szulfát-redukáló baktériumok az emberi székletben és ezek kapcsolata gyulladásos bélbetegségekkel

absztrakt

szulfát-redukáló baktériumokat kerestünk 41 egészséges egyén és 110 beteg székletében egy Hepato-Gastro-Enterológiai egységből egy speciális folyékony közeg felhasználásával (Test-kit Lab). A 110 beteget 22 gyulladásos bélbetegségben szenvedő beteg és 88, Egyéb alsó (n=30) vagy felső (n=58) emésztőrendszeri betegség miatt kórházba került beteg választotta el egymástól. A szulfát-redukáló baktériumokat 10 egészséges egyénből (24%), 15 gyulladásos bélbetegségben szenvedő betegből (68%) és 33, egyéb tünetekkel rendelkező betegből (37%) izolálták. Multiplex PCR-t dolgoztak ki a Desulfovibrio piger (korábban Desulfomonas pigra), a Desulfovibrio fairfieldensis és a Desulfovibrio desulfuricans azonosítására, és a fenti izolátumokra alkalmazták. A szulfát-redukáló baktériumok törzsei a D. piger (39 izolátum), a D. fairfieldensis (19 izolátum) és a D. desulfuricans (egy izolátum) voltak. A D. piger prevalenciája szignifikánsan magasabb volt gyulladásos bélbetegségben szenvedő betegeknél (55%), mint egészséges egyéneknél (12%) vagy más tünetekkel rendelkező betegeknél (25%) (P<0, 05).

1 Bevezetés

a Crohn-betegség (CD) és a colitis ulcerosa (UC) ismeretlen etiológiájú krónikus gyulladásos bélbetegségek (IBD), de valószínűleg környezeti, genetikai és immunfaktorokra támaszkodnak . Fertőző eredetet javasoltak, és számos mikroorganizmus érintett meggyőző érvek hiányában. Mindkét szindrómában azonban a bélgyulladás reagál az antibiotikumokra. A krónikus vastagbélgyulladás állatmodelljeiben a luminalis flóra nélkülözhetetlen kofaktor a betegség kialakulásához . Ez megmagyarázhatja a bélflóra szerepe iránti megújult érdeklődést e rendellenességek okaként .

a szulfát-redukáló baktériumok (SRB) anaerob mikroorganizmusok, amelyek eltérő szulfát-redukciót végeznek az energia megszerzése érdekében, ami nagy mennyiségű szulfid felszabadulását eredményezi. Gyakran izolálják a környezeti forrásokból, de jelen vannak az állatok és az emberek emésztőrendszerében is. Mivel a Desulfomonas pigra átsorolásra került Desulfovibrio piger comb. November. , az SRB emberi izolátumai szinte kizárólag Desulfovibrio fajokból állnak . A legújabb eredmények arra utalnak, hogy az SRB szerepet játszhat az emberi betegségekben. Összefüggésbe hozták a humán parodontitis klinikai súlyosságával, és mély tályogokból (hasi vagy agyi), vérből vagy vizeletből izolálták őket . Ezekben a beállításokban a legtöbb törzset Desulfovibrio fairfieldensis néven azonosították, egy nemrégiben javasolt új faj, 16S riboszomális RNS gén (16S rDNS) szekvenálással. A Desulfovibrio desulfuricans, a Desulfovibrio nemzetség típusfajait szintén izolálták az emberi példányokból . Az SRB IBD-re gyakorolt hatását javasolták, mivel metabolikus végtermékük, a hidrogén-szulfid citotoxikus vegyület . Ez a vegyület a butirát oxidáció gátlásán keresztül hathat, amely a kolonociták fő energiaforrása. A bélhám funkcióinak károsodása sejthalálhoz és krónikus gyulladáshoz vezetne. Az IBD-hez kapcsolódó SRB fajokat azonban még nem azonosították. Azonosításuk lehetővé tenné a virulencia tényezők, valamint az antimikrobiális szerekre való hajlamuk keresését.

az orvosi laboratóriumokban az SRB-t ritkán izolálják az emberi mintákból a lassú növekedés miatt. A kolóniák több mint 3 napos inkubáció után jelennek meg, és nem veszik észre őket, a kísérő flóra benőtt, kivéve, ha ezek a domináns vagy egyedüli Fajok. Így a székletben való keresés nehéz, hacsak nem használnak speciális táptalajt. Az ilyen közegek általában tartalmaznak egy szerves vegyületet (elektrondonor és szénforrás), szulfátot (elektron akceptor), vasat és redukálószert. Az SRB növekedése specifikus táptalajokban könnyen kimutatható a közeg megfeketedésével a hidrogén-szulfid (H2S) termelés következtében, ami vas-szulfid csapadék képződését eredményezi. Miután elkülönítették a klinikai mintákból, a fajok szintjén történő azonosítás nehéz lehet. Például nem lehet megkülönböztetni a D. fairfieldensist és a D. desulfuricans-t fenotípusos tesztekkel. Így a gén amplifikáció értékes eszköz az ilyen azonosítás eléréséhez.

a vizsgálat fő célja annak meghatározása volt, hogy a Desulfovibrio mely fajai társulhatnak az IBD-vel, ha vannak ilyenek. Erre a célra egy speciális folyékony táptalajt (Test-kit Lab (Test-kit Lab)) használtunk (Compagnie Fran (Compagnie Fran)) az SRB egészséges egyének és a Centre Hospitalier et Universitaire de Nancy (Franciaország) Hepato-Gastro-Enterológiai osztályán kórházba került betegek ürülékéből történő növekedéséhez. Az izolátumok fajszintű azonosítására multiplex PCR-t dolgoztak ki.

2 Anyagok és módszerek

2.1 betegek

széklet 41 egészséges egyének (17 férfi és 24 nő; átlagéletkor 38 év, tartomány 1-101 év) és 110 beteget (67 férfi és 43 nő; átlagéletkor 57 év, tartomány 14-100 év) gyűjtöttek össze a Centre Hospitalier et Universitaire de Nancy (Franciaország) Hepato-Gastro-Enterology egységéből. Egészséges egyének konzultáltak egymás után a szűrés. A székletben nem találtak patogén mikroorganizmust. Egészséges egyének és betegek nem kaptak antibiotikumot a minta kinyerése előtti hónapban. A betegeket három csoportra osztották: az IBD (n=22) 17 CD-t és öt; Egyéb alsó bélbetegségek (n=30) 23 olyan beteget vontak be, akiknél enyhe vagy közepesen súlyos tünetek jelentkeztek, mint például hasi fájdalom, béltranzit-problémák és rectorrhagia, valamint hét vastagbélrákos beteg; a felső emésztőrendszeri betegségek (n=58) közé tartoztak az epekövek, a cirrhosis, a máj-sejtes karcinóma, a gyomor-és hasnyálmirigy-daganatok. Az IBD-t klinikai, endoszkópos és szövettani leletek alapján diagnosztizálták. Az IBD-ben szenvedő betegek többsége aktív betegségben szenvedett (1.táblázat).

2.2 SRB kimutatás és felsorolás

egy gramm székletet 4 ml foszfátpufferelt sóoldattal kevertünk és centrifugáltunk (3000 fordulat / perc, 5 perc). Egy milliliter felülúszót volt az oltást azonnal folyékony közegben (Teszt-készlet Labège®, a Compagnie Française de Géothermie, Orleans, Franciaország) szerint a gyártó utasításait. Röviden, A tesztkészletek laborja a (Z) 6ge a (Z) 9 ml specifikus táptalajt (szerves vegyületek: laktát és acetát, redukálószer: titán-citrát) tartalmazó injekciós üvegekből állnak, amelyek anaerob módon kondicionáltak az SRB kimutatására. A fecskendőt egy gumi kupakon keresztül oltják be. Ezt a lágy és színtelen közeget eredetileg az SRB környezeti mintákból történő kimutatására fejlesztették ki. Összehasonlították az általánosan használt Postgate szilárd táptalajával (szerves vegyület: Laktát , redukálószerek: aszkorbinsav és tioglikolsav), párhuzamosan anaerob atmoszférában oltva. Az SRB-t az utóbbi táptalajjal töltött hosszú és keskeny csövek segítségével számoltuk fel, és a széklet decimális hígításával oltottuk be. Az összes beoltott táptalajt inkubáltuk 37 Kb 2 hónapig. Az SRB jelenlétét folyékony közegben fekete csapadék (vas-szulfid) képződésével, szilárd közegben fekete kolóniák megjelenésével állapítottuk meg.

2.3 PCR primerek tervezése

a Genbank adatbázisban elérhető Desulfomonas és Desulfovibrio törzsek 16S rDNS szekvenciáit összehasonlítottuk a Sequence Navigator szoftver 1.0.1-es verziójával (Applied Biosystems Inc., Foster City, Kalifornia, USA). Lehetővé tette hat alapozó megtervezését az emberekből korábban izolált SRB PCR-rel történő azonosítására, kapcsolatban áll a D-vel. piger (korábban Desulfomonas pigra) ATCC 29098T, D. desulfuricans Essex 6 ATCC 29577t, D. desulfuricans MB ATCC 27774 és D. fairfieldensis ATCC 700045. A D. desulfuricans Essex 6 és a D. desulfuricans MB differenciálódott, mivel ezeknek a törzseknek a 16S rDNS szekvenciái 3% – os különbséget mutatnak. A primerek a következők voltak: 27K-F (5′-CTG CCT TTG ATA CTG CTT AG-3′), 27K-R (5′-GGG CAC CCT CTC GTT TCG GAG a-3′), Essex-F (5′-CTA CGT TGT GCT AAT CAG CAG CGT AC-3′), Fair-F (5′-TGA ATG AAC TTT TAG GGG AAA GAC-3′), Pig-F (5′-CTA GGG TGT TCT AAT Cat CCT AC-3′) és P687-R (5′-Gat ATC Tac GGA TTT CAC TCC Tac ACC-3′) (2.táblázat). Ezeknek a primereknek a specifitását a Genbank adatbázisából elérhető összes baktériumszekvencián ellenőriztük a Blast program 2.0 verziójával (Nemzeti Biotechnológiai Információs Központ, Bethesda, MD, USA).

2.4 SRB identification by multiplex PCR

Four collection strains (D. piger ATCC 29098T, D. desulfuricans Essex 6 ATCC 29577T, D. desulfuricans MB ATCC 27774, and D. fairfieldensis ATCC 700045) and 12 clinical strains (two strains related to D. desulfuricans Essex 6, két, a D. desulfuricans MB-hoz kapcsolódó törzs és nyolc, D. fairfieldensis-ként azonosított törzs) pozitív kontrollként használták. A PCR érzékenységét számszerűsített baktériumtörzs-szuszpenziók hígításával értékeltük. A PCR specificitását negatív kontrollokkal ellenőrizték, beleértve a következő fajokhoz tartozó típustörzseket (Bilophila wadsworthia ATCC 49260T, Desulfovibrio gigas DSM 1382T, Desulfovibrio vulgaris DSM 644T) és gyakori intesztinális klinikai törzseket: Bacteroides törékeny, Bacteroides merdae, Bacteroides thetaiotaomicron, Bacteroides egységes, Bacteroides vulgatus, Campylobacter jejuni, Citrobacter freundii, baktériumok ártalmatlan, Enterobacter Római Birodalom, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Escherichia coli, Eubacterium kicsi, Eubacterium ragadós, Fusobacterium nucleatum, Koppenhága a csatorna, Klebsiella oxytoca, Klebsiella pneumoniae, Morganella morganii, Peptostreptococcus big, Proteus wonderful, Proteus common, Providencia stuartii, Pseudomonas aeruginosa, Serratia marcescens, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis és Streptococcus bovis.

az inkubációs idő végén mind a 151 inokulált tesztkészletet (Laborc) a multiplex PCR segítségével ellenőriztük. A DNS-kivonatokat 500 MHz táptalajból nyertük centrifugálás és reszuszpendálás után te pufferben (10 mM–es trisz-HCl, 1 mM-es EDTA, pH 8). Röviden, a sejteket lizáltuk egymás után lizozim (3 mg ml−1), SDS (1%, m/v) és proteináz K (0,25 mg ml−1) alkalmazásával. Egy éjszakán át tartó inkubálás után 37cc-nál a DNS-t standard fenol/kloroform/izoamil-alkohol módszerrel extraháltuk. Minden 50-6L PCR-elegy 5 ml DNS–kivonatot (kb. 50 ng DNS-t) és végső mennyiségben 0,4 ml DNS-kivonatot, 0,8 mM dezoxinukleozid-trifoszfátot (Boehringer Mannheim Biochemicals, Mannheim, Németország), 0,4 mM Tris-HCl puffert, 1,5 mM MgCl2-t és 1,5 e Taq DNS-polimerázt (Gibco BRL Life Technologies, Paisley, Egyesült Királyság) tartalmazott. Az összes reakciót a GeneAmp 2400 PCR rendszer (Perkin-Elmer, Norwalk, CT, USA) alkalmazásával hajtottuk végre. A kezdeti denaturálási lépést 94 c-n keresztül 4 percig 30 denaturálási ciklus követte (94 C-N, 1 perc), lágyítás (55 C-N, 1 perc) és meghosszabbítás (72 C-N, 2 perc), majd a végső meghosszabbítás (72 C-N, 5 perc). Negatív (víz a DNS-kivonat helyett) és pozitív (D. fairfieldensis DNS-kivonat) kontrollokat is bevontak minden egyes vizsgálatba. Az amplifikált termékeket elektroforézissel oldottuk fel 1,5% (m/v) etidium−bromidot (1,6 mg ml-1) tartalmazó agaróz gélekben. Méretjelzőként egy 100 bp-es DNS-létrát használtunk (Gibco BRL Life Technologies, Rockville, MD, USA). D. piger, D. desulfuricans Essex 6, D. a desulfuricans MB és a D. fairfieldensis egy 255-, 255-, 396 – és 534-bp-es sávval azonosították. A D. pigert és a D. desulfuricans Essex 6-ot külön PCR-vizsgálatokkal tovább differenciálták a megfelelő specifikus primerek felhasználásával. Negatív minták esetében 16S rDNS amplifikációt végeztünk a 27F és 1525r konszenzusos primerek alkalmazásával annak ellenőrzésére, hogy a PCR-k nem gátolják-e a szennyeződéseket.

3 eredmények

3.1 SRB kimutatás és számlálás

egészséges egyénekben és a fenti kritériumok szerint az SRB-t 10 székletben (24%) találták mind a test-kit Lab (6ge), mind a Postgate táptalajával. A Hepato-Gastro-Enterológiai egységből származó betegeknél az SRB-t 42 székletből tenyésztették Postgate táptalajával. Három további mintát találtak pozitívnak a tesztkészlet laboratóriuma esetén. Így a vizsgált 110 beteg közül az SRB-T 45 betegnél (41%) tenyésztéssel detektálták. Három további minta kétértelmű eredményeket adott a tesztkészlet laboratóriumával (a sötét barnás csapadék jelenléte). Az SRB növekedésének átlagos kimutatási ideje 2, illetve 6 nap volt a test-kit Lab (1-11 nap), illetve a Postgate médium (3-39 nap) alkalmazásával. Egészséges egyének és betegek székletében az SRB átlagos száma 105 g−1 volt (102-109 g−1 tartomány). Így az SRB száma nem volt összefüggésben a betegek klinikai állapotával.

3.2 SRB azonosítás multiplex PCR-rel

a multiplex PCR-vizsgálat érzékenysége 100 baktérium / ml volt. Specifitását a négy differenciált genofaj közötti keresztreakció hiányával állapították meg. Minden pozitív kontrollt kizárólag a megfelelő alapozókészlettel találtunk pozitívnak. A specificitás ellenőrzésére negatív kontrollként használt összes törzs, beleértve a D. gigas és a D. vulgaris típusú törzseket is, negatív eredményt adott a négy alapozó készletnél. A reakciók specifitását az amplifikált termékek szekvenálásával tovább erősítettük. A kapott szekvenciák mindig megfeleltek a vártaknak. PCR-rel végzett SRB-negatív minták esetében a 16S rDNS amplifikáció lehetővé tette a PCR-ek szennyeződések általi gátlásának lehetőségét.

a máj-Gastro-Enterológiai egységből származó betegeknél a 45 pozitív és a három nem egyértelmű széklet PCR-rel pozitív eredményt adott. Megfeleltek D. pigernek (n=33), D. fairfieldensisnek (n=14) vagy mindkettőnek (n=1). D. desulfuricans nem bizonyított (3. táblázat). A tenyészet-negatív lombikok PCR-rel is negatívak voltak.

3.3 kapcsolat a Desulfovibrio fajok és az IBD

között a fajok megoszlása nem különbözött szignifikánsan az egészséges egyének és a nem gyulladásos bélbetegségben szenvedő betegek összehasonlításakor. A D. piger alig volt elterjedtebb, mint a D. fairfieldensis. Ezzel szemben az IBD-ben szenvedő betegeknél a D. piger 4-szer gyakoribb volt, mint a D. fairfieldensis. Ez a különbség különösen a CD esetében volt észrevehető, mivel az IBD betegek főleg CD-betegekből álltak. Továbbá, a D prevalenciája. a piger szignifikánsan magasabb volt az IBD miatt kórházba került betegeknél, mint az egészséges egyéneknél vagy más patológiák miatt kórházba került betegeknél (P<0,05). Nem volt összefüggés a betegség stádiuma és az ESZT jelenléte között. A terápia nem módosította ezen baktériumok izolációs sebességét.

4 megbeszélés

az SRB jelenlétét az állatok és az emberek bélrendszerében már régóta felismerték, bár a fajok szintjén történő azonosítást ritkán végezték el. Eredményeink megerősítik, hogy ezek a baktériumok az emberek bélrendszerének gyakori lakói. Az IBD-s betegek intesztinális SRB-jének legtöbb vizsgálata a tenyésztésen alapuló mikrobiológiai elemzésre támaszkodott székletminták, ezért azonosították az SRB-t a nemzetség szintjén . A legújabb tanulmányok azonban azt sugallják, hogy az SRB lehetséges szerepe az IBD patogenezisében összefüggésben lehet az SRB törzsei közötti fiziológiai és/vagy filogenetikai különbségekkel . Így kidolgoztunk egy multiplex PCR-t ezeknek a baktériumoknak a fajok szintjén történő azonosítására. Figyelembe véve az izolálás nehézségét és a specifikus keresések ritkaságát, az SRB prevalenciáját az emberi klinikai mintákban minden bizonnyal alábecsülik. Az SRB környezeti mintákból történő kimutatására kifejlesztett tesztkészlet-laboratórium, a kb, megfelelő közegnek bizonyult az SRB kimutatására székletből, valamint testnedvekből (Loubinoux, publikálatlan eredmény). A gyártó kimutatta az SRB környezeti törzseinek növekedését, mint például a D. desulfuricans DSM 1926, Desulfotomaculum nigrificans DSM 574T, Desulfobacter postgatei DSM 2034t és Desulfobulbus propionicus DSM 2032t. Kezünkben érzékenyebbnek bizonyult, mint az általánosan használt Postgate táptalaja, mivel a betegeknél további hat Dezulfovibrio izolátumot észleltek. A bőséges kísérő Növényvilág ellenére a tesztkészlet laboratóriuma, a ons lehetővé tette az SRB gyors növekedését a székletmintákból, mivel a kimutatás átlagos ideje 2 nap volt (szemben a Postgate közegében lévő 6 nappal). Ez összefügghet a táptalaj minőségével, de a minták beoltásának módjával is, amely biztosítja a szigorú anaerobiosis fenntartását. A Postgate közegéhez képest az acetát hozzáadása a laktáthoz kiszélesíti a detektálási spektrumot, hogy magában foglalja a lassan növekvő acetátot metabolizáló SRB – t, például a Desulfobacter spp-t. Ezenkívül a titán-citrát jelenléte, amely nagyon hatékony redukálószer (a tesztkészlet Laboratóriumának Redoxpotenciálja Kb -600 MV), lehetővé teszi az SRB legtöbb törzsének gyorsabb kimutatását.

lehetséges, hogy az SRB egyes törzseit a vizsgálati készletek laboratóriuma nem detektálta, a kísérő flóra benőtte őket, vagy a minták alacsony száma miatt. Azonban a tesztkészlet laboratóriuma, a Ons a legtöbb SRB növekedéséhez igazodik, és az összes pozitív lombikot PCR-rel azonosították D. piger, D. fairfieldensis vagy D. desulfuricans. A 2 hónapos inkubációs idő ellenére további fajokat nem bizonyítottak. Így lehetséges, hogy megállapításaink megfelelnek a valódi emberi flórának, amely szinte kizárólag a D. piger és a D. fairfieldensis. A D. desulfuricans-t egyszer izolálták , és egy korábbi vizsgálatban embereken is leírták, de valószínűleg nem gyakori a bélrendszerben. A legtöbb esetben D. piger és D. a fairfieldensis kölcsönösen kizárta egymást. Mindkét faj társulását csak egyszer figyelték meg vastagbélrák esetén. A D. piger és a D. fairfieldensis szinte egymást nem átfedő előfordulásának megerősítésére öt, szilárd Postgate táptalajban termesztett SRB kolóniát azonosítottak PCR-rel minden pozitív teszt esetében-Kit Lab 6g. Mindegyik esetben ugyanazt az eredményt kaptuk, és az öt kolónia ugyanahhoz a fajhoz tartozott (az adatok nem szerepelnek). 10 beteget (öt SRB-pozitív és öt SRB-negatív) követettünk 2 hónapig, és a székletet hetente tenyésztettük. Minden beteg esetében ugyanazt az eredményt (SRB-pozitív vagy SRB-negatív) kaptuk az összes mintával (az adatok nem jelennek meg). Érdekes lenne azonban hosszabb ideig követni az IBD-ben szenvedő betegeket annak megállapítására, hogy a betegség aktivitása hatással van-e az SRB populációjára.

a D. desulfuricans általában elkülönül a környezettől, és a D. fairfieldensis legutóbbi leírásáig a Desulfovibrio legelterjedtebb fajának tekintik az emberekben. Így meglepődhet a D. desulfuricans nagyon alacsony előfordulása a lakosságunkban. A D. pigert és a D. fairfieldensist eddig kizárólag emberi mintákból izolálták. Így eredményeink azt mutatják, hogy mindkét faj specifikus lehet az emberi bélrendszerre. Ezt azonban továbbra is meg kell határozni ezeknek a baktériumoknak a konkrét keresése más ökológiai fülkékben. A D. piger-t csak egyszer írták le , és az emberekben nem gyakori megállapításnak tekintették. Eredményeink azt mutatják, hogy ez lehet a leggyakoribb SRB a bélrendszerben. Ezt a fajt azonban soha nem írták le fertőző folyamatokban. Ellenkezőleg, D. a fairfieldensist, amely látszólag kevésbé gyakori az emberi ürülékben, a vastagbél lumenén kívül izolálták vérből és szeptikus gyűjteményekből . Így a D. fairfieldensis további invazív tulajdonságokkal rendelkezhet a Desulfovibrio más fajaihoz képest, ami megmagyarázza a klinikai mintákból való visszanyerését. Érdekes, hogy betegsorozatunkban a D. piger előfordulása a székletben szignifikánsan magasabb az IBD (főleg CD) miatt kórházba került betegeknél, mint egészséges egyéneknél vagy más patológiák miatt kórházba került betegeknél. Ennek két magyarázata lehet: vagy D. a piger fiziológiai jellemzőkkel rendelkezik, amelyek a sérülések kialakulását okozzák és / vagy részt vesznek a krónikus gyulladásos folyamatok állandósításában, vagy az IBD-s betegek helyi körülményei kedveznek ennek a fajnak a kolonizációjának. Az SRB és az IBD kapcsolatát már leírták . A D. pigert 1976-os első leírása óta nem vizsgálták tovább . Ezért meglepő az a megállapítás, hogy ez a baktérium, amelyet nem patogénnek tekintenek, az emberi bélrendszer közös lakója, és az IBD-s betegeknél a legelterjedtebb SRB-faj. További vizsgálatokat kell végezni annak tisztázására, hogy a D. piger milyen szerepet játszhat ezekben a krónikus gyulladásos folyamatokban.

Köszönetnyilvánítás

ezt a munkát részben támogatta a Compagnie Fran adapt de G Cauctothermie (Orl Adaptans, Franciaország) és a POCTI 36562/ESP/2000 FCT-támogatás az ICP-nek. Hálásak vagyunk a néhai Dr. Wee Tee-nek (Melbourne-i Egyetem, Ausztrália) a D. fairfieldensis négy törzsének (beleértve az ATCC 700045 törzset is), valamint Prof. D. Raoultnak (Marseille-i Egyetem, Franciaország) A D. fairfieldensis egy törzsének biztosításáért. Köszönjük D. Meng és A. M. Carpentier (Laboratoire de bact Enterpriologie-Virologie UMR CNRS 7565) a kiváló technikai segítségnyújtásért, Dr. A. Dao és Prof. B. Fortier az egészséges egyének ürülékének biztosításáért, valamint a máj-Gastro-Enterológiai egység ápolói kedvességükért.