., Forster, A. C., Skingle, D. C., & Symons, R. H. ” a fotobiotin előkészítése és felhasználása.”Módszerek az Enzimológiában 184 (1990): 588-600. PubMed PMID: 2388593
7. Holden, M. A., & Cremer, P. S. ” festékkel jelölt molekulák fény által aktivált mintázata a felületeken.”Az Amerikai Kémiai Társaság folyóirata 125.27 (2003): 8074-8075. PubMed PMID: 12837056.
8. Pan, J. feng, Liu, N. hua, Shu, L. yuan, & Sun, H. “az avidin-biotin technológia alkalmazása a sejtek tapadásának javítására nanoszálas mátrixokon.”Nanobiotechnológiai folyóirat 13.1 (2015): 1–14. PubMed PMID: 25980573. PubMed központi PMCID: PMC4461904.
9. Huang, Q., Mao, Z., Li, S., Hu, J., & Zhu, Y. “nem radioaktív módszer kis RNS kimutatására északi blottolással.”Rizs 7.1 (2014): 1-7. PubMed PMID: 26224555. PubMed központi PMCID: PMC4884002.
10. Boer, E. de, Rodriguez, P., Bonte, E., Krijgsveld, J., Katsantoni, E., Heck, A., … Strouboulis, J. “a címkézett transzkripciós faktorok hatékony biotinilezése és egylépéses tisztítása emlős sejtekben és transzgenikus egerekben.”PNAS 100.13 (2003): 7480-5. PubMed PMID:12802011. PubMed központi PMCID: PMC164612.
11. Liou, Y.-R., Wang, Y.-H., Lee, C.-Y., & Li, P.-C. “felhajtóerő-aktivált Sejtválogatás célzott Biotinilezett Albumin mikrobuborékok felhasználásával.”PLoS ONE 10.5 (2015). PubMed PMID: 25993512. PubMed központi PMCID: PMC4439073.
12. Ludwig, L. B., Hughes, B. J., & Schwartz, S. A. ” Biotinilezett próbák az elektroforetikus mobilitási eltolódási vizsgálatban specifikus dsDNS, ssdns vagy RNS–fehérje kölcsönhatások vizsgálatára.”Nukleinsavak Kutatása, 23.18 (1995): 3792-3793. PubMed PMID: 7479014. PubMed központi PMCID: PMC307283.
13. Howarth, M., & Ting, A. Y. ” élő emlős sejtekben biotin ligázzal és monovalens sztreptavidinnel végzett képalkotó fehérjék.”Természetprotokollok 3.3 (2008): 534-545. PubMed PMID: 18323822. PubMed központi PMCID: PMC2671200.
14. Bloch, B. ” Biotinilezett próbák in situ hibridizációs hisztokémiához: felhasználás mRNS kimutatására.”The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: a hisztokémiai Társaság hivatalos lapja, 41.12 (1993): 1751-1754.PubMed PMID: 8245422.
további források az Addgene blogon
- bakteriális fúziós fehérjék In vivo biotinilezése
- Ismerje meg, hogyan használják a biotint a Split-Bioidban: Továbbfejlesztett módszer a fehérje-fehérje kölcsönhatások tanulmányozására
- Ismerje meg, hogyan használható a biotin a CRISPR – rel