I RNasi sono come i super-eroi cattivi tra gli enzimi di laboratorio. Sono onnipotenti, distruttivi e apparentemente indistruttibili.
Questo perché sono stati creati da signori malvagi, al solo scopo di rendere la vita difficile per gli scienziati coraggiosi che combattono ogni giorno per produrre alta qualità, prep RNA intatti.
Ok, sto scherzando sulla parte overlords. Ma perché gli RNasi hanno tutti quei superpoteri comunque? E cosa puoi fare per sconfiggerli? Scopriamolo.
I superpoteri degli RNasi, spiegati.
Gli RNasi sono onnipotenti
Questo è vero. Le rnasi si trovano in tutti i tipi di cellule e organismi dai procarioti agli eucarioti. cioè sono ovunque. Questo è uno dei motivi principali per cui sono un tale problema in laboratorio. Stanno fluttuando nell’aria, su ogni superficie del tuo corpo. Il che significa che contaminano tutto ciò che l’aria, o qualsiasi superficie del tuo corpo ha toccato. Che è fondamentalmente tutto. Inoltre, RNase A in particolare assorbe molto fortemente al vetro, rendendo ancora più difficile rimuoverlo dalle bottiglie ecc.
Le RNASI sono altamente distruttive
Le RNasi hanno generalmente un’attività specifica molto elevata verso il loro substrato (RNA). Ciò significa che la più piccola quantità di RNasi può facilmente strappare attraverso il vostro prezioso RNA prep. Per inciso, questo è anche uno dei motivi per cui una RNasi (RNasi A) è stato il primo enzima ad avere il suo meccanismo di catalisi dedotto (Findlay et al 1962).
i RNasi sono apparentemente indistruttibili
Mostrano un recupero simile a una fenice dopo l’autoclave
La saggezza convenziale dice che se si autoclavano i RNasi, denaturano, ma poi rinaturano e riprendono la funzione parziale dopo il raffreddamento. Questa incredibile e leggendaria fortezza è abilitata da una serie di legami disolfuro intramolecolari che mantengono intatta la struttura, anche dopo che i legami idrogeno che normalmente mantengono la struttura proteica 3D in posizione sono rotti. Come tutte le favole, questo è vero in una certa misura. Ma continua a leggere e scopriremo che questo particolare super-potere è stato pubblicizzato dagli spin doctors di RNase Baddies Inc.
Anche EDTA non può fermarli!
A differenza di altre nucleasi, molte RNasi non richiedono ioni metallici per la catalisi poiché usano il gruppo idrossile 2-prime del substrato dell’RNA come specie reattiva, quindi semplicemente aggiungendo TE non li inibisce, come farebbe per le nucleasi che sgranocchiano il DNA.
Come sconfiggere il male RNases
Non ti preoccupare, collega scienziato. RNases possono essere nemici formidabili, ma hanno debolezze che possiamo sfruttare.
Calciarli in H
RNases si basano su residui di istidina nel loro sito attivo per la catalisi. Quindi il dietil pirocarbonato (DEPC), che è un agente alchilante specifico per l’istidina, può inattivarli. L’autoclave rimuoverà quindi il DEPC per impedirgli di alcalivare qualsiasi altra proteina in voi o nei vostri campioni.
L’autoclave funziona, in una misura
La tanto leggendaria indistruttibilità degli RNASI di fronte all’autoclave è vera al centro, ma anche molto esagerata, come ho detto sopra. Un piccolo studio di Ambion ha dimostrato che gli RNasi (o almeno RNasi A) non sono completamente resistenti all’autoclave. Piuttosto la loro attività è decimata da autoclave, ma una piccola parte dell’attività di RNase rimane dopo autoclave.
Ma se naturalmente una piccola quantità di RNasi ha ancora un sacco di RNA sgranocchiare potenza. Ciò significa che l’autoclave di routine come parte delle procedure di decontaminazione RNase è certamente utile – è solo che non si può fare affidamento su di esso per rimuovere tutta l’attività.
Non sopportano il calore (secco)
Mentre il calore umido (autoclave) distrugge parzialmente gli RNasi, non c’è speranza che resistano al calore secco. Il calore secco ossida le RNASI-qualsiasi altra proteina, non importa quanto siano robuste. Quindi, per pulire la tua vetreria, un paio d’ore a 180 degC dovrebbe farlo.
Guerra chimica
Per la pulizia delle superfici, gli RNASI, per quanto robusti, non sopportano cose come perossido di idrogeno, acidi/basi forti, Trizolo ecc. Questi sono tutti comunemente usati per sbarazzarsi anche dei RNasi più difficili.
Kryptonite per RNasi: Inibitori
Forse la migliore arma che abbiamo nella nostra armeria contro gli RNasi sono gli inibitori della RNasi. Più comunemente, gli inibitori della RNasi commerciali sono versioni dell’inibitore della ribonucleasi placentare (RI). Come qualcuno che trascorre un anno cercando di perfezionare le ibridazioni di RNA in situ senza l’aiuto di un inibitore della RNasi (a causa di una falsa economia del mio capo!), so quanto sia buona questa Kryptonite RNase. Un microlitro di RI e improvvisamente i miei esperimenti hanno iniziato a funzionare.
Dico che questa è l’arma migliore nella nostra armeria contro gli RNasi perché a differenza di tutte le altre soluzioni sopra elencate, gli inibitori delle RNasi sono specifici, quindi puoi (generalmente) metterli proprio dove conta nel tuo flusso di lavoro e ottenere la protezione di cui hai bisogno dai malvagi. NON essere senza questa roba se stai lavorando con l’RNA.
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