változatos motívumegyüttesek az AP-1 családtagok nem redundáns DNS-kötő aktivitását határozzák meg makrofágokban

statisztikai elemzések

ábrán. 1c, a génexpresszió különbségeit független T-teszttel (szabadságfok = 1, Kétfarkú) teszteltük két párhuzamos kísérleten (n = 2). Differenciálisan expresszált gének az ábrán. Az 1b-t az edger55 használatával azonosítottuk alapértelmezett paraméterekkel, az FDR < 0 cut off használatával.05 és log2 szeres változás 6. Ábra. 2c, az egyes csoportok közötti különbségeket (Veh, megosztott és KLA 1 h) független T-teszttel vizsgáltuk (szabadságfok = 1, Kétfarkú); az egyes csoportokban az egyes monomerek lókuszainak száma a következő ATF3 (Veh = 1447, megosztott = 7460, KLA = 6997), Jun (2390, 3751, 3401), JunD (1351, 5976, 6422). A motívumok jelentősége az ábrán. A 4A-t a valószínűségi Arány teszt (szabadságfok = 1) segítségével számítottuk ki, összehasonlítva a teljes TBA modell és a zavart TBA modell előrejelzéseit a Veh-vel kezelt makrofágokban az atf3 (n = 23,160), A Jun (n = 15,548) és a JunD (n = 19,653) összes lokuszára. Jelentősége motívumok kiegészítő ábra. A 4C-t a valószínűségi Arány teszt (szabadságfok = 1) segítségével számítottuk ki, összehasonlítva a teljes TBA modell és a zavart TBA modell előrejelzéseit a Jund által kötött összes lókuszra GM12878-ban (n = 7451), H1-hESC-ben (n = 12 931), HepG2-ben (n = 41 318), K562-ben (n = 47 477) és SK-N-SH-ban (38 960). A motívumok jelentősége az ábrán. 5b, kiegészítő ábra. 5. B. és kiegészítő ábra. Az 5C-t a valószínűségi Arány teszt (szabadságfok = 1) segítségével számítottuk ki, összehasonlítva a teljes TBA-modell és a zavart TBA-modell előrejelzéseit a KLA-val kezelt makrofágokban kötött összes lókuszra Atf3 (n = 36 745), Jun (n = 17 481), JunD (n = 31 641), Fos (n = 24 365), Fosl2 (n = 10 619) és JunB (n = 13 376) esetén. Jelentőség értékek ábra. A 6f-et és az S6F-et az F-teszt segítségével számítottuk ki; a vivőanyaggal kezelt makrofágokban a monomerek szempontjából elemzett lókuszok száma ATF3 (n = 4163), Jun (n = 3004) és JunD (n = 4148); a KLA-val kezelt makrofágokban a monomerek szempontjából elemzett lókuszok száma: Atf3 (n = 4577), Jun (n = 3232), JunD (n = 4366), Fos (n = 4477) és JunB (n = 3616).

egyéni Genom létrehozása A BALB/cJ számára

egyéni Genom a BALB/cJ számára azáltal, hogy az mm10 Genom invariáns pozícióit az egér Genomjai projekt által jelentett allélokkal helyettesítik (3.verzió VCF fájl)43. A C57BL / 6J esetében az UCSC Genom böngésző mm10 referencia genomját használtuk. A BALB/cJ és a C57BL/6J összehasonlítása érdekében az elemzés során a balb/cJ egyedi genomjának koordinátáit eltoltuk, hogy megfeleljenek az mm10 referencia Genom pozícióinak a MARGE34 használatával. Nem elemeztünk olyan olvasást, amely a balb/cJ törléseibe esett. Olvassa el, hogy egy beillesztéssel átfedésben vannak a referenciatörzs utolsó átfedő pozíciójához rendelve.

A ChIP-seq csúcsok elemzése

A ChIP-seq kísérletekből származó szekvenálási leolvasásokat az egér referencia genomjának (vagy a BALBc/J egyedi genomnak) mm10 összeállításához térképeztük fel a Bowtie2 legújabb verziójának alapértelmezett paraméterekkel56. A leképezett ChIP-seq beolvassa a feltételezett TF kötőhelyek azonosítását a HOMER57 findPeaks paranccsal (paraméterekkel-méret 200-L 0-C 0-fdr 0.9), a kezelési állapotnak megfelelő bemeneti ChIP kísérlet segítségével. A hamis pozitív csúcsok számának csökkentése érdekében kiszámítottuk az IDR-t minden csúcsnál (a 2.0 verzió használatával.Az idr program 3.pontja) a HOMER csúcspontszámát az egyes párhuzamos kísérletekre számítva az IDR bemeneteként, majd kiszűrte az összes csúcsot, amelynek IDR-je 0,0558 volt. A De novo motívumokat a Homérosz findMotifsGenome.pl parancs alapértelmezett paraméterekkel. A De novo motívumok gazdagítását a findKnownMotifs.pl program HOMER alapértelmezett paraméterekkel.

az RNS-seq kísérletekből generált RNS expressziós olvasmányok számszerűsítését az mm10 egér referencia genomjához (vagy a BALBc/J egyedi genomhoz) igazítottuk csillag aligner alapértelmezett paraméterekkel59. Az egyes gének expressziós szintjének számszerűsítéséhez kiszámítottuk az RPKM-et az exonon belüli leolvasásokkal. Nem normalizált szekvenálási leolvasásokat használtunk a differenciálisan expresszált gének azonosítására az EdgeR55-Tel; figyelembe vettük azokat a géneket, amelyek FDR < 0,05 és két kísérleti állapot közötti expressziós változás kétszer vagy annál nagyobb differenciálisan expresszálódik. A születő RNS-ek kifejezésének számszerűsítéséhez a ChIP-seq csúcsainkat a Gro-seq olvasások számával (10 millióra normalizálva) jegyeztük fel, amelyek a csúcsközponttól 500 bps-en belül voltak a HOMER segítségével annotatePeaks.pl parancsnokság.

TBA modellképzés

minden egyes AP-1 monomer esetében minden kezelési feltétel mellett kiképeztünk egy modellt, amely megkülönbözteti az egyes monomerek kötőhelyeit a véletlenszerűen kiválasztott genomi lókuszok halmazától. Az egyes modellek betanításához használt véletlenszerű háttérlókuszok halmazát a következő kritériumok alapján választottuk ki: (1) A háttérlókuszok GC-tartalomeloszlása megegyezik egy adott monomer kötőhelyeinek GC-tartalmával, (2) nem tartalmaznak kétértelmű vagy megváltoztathatatlan pozíciókat, és (3) a háttérszekvenciák száma megegyezik a K kötőhelyeinek számával. A kötési helyek és a háttérlókuszok kombinált halmazában szereplő szekvenciák mindegyikére kiszámítottuk a legmagasabb log-odds pontszámot (más néven motif score) az egyes n motívumokra, amelyek szerepelnek a modellben60 motívum mérkőzések mindkét irányban figyelembe vették. Log-odds pontszámok kevesebb, mint 0 voltak állítva 0. A lineáris modell betanítása előtt standardizált előfeldolgozási eljárások szerint minden motívumra egységesítettük a log-odds pontszámokat, az egyes motívumok pontszámkészletét úgy méreteztük, hogy az átlagos érték 0, a variancia pedig 1 legyen. A szabványosítás az összes motívum pontszámát ugyanabba a tartományba skálázza (a hosszabb motívumok nagyobb maximális pontszámmal rendelkeznek), és segít csökkenteni a multi-kollinearitás hatását a modellképzésre. Így a modellünk képzéséhez használt funkciók egy n by 2K mátrix, amely minden sorban szabványosított log-odds pontszámokat tartalmaz. A megfelelő címkék tömbjének létrehozásához minden kötési helyhez 1-es címkét, minden háttérlókuszhoz pedig 0-as címkét rendeltünk. Ezzel a funkció mátrix, label array, mi képzett súlyok minden motívum egy L1 Büntetni logisztikai regressziós modell által megvalósított scikit-learn Python package61. Az elemzésünkben bemutatott motívumsúlyok a keresztellenőrzés öt fordulójának átlagértékei, az adatok 80% – át az edzéshez, 20% – át pedig a teszteléshez használják minden körben. A modelleket kiképezték az ebben a tanulmányban generált ChIP-seq-kra, valamint az NCBI génexpressziós Omnibuszról (csatlakozási szám GSE46494) és a kódolási adatportálról (https://www.encodeproject.org) letöltött adatokra.

többszörös kollinearitás számszerűsítése

a modelljeink kiképzéséhez használt motívum pontszám jellemzőiben a multi-kollinearitás mértékének felméréséhez minden egyes kísérletnek megfelelő tulajdonságmátrixot vettünk, és kiszámítottuk az egyes motif38 VIF-jét. A VIF kiszámításához először meghatározzuk a meghatározási együtthatót, R2, minden motívumhoz úgy, hogy az egyik motívum log-odds pontszámait visszafejtjük a fennmaradó motívumok log-odds pontszámaival szemben. Ezután a determinációs együttható segítségével az egyes motívumok toleranciája kiszámítható az 1 és a determinációs együttható (1 − R2) közötti különbséggel. A VIF a tolerancia reciproka \(\frac{1}{{1-r^2}}\). A sklearn Python csomag linear_model modulját használtuk a meghatározási együttható kiszámításához.

Motívumcsoportosítás és összevonás

az összes DNS-szekvencia-motívum pár hasonlóságát az adott motifpárnak megfelelő igazított pozíciós valószínűségi mátrixok (PPMs) Pearson-korrelációjának kiszámításával határoztuk meg62. Az i hosszúságú A és B motívumok Pearson – korrelációját a következő képlettel számítjuk ki:

a PPM-eket először a Smith-Waterman igazítási algoritmus63 segítségével igazítottuk. A rövidebb motívumokat háttérfrekvencia-értékekkel párnázzák az igazítás előtt. Az igazítás hiányosságai nem voltak megengedettek, és az igazítás minden pozícióját a Pearson-korrelációval pontozták. A Pearson-korrelációt ezután az optimális igazítás segítségével számítottuk ki. Ezután olyan motívumkészleteket egyesítettünk, amelyek PPMs-je 0,9 vagy annál nagyobb Pearson-korrelációval rendelkezik, úgy, hogy az egyes PPM-eket a halmazon belül iteratív módon igazítottuk, majd átlagoltuk a nukleotid frekvenciákat minden helyzetben.

a motívumok szignifikanciájának értékelése a TBA szempontjából

a TBA p-értékeit a log-valószínűség Arány teszt segítségével számítottuk ki. Minden motívumot eltávolítottak a zavart TBA modell kiképzéséhez használt funkciókészletből (ötszörös keresztellenőrzéssel). Ezután a teljes modellt (amely tartalmazza az összes motívumot) és a zavart modellt használtuk annak kiszámításához, hogy egy adott monomer és az összes háttérrégió összes kötőhelyén és háttérszekvenciáján megfigyelhető-e a kötés. Ezután a teljes modell és a zavart modell által kiszámított valószínűségek különbségét használták a chi-négyzet teszt elvégzéséhez minden motívumhoz. A chi-négyzet tesztet a scipy python package64 segítségével végeztük.

Összehasonlítás más módszerekkel

a BaMM motif és a gkm-SVM egyaránt alapértelmezett paraméterekkel futott. A nagyobb méretű gkm-SVM, az LS-GKM (a https://github.com/Dongwon-Lee/lsgkm 8/25/16-on letöltött forráskódból lefordítva) és a Bamm motif legújabb verzióját használtuk; v1.0 letöltve a https://github.com/soedinglab/BaMMmotif3965-ből. Mindkét modellt ötszörös keresztellenőrzéssel képezték ki. A modell teljesítményét a sklearn metrics moduljából származó roc_auc_score és precision_score függvények segítségével értékelték.

az AP-1 kötés változásainak előrejelzése egy órás KLA kezelés után

a KLA kezelés utáni kötés változásának előrejelzéséhez az egyes n motívumok (wn) esetében megtanult motívumsúlyokat egy TBA modell segítségével használtuk ki, amelyet a vivőanyaggal kezelt adatokon (Wveh = ) és az 1-h KLA kezelt adatokon (Wkla = ) kiképeztek minden AP-1 monomerre. Az egyes szekvenciák kötésének várható változása ekkor a standardizált motívum pontszámok pont szorzata közötti különbség,amelyet az egyes k kötőhelyekre (Sk = ) kiszámítottak a KLA motívum súlyokkal, valamint a motívum pontszámok pont szorzata és a Veh motívum súlyok között (Inconkla−veh, k = Wkla Kb SK − Wveh Kb SK). Előrejelzéseket készítettek minden olyan genomi lókuszra vonatkozóan, amely metszi az egyik Ap-1 monomer csúcsát a vivőanyag vagy a KLA kezelési állapotban.

A törzsspecifikus kötés előrejelzése TBA-val

a törzsspecifikus kötés előrejelzéséhez az egyes n motívumokhoz (wn) megtanult motívumsúlyokat egy TBA modellel (W = ) használtuk minden AP-1 monomerre a C57BL/6J adatok felhasználásával, és az egyes k kötőhelyekre kiszámított motívum pontszámokat a c57bl/6J és BALBc/J genomi szekvenciájának felhasználásával (SC57, k=, SBAL , k = ). Ezután kiszámítottuk a c57bl6/J és a BALBc/J (Dn = ) motívum pontszámainak különbségét, majd standardizáltuk az egyes motívumok pontszámkülönbségeit az összes mutációval rendelkező k kötőhelyen, amikor összehasonlítottuk a BALBc/J-t a C57BL/6J-vel, standardizált motívum pontszámkülönbségeket eredményezve az egyes kötőhelyekre (Zn = standardize(Dn) = ). Végül a törzs – specifikus kötésre vonatkozó előrejelzést készítettünk a motívum súlyok pont szorzatának és a motívum pontszámok standardizált különbségének kiszámításával a C57BL6/EiJ és a BALBc/J között a K−edik mutált kötési helyre (ons 57-BAL = w).

TBA-2strain model training

minden egyes genomi lókuszra, amely metszi az egyik AP-1 monomer csúcsát, akár a C57BL/6J, akár a BALBc/J-ben, kiszámítottuk a legmagasabb log-odds pontszámot a modellben szereplő n motívumok mindegyikére,mindkét törzs genomi szekvenciájának felhasználásával , két motívum-pontszámot adva az egyes k kötőhelyekre (SC57,k=, SBAL, k = ). A motívum-egyezéseket mindkét irányban figyelembe vettük. Log-odds pontszámok kevesebb, mint 0 voltak állítva 0. A motívum pontszámok felhasználásával kiszámoljuk a motívum pontszámok standardizált különbségét a két törzs között a fenti szakaszban leírtak szerint (Zn = ). Így a modellünk képzéséhez használt funkciók az egyes sorokban szabványosított log-odds pontszámok n-k mátrixa. Ezután kiszámítottuk a chip-seq olvasások számának log2-szeres arányát C57BL / 6J-ban a BALBc/J-hez képest, hogy bemutassuk a törzsspecifikus kötés mértékét. Ezt a tulajdonságmátrixot használva, valamint a két törzs közötti kötés log2-szeres arányának függő változóként történő beállításával minden motívumhoz súlyokat képeztünk lineáris regresszióval, amelyet a scikit-learn Python csomag valósított meg. Az elemzésünkben bemutatott motívumsúlyok a keresztellenőrzés öt fordulójának átlagértékei, az adatok 80% – át az edzéshez, 20% – át pedig a teszteléshez használják minden körben. A törzsspecifikus kötésre vonatkozó előrejelzéseket az előző szakaszban leírt eljárást követő számított súlyok felhasználásával lehet elvégezni.

ChIP protokoll

Protein A és G Dynabeads 50/50 mix Invitrogen beperelte ChIP (10001d, 10003d). Az IP mix 20 db/2 db / 2 millió sejtes chipből áll. Az AP-1 családtagok elleni antitesteket választottuk a nem konzervált régiók célzására a nem specifikus kötődés lehetőségének minimalizálása érdekében. Az antitesteket a 3. Kiegészítő táblázat tartalmazza. Az elkészítéshez a gyöngyöket 2 0,5%–os BSA-PBS-sel mossuk, majd a gyöngy-antitesteket 0,5%–os BSA-PBS-sel inkubáltuk legalább 1 órán át rotátoron (4 c). Mosás 2 db 0-val.5% BSA-PBS–t, majd hígító pufferben reszuszpendáljuk (1% Triton, 2 mM EDTA, 150 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl (pH 7,4), 1 ~ proteáz inhibitor). Kettős térhálósítás chiphez: a táptalajt a sejtekből 10 cm-es lemezeken dekantáltuk, egyszer röviden mossuk PBS-sel (RT). Diszukcinimidil-glutarát (Pierce Cat # 20593) (DMSO-ban hígítva 200 mM-en)/PBS-t (RT) használtunk 10 percig. Ezután formaldehidet adunk 1% – os végső koncentrációhoz további 10 percig. A reakciót jégen 1:10 1 M Tris pH 7,4 értékkel leállítottuk. A sejteket összegyűjtöttük, és kétszer mossuk hideg PBS-sel, 1000 ft-on forogva 5 percig. Magok izolálása és szonikálása: Reszuszpendálja a sejtpelleteket 1 mL magszigetelő pufferben (50 mM Tris–pH 8,0, 60 mM KCl, 0,5% NP40) + PI és inkubáljuk jégen 10 percig. Centrifugáljunk 2000 g-t 3 percig 4 CAC-on. Reszuszpendáljuk a magokat 200 oc friss lízis pufferben (0,5% SDS, 10 mM EDTA, 0,5 mM EGTA, 50 mM trisz–HCl (pH 8)) + PI. Szonikálás: a magokat ezután szonikáltuk (10 millió sejt) 25 percig Biorupterben (beállítások = 30 s = be, 30 s = ki, közepes) vékony falú csövekkel (Diagenode Cat# C30010010). Után szonikálás spin max sebesség 10 min 4 db C. chip beállítása: Az ultrahanggal kezelt DNS-t 5 db 600 hígító pufferrel hígítottuk (1% Triton, 2 mM EDTA, 150 mM NaCl, 20 mM Tris–HCl (pH 7,4), 1 db proteáz inhibitor). A bemeneti mintákhoz egy alikvot kerül eltávolításra (5%). A minták a 4.számú C. helyen forognak. Mosás: a chipet 1 db–os tse I-vel mossuk (20 mM–es Tris-HCl pH 7,4, 150 mM NaCl, 0,1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA), 2 db-os tse III-mal (10 mM-es Tris-HCl pH 7,4, 250 mM LiCl, 1% IGEPAL, 1% dezoxikolát, 1 mM EDTA), 1 db-os te + 0,1% Triton X-100, átvisszük az új csőbe, majd mosson egy másik alkalommal te + 0,1% Triton X-100-mal. Elúció: Eluáljuk 200 6L elúciós pufferrel (1% SDS, 10 mM Tris pH 7,5) 20 percig RT-n, rázva az örvényen vagy egy nutátoron vagy forgatón. De-térhálósítás: adjunk hozzá 10 ml 5 M NaCl-t, és inkubáljuk 65 (vagy legalább 8 h) C hőmérsékleten. Tisztítsa meg a mintákat a Zymo ChIP DNS Clean és Concentrator használatával. Elute 100 6L-ben. Vegyünk 40 6L-t, és folytassuk a könyvtár előkészítési protokollt.

PolyA RNS izolálás és fragmentáció

RNS izolálás: az RNS-t trizol-reagenssel (Ambion cat# 15596018) és DIRECT-ZOL RNS mini-prep kit (cat# 11-330mb) izoláltuk. Poli-A RNS izolálás: 0 használata.2 teljes RNS mint kiindulási anyag az ideális leképezési hatékonyság és a minimális klonalitás érdekében. RNS-mintánként gyűjtsünk össze 10 db 6L oligo (dT) (NEB cat# S1419S) gyöngyöt. A gyöngyöket kétszer mossuk 1 db dtbb-vel (20 mM–es Tris-HCl pH 7,5, 1 M LiCl, 2 mM EDTA, 1% LDS, 0,1% Triton X-100). A gyöngyöket reszuszpendáltuk 50-ben, 2-ben, dtbb-ben. 50 dB 65 db C-ra melegített gyöngyöt 50 dB 65 db-os RNS-sel kevertünk 2 percig. Az RNS-gyöngyöket ezután 10 percig inkubáltuk RT-n forgatás közben. Az RNS-gyöngyöket ezután egy mágnesre gyűjtöttük, és egyenként 1 db-ot mostunk RNS WB1-gyel (10 mM Tris–HCl pH 7,5, 0,12 m LiCl, 1 mM EDTA, 0,1% LDS, 0.1% Triton X-100) és WB3 (10 mM Tris–HCl pH 7,5, 0,5 M LiCl, 1 mM EDTA). Adjunk hozzá 50 6L trisz-HCl pH-t 7,5-re, és melegítsük 80 oc-ra 2 percig, hogy eluáljunk. Gyűjtsük össze az RNS-t, és hajtsunk végre egy második Oligo-dT gyöngygyűjtést. Mosás után a második gyűjtemény, ahelyett, hogy eluáló volt 1 6db, 1 db első szál puffer; 250 mM Tris-HCl (pH 8,3), 375 mM KCl, 15 mM MgCL2 (ThermoFisher SSIII kit Cat # 18080093). Fragmentáció: Ezután adjunk hozzá 10 db 2 db első szálú puffert plusz 10 mM DTT-t és fragmentált DNS-t 94 db C-on 9 percig. Gyűjtsük össze a gyöngyöket a mágnesen, és helyezzük át a fragmentált mRNS-t tartalmazó eluátumot egy új PCR-szalagra. Vissza kell állítania 10 ~ ~ l fragmentált RNS-t. Első szál szintézise: kevert töredezett RNS 0,5 µL random primer (3 µg/µL) Élet Tech #48190-011, a 0,5 µL oligo-dT (50 µM-től SSIII kit), 1 µL dNTPs (10 mM Élet Tech, macska 18427088) 0,5 µL SUPERase-A (ThermoFisher Macska#AM2696), illetve a hő-50 °C 1 min. Azonnal helyezze jégre. Akkor ki 5.8 µL ddH2O, 0.1 µL actinomycin (2 µg/µL Sigma macska#A1410), 1 µL DTT (100 mM Élet Tech macska# P2325), 0.2 µL 1% Tween, 0,5 µL felső indexben III. inkubáljuk 25 °C-on 10 percig, majd 50 °C-50 perc. Gyöngy Tisztítás: Hozzáadtunk 36 ml rnaclean XP-t (Ampure XP), majd összekeverjük, 15 percig inkubáljuk a jégen. A gyöngyöket ezután egy mágnesre gyűjtöttük, és 2 db-ot 75% – os etanollal mostunk. A gyöngyöket ezután 10 percig levegőn szárítottuk, majd 10 6L nukleázmentes H2O-val eluáltuk. második szál szintézis. 10 µL cdns/RNS vegyes volt, 1,5 µL 10× Kék Puffer (Enzymatics macska# B0110L), 1 µL dUTP/dNTP mix (10 mM Affymetrix macska# 77330), 0.1 µL dUTP (100 mM Affymetrix macska# 77206), 0.2 µL rnáz H-nak (5 U/µL Enzymatics macska# Y9220L), 1 µL DNS-polimeráz I (10 U/µL Enzymatics macska#P7050L), 0.15 µL 1% Tween-20-1.05 6L nukleázmentes víz. A reakciót 16 6.5 órán át inkubáltuk. Gyöngytisztítás: a DNS-t úgy tisztítottuk, hogy reakciónként 1 db 6515-2105-050250 EDAC SpeedBeads-t (Thermo 6515-2105-050250) adtunk hozzá 28 db 20% – os peg8000/2.5 M NaCl-t (13% – os végkoncentráció), majd RT-n inkubáltuk 10 percig. A gyöngyöket ezután egy mágnesre gyűjtöttük, majd 2 db 60% – os etanollal mossuk. A gyöngyöket 10 percen át levegőn szárítottuk, majd 40 ml nukleázmentes vízben eluáltuk. A DNS készen áll a könyvtár előkészítésére.

Könyvtár prep protokoll

dsDNS végjavítás: 40 6L DNS-t kevertünk a ChIP vagy RNS protokollokból 2,9 H2O, 0-val.5 µL 1% Tween-20, 5 µL 10× T4 ligase puffer (Enzymatics macska# L6030-MD-L), 1 µL dNTP mix (10 mM Affymetrix 77119), 0.3 µL T4 DNS pol (Enzymatics P7080L), 0.3 µL T4 PNK (Enzymatics Y9040L), 0.06 µL Klenow (Enzymatics P7060L), majd inkubáljuk 30 percig 20 °C-on 1 µL Seradyn 3 EDAC SpeedBeads (Thermo 6515-2105-050250) a 93 µL 20% PEG8000/2,5 M NaCl (13% – os végleges) volt hozzá, majd a lappangási idő 10 perc. Gyöngy Tisztítás: gyöngyöket gyűjtöttünk egy mágnes és mosott 2 60% – os etanollal. A gyöngyöket 10 percig levegőn szárítottuk, majd 15 6L ddh2o. dA-Tailing-ben eluáltuk. A DNS-t 10-el keverték.8 µL ddH2O, 0.3 µL 1% Tween-20, 3 µL Kék Puffer (Enzymatics macska# B0110L), 0.6 µL dATP (10 mM-Tech 10216-018), 0.3 µL Klenow 3-5 Exo (Enzymatics P7010-LC-L), majd inkubáljuk 30 percig 37 °C-55.8 µL 20% PEG8000/2,5 M NaCl (13% – os végleges) volt, ki egy lappangási idő 10 perc. Ezután a gyöngy megtisztítása megtörtént. A gyöngyöket eluáltuk 14 6L. Y-alakú adapter lekötésével. A mintát 0,5 ml bioo vonalkód adapterrel (BIOO Scientific cat# 514104), 15 ml gyors lekötési pufferrel (Enzymatics cat@ L603-LC-L), 0,33 ml 1% Tween-20 és 0.5 6L T4 DNS-ligáz HC (Enzimatika L6030-HC-L) és inkubáljuk 15 percig RT. 7 60% – os 6000/2,5 M NaCl-t adunk hozzá, és inkubáljuk 10 percig RT. Gyöngy tisztítást végeztünk, és a gyöngyöket eluáltuk 21 6L-ben. Ezután 10 6CL-t használtak PCR amplifikációhoz (14 ciklus) IGA és IGB primerekkel (AATGATACGGCGACCACCGA, CAAGCAGAAGACGGCATACGA).

GRO-seq

a születő transzkripciót globális nukleáris futási szekvenálással (GRO-seq) rögzítettük. A magokat a tgem–ekből izoláltuk hipotóniás lízissel (10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 2 mM MgCl2, 3 mM CaCl2; 0.1% IGEPAL CA-630) és gyorsfagyasztás Gro-fagyasztó pufferben (50 mM Tris–HCl (pH 7,8), 5 mM MgCL2, 40% glicerin). Futás. 3-5 db 106 db BMDM magot futtattunk BrUTP-vel jelölt NTP-kkel 3 db nro pufferrel (15 mM Tris–Cl (pH 8,0), 7,5 mM MgCl2, 1,5 mM DTT, 450 mM KCl, 0,3 U/6L Szuperáz In, 1,5% Sarkosyl, 366 db ATP, GTP (Roche), Br-UTP (Sigma 40 Aldrich) és 1,2 db CTP (Roche, a korlátozás érdekében run-on hossza ~40 nukleotidok)). A reakciókat 5 perc elteltével leállítottuk 500 ml trizol LS reagens (Invitrogén) hozzáadásával, 5 percig vortexeltük, majd a gyártó által leírt módon kivontuk és kicsaptuk az RNS-t. Az RNS-pelleteket reszuszpendáltuk 18 6L ddh2o + 0,05%–os Tween-ben (dH2O + T) és 2 ml fragmentációs keverékben (100 mMZnCL2, 10 mM Tris-HCl (pH 7,5)), majd 70 oc-n inkubáltuk 15 percig. A fragmentációt 2,5 600 mm-es EDTA hozzáadásával állítottuk le. BrdU dúsítás. A BrdU dúsítást BrdU antitest (IIB5) és AC gyöngyök (Santa Cruz, sc-32323 AC, lot #A0215 és #C1716) alkalmazásával végeztük. A gyöngyöket egyszer Gro-kötő pufferrel mossuk (0,25 db sóoldat-nátrium-foszfát-EDTA puffer (SSPE), 0,05% (térfogat/térfogat) Tween, 37,5 mM NaCl, 1 mM EDTA) + 300 mM NaCl, majd három mosás GRO-kötő pufferben, majd 25% (térfogat/térfogat) szuszpenzióként reszuszpendáljuk 0,1 U/ml Szuperáz-in-rel. A fragmentált RNS-hez 50 MHz-es hideg GRO kötő puffert és 40 ml ekvilibrált BrdU antitest gyöngyöt adtunk, és a mintákat lassan forgattuk 4 ~ C hőmérsékleten 80 percig. A gyöngyöket ezt követően 1000 g-on 15 másodpercig leforgatták, a felülúszót eltávolították, a gyöngyöket pedig egy Millipore Ultrafree MC oszlopba (UFC30HVNB; Millipore) – ban 2 ~ 200 ~ ~ l Gro kötő puffer. Az IP-reakciót kétszer mossuk 400 ml Gro kötő pufferrel, mielőtt az RNS-t inkubálással eluáljuk 200 ml trizol LS-ben (ThermoFisher), enyhe keverés mellett 3 percig. Az elúciót másodszor is megismételtük, 120 db dh2o + T hozzáadásával növeltük a felülúszót, majd a gyártó által leírtak szerint kivontuk. End repair and decapping: a end-repair and decapping, RNS pellet feloldjuk 8 ons (10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 1 mM EDTA, 0,05% Tween 20) erőteljes vortexing, melegítjük 70 Kb 2 percig, majd helyezzük jégre. Miután egy gyors körre, 22 µL Javítás master mix (3 µL 10× PNK puffer, 15.5 µL dH2O + T, a 0,5 µL SUPERase-A RNase Gátló (10, U), 2 µL PNK (20 TÍPUSÚ), 1 µL RppH (5U -)) volt hozzá, vegyes keresztül, 37 °C, 1 h. Hogy phosphorylate az 5’end, a 0,5 µL 100 mM ATP ezt követően ki a reakciók voltak keltetett még 45 perc, 37 °C-on (a magas az ATP koncentráció oltja RppH tevékenység). A végső javítást követően 2,5 60 mm-es EDTA-t adtunk hozzá, a reakciókat összekevertük, majd 70 0CC-ra melegítettük 2 percig, mielőtt jégre helyeztük. A második BrdU dúsítást a fentiek szerint végeztük. Az RNS-pelleteket feloldottuk 2,75 USD tet + 0,25 USD Illumina TruSeq 3 ‘ adapterben (10 USD), 70 USD C-ra melegítettük 2 percig, majd jégre helyeztük. 7 3’master mix (4.75 µL 50% PEG8000, 1 µL 10× T4 RNS ligase puffer, 0.25 µL SUPERase-A, 1 µL T4 RNS Ligase 2 csonka (200U; NEB)) hozzáadva, jól elkeverni, majd a reakciók inkubálják 20 °C, 1 h. Reakciók voltak hígított hozzáadásával 10 µL TET + 2 µL 50 mM EDTA, fűtött 70 °C-on 2 perc, jegelt a harmadik kör BrUTP gazdagodás végezték. Az RNS-pelleteket a 75% – os etanolos mosás során PCR-csíkokra helyeztük át, majd szárítottuk. A mintákat 4 db (10 mM–es trisz-HCl (pH 7,5), 0,1 mM-es EDTA, 0,05% – os Tween 20) + 1 db (10 db) inverz transzkripciós (RT) primerben oldottuk fel. Az RTprimer lágyításához az elegyet inkubáltuk 75 CAC-on 5 percig, 37 CAC-on 15 percig és 25 CAC-on 10 percig. Hogy folytassuk az 5’ Illumina TruSeq adapter, 10 µL 5’master mix (1.5 µL dH2O + 0,2% – os Tween 20, 0.25 µL denaturated 5’TruSeq adapter (10 µM), 1.5 µL 10× T4 RNS ligase puffer, 0.25 µL SUPERase-A, azaz 0,2 µL 10 mM ATP, 5.8 µL 50% PEG8000, a 0,5 µL T4 RNS ligase 1 (5U; NEB)) volt hozzá, majd a reakciók voltak inkubálják 25 °C, 1 h. Reverz transzkripció volt elvégezni Protoscript II. (NEB) (4 µL 5× NEB FirstStrand puffer (NEB; E7421AA), 0.25 µL SUPERase-A, 0.75 µL Protoscript II. (150U; NEB)) 50 °C-on 1 h. Hozzáadása után 30 µL PCR master mix (25 µL 2× LongAmp Taq 2× Master Mix (NEB), 0.2 µL 100 µM előre alapozó, 2.8 µL 5 M betain, 2 µL 10 µM egyedi vonalkódok alapozó), keverékek voltak, erősített (95 °C-on 3 perc, (95 °C, 60 s, 62 °C-on 30 s, 72 °C-on 15 s) x13, 72 °C-on 3 perc). A PCR reakciókat 1,5 térfogat SpeedBeads (GE Healthcare) alkalmazásával tisztítottuk meg 2,5 M NaCl/20% PEG8000-ben. A könyvtárak mérete kiválasztott oldal / TBE gélek 160-225 bázis pár. A gélszeleteket egy 0,5 mL-es perforált PCR-csövön keresztül forgatva aprítottuk fel, amelyet egy 1,5 mL-es cső tetejére helyeztünk. 150 ml Eb gélt (0,1% LDS, 1 M LiCl, 10 mM Tris–HCl (pH 7,8)) adtunk hozzá, majd a szuszpenziót egy éjszakán át tartó keverés közben inkubáltuk. Az eluált DNS tisztításához 700 ml zymogen ChIP DNS kötő puffert adtunk az 1,5 mL-es csőbe, amely az aprított gélszeletet és az Eb gélt tartalmazta, pipettázással összekeverve, majd a zimominielute oszlopba átvitt szuszpenziót. A mintákat először 1000 ft-on forgattuk 3 percig, majd 10 000 Ft-on 30 másodpercig. Az átfolyást eltávolítottuk, és a mintákat 200 6L zymo Washbufferrel (EtOH-val) mostuk. A gélmaradványokat pöccintéssel távolítottuk el, az oszlopokat pedig további 200 ml zymo WashBuffer hozzáadásával mossuk (EtOH-val). Az átfolyást eltávolítottuk, az oszlopokat centrifugálással 14 000 g-on 1 percig szárítottuk, a DNS–t pedig 20 6 liter előmelegített szekvenáló TET (10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 0,1 mM EDTA, 0,05% Tween 20) hozzáadásával eluáltuk. A könyvtárakat szekvenálták.

Western blot

sejteket Lizáltunk Igepal lízis pufferrel (50 mM Tris pH 8,0, 150 mM NaCl, 0.5% Igepal) és a fehérje koncentrációját biorad protein assay reagenssel határoztuk meg, standardként BSA-t használva. A fehérjéket NuPage 4-12% bisz–trisz gradiens géleken (Invitrogén) szétválasztottuk, és nitrocellulóz membránra (Amersham) vittük át. A membránokat TBS-ben blokkolták 0,1% Tween-20 és 5% BSA-val. A membránokat a jelzett primer egy éjszakán át blotoltuk 4-nél C. torma peroxidáz-konjugált szekunder antitesteket detektáltunk ECL plusz western blot detektáló rendszer (Amersham).

állatok és sejttenyészet

a Tgem-eket az injekció beadása után 3 nappal hím 8 hetes C57Bl/6J vagy BALB / cJ egerekből gyűjtötték össze, és DMEM–ben plusz 10% FBS-ben és 1 ~ penicillin-sztreptomicinben 20 db 106 sejt / 15 cm-es Petri-csészében vonták be. A bevonás után egy nappal a sejteket friss táptalajjal kiegészítettük, PBS-sel (Veh) vagy 100 ng/mL KLA-val kezeltük 1 órán keresztül, majd közvetlenül a downstream elemzésekhez használtuk. az iBMDM-et a BMDM MYC-t és Braf V600E66-ot tartalmazó retrovírussal való fertőzésével állítják elő. Az immortalizált sejteket ezután több hét alatt kinövik. Minden állatkísérletet a Kaliforniai Egyetem, a San Diego intézményi éves gondozási és Felhasználási Bizottsága (IUCAC) által meghatározott etikai normáknak megfelelően végeztek.

Lentivirus termelés

a pLentiguide-ot úgy módosították, hogy tartalmazzon egy U6-bsmbi-spgRNA állványt és egy CMV promótert, amely a tagBFP2-t hajtja. Minden célponthoz 2 CRISPR-vezetőt illesztettünk be PCR-amplifikáció útján a H1 promóterrel (bsmbi hely/guide1/állvány/H1 promóter/2 útmutató/bsmb1 hely) összesen 2 vezetővel vírusonként (U6 és H1 által vezérelt) (4.Kiegészítő táblázat). A vírus pVSVg / ppAX2 rendszerrel készült. Két nappal a transzfekciót követően a táptalajt összegyűjtöttük és centrifugáltuk 4 6c6 órán át 2 órán át, 20 000 g-on. a Sejtpelletet egy éjszakán át 4 oc-n rekonstruáltuk OPTI-MEM-ben, és -80 oc-on tároltuk.

CRISPR KO ibmdm-ek előállítása

KO ibmdm-ek előállítása lentivirális fertőzéssel történt. az iBMDM-CAS9-IRES-EGFP-t MOI 100-mal fertőztük meg, 293T sejten mérve, Lentiblast-tal (OZ biosciences) (minden reagens 5 db / ml) OPTI-MEM-ben. Ezt ezután 1300 g-on 1 órán át szobahőmérsékleten centrifugáltuk. A táptalajt ezután eltávolítottuk, és a sejteket csontvelő táptalajban (30% L-sejt, 20% FBS, 1% penicillin/sztreptomicin DMEM-ben) 2 napig kiegészítettük. A sejteket ezután a vírusszekvencián lévő transzgén expressziójával (tagBFP2) válogattuk fertőzésre.

jelentés összefoglaló

a kísérleti tervezéssel kapcsolatos további információk a cikkhez kapcsolódó Nature Research Reporting Summary-ban találhatók.

Kód elérhetősége