Se si dispone di tempo sufficiente e di un ambiente privo di vibrazioni, è possibile attendere pazientemente e la forza di gravità porterebbe la maggior parte delle particelle sospese sul fondo di una provetta da centrifuga. Le particelle più piccole probabilmente rimarrebbero in sospensione a causa del moto browniano e la maggior parte delle macromolecole sarebbero distribuite uniformemente perché sarebbero in soluzione piuttosto che in sospensione. Non ti conosco, ma non ho il tipo di pazienza necessaria per poter contare esclusivamente sulla gravità per la separazione dei componenti solidi da quelli liquidi. Inoltre, per scopi pratici, il pellet ottenuto sarebbe troppo facilmente interrotto per un’efficace separazione del materiale solido dal surnatante. La gravità non sarebbe un modo terribilmente efficace di separare i materiali sospesi in base alle dimensioni o ad altre caratteristiche.
Descrizione delle condizioni di centrifugazione
Quando si descrive una centrifugazione eseguita in materiali e metodi, raramente è necessario riportare più della forza, del tempo e della temperatura della centrifugazione. La velocità richiesta (rpm) dipende dalla centrifuga e dal rotore utilizzati, che variano da un laboratorio all’altro. Quindi è raramente rilevante riportare la marca della centrifuga, il tipo di rotore o la velocità.
Il processo di centrifugazione
La centrifugazione produce una forza centripeta che può essere molte centinaia o migliaia di volte la forza di gravità, accelerando così notevolmente il processo. Maggiore è il numero di giri al minuto (RPM), maggiore è la forza di gravità. L’utilità della centrifugazione nel frazionamento cellulare sarebbe limitata se tutto ciò che potremmo fare fosse guidare le particelle sospese sul fondo di un tubo. Tuttavia, i ricercatori sono in grado di controllare la dimensione delle particelle che vengono abbattute, grazie alla fisica delle particelle in sospensione.
In una sospensione di particelle rotonde di uguale densità ma di diametri diversi, la forza che spinge una determinata particella verso il basso è uguale alla sua massa per l’accelerazione applicata. Il volume della particella è una funzione del suo raggio e la sua massa è uguale al suo volume per il suo coefficiente di densità, che è una costante. Il volume di una sfera è uguale a 4/3 volte pi (una costante) volte il cubo del raggio. Per una sospensione di particelle sferiche di uguale densità in un insieme specifico di condizioni, l’unica variabile che determina la forza su una determinata particella è il suo raggio.
La resistenza al movimento attraverso una soluzione è proporzionale a quella parte della superficie che spinge attraverso il mezzo. Per particelle di forma simile, le particelle più piccole incontrano meno resistenza di quelle più grandi. Poiché la superficie di una sfera è 4 volte pi per il quadrato del raggio e 4 volte pi è una costante, quindi per particelle sferiche di uguale composizione, l’unica variabile che determina la resistenza in un dato insieme di condizioni è il raggio della particella.
La forza motrice aumenta proporzionalmente al cubo del raggio. La resistenza al movimento aumenta proporzionalmente al quadrato del raggio. Non è difficile vedere che, come il raggio di una particella aumenta, la sua tendenza ad avvicinarsi al fondo aumenta pure. Aggiungi una quantità significativa di “trascinamento” e l’esperimento di gravità che è stato attribuito a Galileo non funziona così bene, dopo tutto. Poiché le particelle più grandi si sedimentano più rapidamente delle piccole particelle, un investigatore può separare grandi da piccoli organelli, cellule, ecc. semplicemente controllando il tempo e il numero di giri di una centrifuga.
Frazionamento mediante centrifugazione differenziale
Per un tipico omogeneizzato cellulare, a 10 min. spin a bassa velocità (400-500 x g) produce un pellet costituito da tessuto ininterrotto, cellule intere, nuclei cellulari e detriti di grandi dimensioni. Il pellet a bassa velocità è tradizionalmente chiamato pellet nucleare. A 10 min. spin ad una velocità moderatamente veloce, producendo forze di 10.000 a 20.000 x g riduce i mitocondri insieme ai lisosomi e ai perossisomi. Pertanto il secondo pellet nel tradizionale schema di frazionamento cellulare è chiamato pellet mitocondriale.
Un ulteriore frazionamento cellulare mediante centrifugazione differenziale richiede l’uso di un ultracentrifugo. Tale strumento è progettato per far girare i rotori ad alte velocità angolari, per generare forze g molto elevate. L’aria deve essere pompata fuori dalla camera per evitare l’accumulo di calore dovuto all’attrito dell’aria. In effetti, molti rotori progettati per un ultracentrifugo non sono nemmeno costruiti aerodinamicamente, poiché sono filati nel vuoto. Una corsa ultracentrifuga ad alta velocità di un’ora che genera una forza dell’ordine di 80.000 x g produce un pellet microsomiale. I microsomi includono frammenti di membrana, tra cui membrana cellulare e reticolo endoplasmatico. I frammenti di membrana formano vescicole quando vengono interrotti in un mezzo acquoso, quindi l’esame rivelerebbe numerose vescicole di membrana di varie dimensioni. Le vescicole stesse possono essere separate sulla base della densità, a causa del diverso contenuto proteico. Ma questo è un argomento per un altro documento.
Girare per diverse ore a 150.000 x g o giù di lì, e si può abbattere ribosomi e anche la più grande delle macromolecole. Il surnatante che rimane è costituito da componenti solubili del citoplasma, inclusi sali, piccole macromolecole e molecole precursori e gas disciolti.