vezető nyomozó: Zuben E. Sauna, PhD
Iroda / osztály / Lab: OTAT / DPPT / HB
általános áttekintés
a fehérje alapú terápiák egyik fő problémája az immunogenitásuk, Vagyis hajlamuk arra, hogy nemkívánatos immunválaszt váltsanak ki maguk ellen. Az immunválasz egyik formája a B-sejtek aktiválása, amelyek antitesteket termelnek, amelyek kötődnek a fehérjékhez, és csökkentik vagy megszüntetik terápiás hatásukat. Az ilyen antitestek életveszélyes szövődményeket is okozhatnak. Ezért a fehérje alapú terápiás termékek klinikai biztonságosságának és hatékonyságának meghatározásának kritikus része az antitestképződés kiváltására való hajlamuk mérése.
a fehérje alapú terápiákra adott immunválasz magában foglalja a T-sejteket is, amelyek segítenek aktiválni a B-sejteket, így antitesteket termelnek, beleértve azokat is, amelyek blokkolják a fehérje terápiákat. Ez akkor fordul elő, ha a test által termelt természetes fehérje valamilyen módon hibás. Ebben az esetben a T-sejtek reagálnak egy normális, mesterséges fehérje terápiás mintha idegen lenne, mivel különbözik a hibás, természetes fehérjétől. A T-sejt válasz eltérése, mint ez néha előfordul a fehérje esetében FVIII, egy olyan fehérje, amely kritikus fontosságú a szervezet azon képessége szempontjából, hogy vérrögöket képezzen a vérzés megállításához. Azok az emberek, akiknek nincs elegendő mennyiségű FVIII, vagy akiknek a FVIII valamilyen módon hibás, hemofília A-ban szenvednek, olyan betegségben, amelyben a véralvadás hibás és túlzott vérzéshez vezet. A hibás FVIII problémája genetikailag alapul. Bár az a hemofília nem gyógyítható, az FVIII terápiás fehérje infúziója az egyik legsikeresebb példa a krónikus betegség kezelésére. Sajnos az infundált FVIII elleni gyógyszerellenes antitestek kifejlesztése jelentős akadálya ennek a stratégiának. Az immunválaszt kialakító betegek kezelése összetettebb, kevésbé hatékony és rendkívül költséges. Most úgy tűnik, hogy a gyógyszerellenes antitestek kialakulásának tendenciájának egyedi variációi genetikai különbségeken is alapulhatnak. Ezt tükrözi az a klinikai megfigyelés, hogy a fekete-afrikai származású a hemofíliában szenvedő személyek kétszer nagyobb valószínűséggel termelnek antitesteket az európai kaukázusi származású betegek ellen VIII-as faktor fehérjék helyettesítő terápiaként adva.
a természetes FVIII és a helyettesítő FVIII közötti eltérések megelőzésének egyik stratégiája a géntechnológiával módosított FVIII fehérjék megtervezése, hogy ne váltsanak ki immunreakciókat. De annyi különbség van az emberek immunrendszere között, hogy nem valószínű, hogy a kutatók képesek lesznek megtervezni egy FVIII fehérjét, amely mindenki számára biztonságos. Ezért azt javasoljuk, hogy személyre szabott megközelítést alkalmazzunk az FVIII fehérjékre adott immunválasz előrejelzésére és elkerülésére. Hosszú távú célunk egy génalapú megközelítés kidolgozása azon egyének azonosítására, akiknek immunrendszere valószínűleg reagál a géntechnológiával módosított terápiás fehérjék specifikus verzióira, így ezek a betegek kezelhetők ezen fehérjék olyan verzióival, amelyek kevésbé valószínű, hogy immunválaszt okoznak.
a fehérje-gyógyszerek és a természetes fehérjék háromdimenziós szerkezetének különbségeivel is foglalkozunk, amelyek a B-sejteket terápiás fehérjék elleni antitestek előállítására indítják. A jelenlegi módszer annak előrejelzésére, hogy az ilyen fehérjék bizonyos részei kiváltják-e az antitestképződést, kihívást jelent és költséges. Ezért apró darab DNS-szerű molekulákat, úgynevezett aptamereket használunk a fehérjék szondázására és pontos alakjuk meghatározására. Az aptamerek nukleinsavaknak nevezett molekulák húrjaiból készülnek, amelyek meghatározott formákba hajtogatnak, attól függően, hogy mely nukleinsavak vannak jelen, és milyen sorrendben fordulnak elő az aptamerben. Ezért annak azonosításával, hogy melyik aptamer kötődik szorosan a molekula egy meghatározott részéhez, megjósolhatjuk a molekula azon részének alakját, kissé hasonlóan a zár alakjának előrejelzéséhez, ha ismerjük a kulcs alakját, amely beleillik.
most ezt a technikát használjuk mind a FVIII, mind a lépfene toxin védő antigénnek nevezett részének alakjának meghatározására. Ha egy aptamer elveszíti például az FVIII-hoz való kötődési képességét, ez azt jelzi, hogy ennek a véralvadási fehérjének egy része megváltozott, növelve annak valószínűségét, hogy immunreakciót vált ki, amely csökkenti terápiás aktivitását. Ezt a megközelítést alkalmazzuk annak meghatározására, hogy a terápiás fehérjék olyan formájúak-e, amelyek kiváltják az antitest termelést. És együttműködünk a Center for Drug Evaluation and Research – rel, hogy adaptáljuk ezt a technológiát az új fehérjetermékek elemzésére, amelyeket a meglévő, jóváhagyott fehérje gyógyszerek (biohasonlók) másolataként fejlesztettek ki annak biztosítása érdekében, hogy biztonságosak és hatékonyak legyenek.
tudományos áttekintés
1) A T-sejt epitópok kölcsönhatásának előrejelzése specifikus MHC II osztályú antigénekkel.
a VIII-as faktor (FVIII) a véralvadási kaszkád lényeges összetevője, és a véralvadási faktorok hiányában szenvedő egyének egész életen át tartó vérzési rendellenességeket mutatnak. Az FVIII terápiás (infúziós) verzióival szembeni immunogenitás kialakulása jelentős akadálya a hemofíliák sikeres kezelésének.
Az a hemofília eseteinek körülbelül 50% – át az F gén 1-22 exonjainak inverziója okozza, ami egy olyan polipeptid termelését eredményezi, amely ezeket az exonokat képviseli, de nem 23-26. Az F8 promóterben azonban van egy beágyazott gén, amely a 23-26 exonokat fordítja le. Mindazonáltal az 1-22 inverzió azt jelenti, hogy az ebből a fehérjéből származó átfedő peptidek nem tartalmazzák az 1-22 és 23-26 közötti csomópontot. Míg az infúzióban lévő FVIII gyógyszer-fehérje peptidjei, amelyek lefedik ezt a csomópontot, idegenek lennének a beteg immunrendszerétől, általában nem immunogének. Inkább az endogén és az infundált FVIII közötti különbségek miatti immunogenitás valószínűleg különféle tényeknek köszönhető, különösen az egy nukleotid polimorfizmusoknak (SNP-k), de a missense mutációknak és delécióknak, valamint a nonszensz mutációknak, valamint az inverzióknak is
ezért az infundált FVIII immunogenitási problémájának ideális (de nem valószínű) megoldása az lenne, ha az egyes betegek haplotípusának és HLA típusának megfelelő FVIII helyettesítéseket terveznének az immunválasz kiváltásának elkerülése érdekében. Bár az ilyen biológiai anyagok tervezése minden beteg számára nem praktikus, lehetséges olyan esetekben, amikor egyértelmű és jelentős különbségek vannak az egyes populációk között (például az európai kaukázusi és fekete-afrikai származásúak között). Ilyen esetekben kívánatos lenne az endogén FVIII kialakítását az egyes csoportokhoz igazítani annak biztosítása érdekében, hogy az egyik populáció ne részesüljön aránytalan arányban az FVIII egyetlen változatának előnyeiből, míg a másik populáció aránytalan arányban viseli az ugyanazon infúzióval kezelt FVIII kockázatait.
A jelenlegi technológia lehetővé teszi a FVIII haplotípus hátterének azonosítását, valamint legalább korlátozott számú személyre szabott VIII-as faktor gyógyszertermék kifejlesztését. Ezért rövid távú célunk a különböző haplotípusok (SNP-k) mennyiségi eloszlásának meghatározása európai-kaukázusi és fekete-afrikai származású egyéneknél; 2) az MHC II.osztályú antigének eloszlása ezekben a populációkban; 3) a gyógyszerként használt FVIII összetétele; és 4) betegséget okozó mutáció, deléció vagy inverzió az egyes betegek F8 génjében (FVIII). Ezeket az adatokat arra használjuk, hogy megjósoljuk az egyes FVIII termékek immunogenitását különböző populációkban és/vagy egyes betegeknél.
2) Aptamerek fejlesztése a fehérje-gyógyszer konformációs epitópok vizsgálatának eszközeként.
az Aptamerek, a komplex konformációk kialakítására képes nukleinsavak potenciális eszközök a fehérje konformáció feltérképezéséhez, az immunogén helyek azonosításához és előrejelzéséhez, valamint az immunogenitás megkerüléséhez. Laboratóriumunk egyszálú DNS aptamereket fejleszt ki rekombináns humán VIII-as faktorra.
terveztünk egy naiv DNS-könyvtárat aptamerek előállítására meghatározott 5 és 3 (60) – bázisú PCR-régiók felhasználásával, randomizált 60-bázis régió mellett. A DNS-könyvtárat denaturálták, és az ssdns-szegmenseket egyedi 3 dimenziós alakzatokká alakították. (A 60 véletlenszerű bázis elméletileg 460 egyedi konformert eredményezne.) A hajtogatott ssdns készletét FVIII-val inkubáltuk, majd iteratív SELEX (a ligandumok szisztematikus evolúciója exponenciális dúsítással) ciklusokon keresztül kiválaszthattuk a fehérjéhez kötődő aptamereket.
laboratóriumunk a 3., 5. és 8. ciklusban kiválasztotta az egyes aptamerek mintavételét, majd klónozta és szekvenálta őket. Ezeket a klónokat használjuk az aptamerek jellemzésére az előrejelzett 3D szerkezet, kötési tulajdonságok és a VIII-as faktor aktivitásra gyakorolt hatás elemzésével. Ezen túlmenően ezen klónok in silico összehasonlítását végezzük, hogy kövessük az aptamerek fejlődését.
3) különböző analitikai technikák alkalmazása a fehérje jellemzőinek értékelésére, amelyek korrelálhatnak az immunogenitással.
együttműködve Drs. Mansoor Khan és Rakhi Shah (termékminőség osztály, CDER) elemezzük a gyógyszer segédanyag-kölcsönhatásait termikus módszerekkel (differenciális pásztázó kalorimetria, mikrokalorimetria, termogravimetriás elemzés), spektroszkópiai technikák (Fourier-transzformáció infravörös, közel infravörös, Raman), kristályográfia (röntgendiffrakció) és magmágneses rezonancia.
4) A konformációra érzékeny antitestek jellemzése.
a terápiásán fontos fehérjék konformációs epitópjainak tanulmányozásának alternatív módszere a konformációs változásokra érzékeny antitestek kifejlesztése és jellemzése. Dr. Chava Kimchi-Sarfaty-val (CBER) együttműködve számos olyan antitestet jellemeztünk, amelyek érzékenyek az ADAMTS13 cink-metalloproteáz konformációjára, amely a von Willebrand-faktort hasító, trombotikus thrombocytopeniás purpurában szerepet játszik. Eredményeink azt sugallják, hogy ezek az antitestek hasznos reagensek lehetnek a funkcionális és nem funkcionális ADAMTS13 megkülönböztetésére, valamint a katalitikus ciklus során bekövetkező konformációs átmenetek elemzésére.
publikációk
Int J Mol Sci 2020 május 20;21(10):E3598
a mikroRNS-ek szerepe az emberek hemofíliájában és trombózisában.
Jankowska KI, szauna ZE, Atreya CD
transzfúzió 2020 február; 60(2): 401-13
Az a hemofília klinikai megnyilvánulása az FVIII-t kódoló F8 gén mutációinak hiányában: a mikroRNS-ek szerepe.
Jankowska KI, McGill J, Pezeshkpoor B, Oldenburg J, Atreya CD, szauna ze
J Thromb Hemost 2020 Jan;18(1):201-16
kvantitatív HLA-osztály-II/VIII-as faktor (FVIII) Peptidomikus variáció a dendritikus sejtekben korrelál a terápiás FVIII fehérjék immunogén potenciáljával a hemofíliában A.
Diego VP, Luu BW, Hofmann M, din lv, Almeida m, Powell js, Rajalingam R, Peralta Jm, Kumar s, Curran je, szauna ze, Kellerman R, Park y, kulcs ns, Escobar ma, Huynh h, Verhagen am, Williams-BLANGERO s, Lehmann PV, MARASKOVSKY e, blangero J, Howard te
front Immunol 2019 Dec 20;10:2894
SampPick: válogatás a kohorsz alanyok megfelelő populáció HLA Eloszlás.
McGill JR, Yogurtcu ON, Verthelyi D, Yang H, szauna ze
Sci Rep 2019 Oct 29;9 (1): 15449
a kodon optimalizálásának hatása a IX-es véralvadási faktor transzlációjára és szerkezetére: a fehérje-és génterápiákra gyakorolt hatások.Alexaki a, Hettiarachchi GK, Athey JC, Katneni UK, Simhadri V, Hamasaki-Katagiri N, Nanavaty P, Lin B, Takeda K, Freedberg D, Monroe D, McGill JR, Peters R, Kames JM, Holcomb DD, Hunt RC, szauna ZE, Gelinas A, Janjic N, DiCuccio M, bár H, Komar AA, Kimchi-Sarfaty C
vér Adv 2019 szeptember 10;3(17):2668-78
a T-SEJTFÜGGŐ immunogenitás csökkentése a VIIa faktor analógjának újratervezésével.
Jankowski W, McGill J, Lagasse volt, Surov S, Bembridge G, Bunce C, Cloake E, Fogg MH, Jankowska KI, Kán a, Marcotrigiano J, Ovanesov MV, szauna ZE
AAPS J 2019 augusztus 2; 21 (5): 96: in silico kockázatértékelő eszköz a bioterápiás fehérje immunogenitásához.
Yogurtcu ON, szauna ZE, McGill JR, Tegenge MA, Yang H
Am J Physiol Gastrointest máj Physiol 2019 június 1; 316 (6):G720-34
transzlációs és transzkripciós válaszok humán primer hepatocitákban hipoxia alatt.
Hettiarachchi GK, Katneni UK, Hunt RC, Kames JM, Athey JC, Bar H, szauna ZE, McGill JR, Ibla JC, Kimchi-Sarfaty C
vér Adv 2019 május 14;3(9):1429-40
a monocita eredetű dendritikus sejteken azonosított peptidek: az FVIII termékek klinikai immunogenitásának markere.
Jankowski W, Park Y, McGill J, Maraskovsky E, Hofmann M, Diego VP, Luu BW, Howard TE, Kellerman R, Key NS, szauna ze
AAPS J 2019 május 6;21(4):62
Az Fc-fúziós gyógyszerek fcgammar/C1q kötő és jelző tulajdonságokkal rendelkeznek, amelyek befolyásolhatják immunogenitásukat.
Lagasse volt, Hengel H, Golding B, szauna ze
trendek Biotechnol 2018 október; 36 (10): 1068-84
értékelése és enyhítése immunogenitását terápiás fehérjék.
szauna ZE, Lagasse D, Pedras-Vasconcelos J, Golding B, Rosenberg mint
Hum Immunol 2018 október; 79 (Suppl.):103-4
Az egészséges donorok és hemofília-A (ha) betegek dendritikus sejtjei által bemutatott HLAcII peptidómák elemzése VIII-as faktor (FVIII) inhibitorokkal vagy anélkül, különböző terápiás FVIII fehérjék (tFVIIIs) ex vivo beadása után.
Howard TE, Diego VP, Hofmann M, Almeida M, Luu BW, Dinh LV, Rajalingam R, Escobar M, Curran J, Williams-Blangero S, Powell J, Blangero J, Maraskovsky E, Key NS, szauna ze
Mol Ther módszerek Clin Dev 2018 június 15;10:105-12
A CRISPR-hez társuló Cas9 nukleáz elleni már létező antitestek prevalenciája az USA populációjában.
Simhadri VL, McGill J, McMahon S, Wang J, Jiang H, szauna ze
J Pharm Pharmacol 2018 május; 70 (5):584-94
immunogenitás értékelés a fehérje terápiák fejlesztése során.
Rosenberg AS, szauna ze
vérátömlesztés 2017 október; 15 (6): 568-76
összefoglaló jelentés az első nemzetközi konferencia inhibitorok haemophilia A.
Lacroix-Desmazes S, Scott DW, Goudemand J, Van Den Berg M, Makris M, van Velzen AS, Santagostino E, Lillicrap D, Rosendaal FR, Hilger A, szauna ZE, Oldenburg J, Mantovani L, Mancuso ME, Kessler C, Hay CR, Knoebl P, Di Minno G, Hoots K, Bok A, Brooker M, Buoso E, Mannucci PM, Peyvandi F
J Med Genet 2017 május;54(5):338-45
egyetlen szinonim mutáció a IX-es Faktorban megváltoztatja a fehérje tulajdonságait és a haemophilia B alapját képezi.
Simhadri VL, Hamasaki-Katagiri N, Lin BC, vadászat R, Ib S, Tseng SC, Wu a, Bentley AA, Zichel R, Lu Q, Zhu L, Freedberg DI, Monroe DM, szauna ZE, Peters R, Komar AA, Kimchi-Sarfaty C
J Thromb Haemost 2017 április;15(4):721-34
A IX-es faktor Immunogenitásának modulálása egy immunglobulin Fc doménhez való fúzióval: egy tanulmány a hemophilia B egér modelljével.
Levin D, Lagasse HA, Burch E, Strome S, Tan S, Jiang H, szauna ZE, Golding B
F1000Res 2017 február 7;6:113
a (terápiás fehérje) gyógyszerfejlesztés legújabb fejleményei.
Lagasse ha, Alexaki a, Simhadri VL, Katagiri NH, Jankowski W, szauna ZE, Kimchi-Sarfaty C
Sci Transl Med 2017 január 11;9 (372): aag1286
Post hoc értékelése immunogenitásának biomérnöki faktor VIIa bizonyítja a preklinikai eszközök.
Lamberth K, Reedtz-Runge SL, Simon J, Klementyeva K, Pandey GS, Padkj Kb SB, Pascal V, Le Kb IR, Gudme CN, Buus S, szauna ze
Biomed Res Int 2015;2015: 456348
izomsorvadás: betegség mechanizmusok és terápiák.
Pandey SN, Kesari A, Yokota T, Pandey GS
per Med 2015; 12(4):403-15 személyre szabott megközelítések kezelésére hemofília A és B.
Simhadri VL, Banerjee AS, Simon J, Kimchi-Sarfaty C, szauna ze
PLoS One 2015 július 15;10(7):E0132433 kis ncrns expresszió-profilalkotás vér hemofília a betegek azonosítja miR-1246, mint a potenciális szabályozó Ffctor 8 gén.
Sarachana T, Dahiya N, Simhadri VL, Pandey GS, Saini S, Guelcher C, Guerrera MF, Kimchi-Sarfaty C, szauna ZE, Atreya CD
nukleinsavak Res 2015 július 13;43(12):5699-707
nagyszabású elemzés a mutációs táj HT-SELEX javítja aptamer felfedezés.
Hoinka J, Berezhnoy A, Dao P, szauna ZE, Gilboa E, Przytycka TM
vér 2015 Jan 8; 125 (2): 223-8
az intron-22-invertált F8 lokusz lehetővé teszi az intracelluláris VIII-as faktor szintézisét, megmagyarázva annak alacsony inhibitor kockázatát, és a farmakogenomika szerepére utal.
szauna ZE, Lozier JN, Kasper CK, Yanover C, Nichols T, Howard te
trendek Biotechnol 2015 Jan;33(1):27-34
Fc fúziós mint platform technológia: lehetséges moduláló immunogenitás.
Levin D, Golding B, Strome SE, szauna ze