l’α-hémolysine d’Escherichia coli utilise une amplification endogène par l’activation du récepteur P2X pour induire l’hémolyse

Résultats

L’hémolyse induite par HlyA Nécessite l’activation des récepteurs purinergiques.

Le surnageant de la souche ARD6 d’E. coli productrice d’α-hémolysine (HlyA) lyse les érythrocytes équins, humains et murins (Fig. 1). La figure 1 montre l’hémolyse induite par HlyA en fonction du temps. Des expériences en accéléré avec des érythrocytes murins et humains attachés à des lamelles de couverture ont révélé que l’hémolyse induite par l’HlyA est un processus séquentiel. Dans les 20 premières minutes, HlyA a induit une crénation des globules rouges à la suite d’un rétrécissement cellulaire, suivie d’une augmentation progressive du volume et enfin d’une lyse des cellules (Fig. 1A et 1B, Film S1). Ce retrait et ce gonflement séquentiels s’appliquent également au niveau unicellulaire. Ainsi, ce ne sont pas différentes populations de globules rouges qui rétrécissent ou gonflent, mais plutôt qu’un seul érythrocyte se rétrécit d’abord puis gonfle à la suite de l’application de HlyA. La suspension érythrocytaire (1,25%) a été incubée avec du surnageant dilué d’E. coli (50 µl.ml−1). Les érythrocytes des trois espèces testées ont montré une différence marquée dans la réactivité à HlyA (Fig. 1C) avec la plus faible sensibilité à HlyA dans les érythrocytes humains. Dans toutes les expériences suivantes, la quantité de surnageant d’E. coli ajoutée a été ajustée pour produire une hémolyse ≈50% après 60 minutes d’incubation.

Nous utilisons généralement un surnageant filtré d’E. coli (ARD6) pour induire l’hémolyse, sauf indication contraire. Cette approche a été choisie pour s’assurer que nos résultats s’appliqueraient également in vivo lorsque le HlyA est libéré par E. coli avec divers autres composants. Lors du choix de cette approche, nous avons cependant dû vérifier que l’hémolyse induite par E. coli produisant des HlyA pouvait en fait être attribuée à HlyA. Par conséquent, nous avons purifié HlyA de notre culture ARD6. Après purification, une suspension du HlyA purifié a été séparée sur un gel de dodécylsulfate de sodium (SDS) à 5-15%. Une seule bande de 100 kDa est apparue après la coloration de Coomassie R, et la spectroscopie de masse a identifié la bande comme HlyA (Fig. S1 A et B). Comme témoin supplémentaire, nous avons utilisé le surnageant de la souche d’E. coli D2103, une souche de laboratoire non pathologique d’E. coli qui ne produit pas de HlyA. Le surnageant de ces bactéries n’a pas induit d’hémolyse dans les érythrocytes humains, murins ou équins (Fig. S1D). De plus, nous avons comparé nos résultats à HlyA gentiment fourni par le Prof. Sucharit Bhakdi, Université de Mayence, Allemagne (avec une activité de 10 ng * ml-1 pour une hémolyse ≈50%, Fig. S2). Dans ce qui suit, lorsque l’on parle de HlyA purifié, c’est en référence à cette préparation. Lors de nos premiers tests de l’activité biologique de HlyA, nous avons découvert que l’apyrase piégeuse de l’ATP inhibait complètement l’hémolyse induite par HlyA des érythrocytes équins. Cette découverte était vraiment surprenante, car elle impliquait de l’ATP extracellulaire nécessaire à l’hémolyse infligée par E. coli producteur de HlyA. Comme l’ATP extracellulaire est une molécule de signalisation qui active les récepteurs P2, nos résultats pourraient suggérer que le modèle de pores dominant pour l’hémolyse induite par l’HlyA pourrait être une simplification. Par conséquent, nous avons testé l’effet du balayage de l’ATP de manière plus approfondie. Nous avons constaté que l’apyrase inhibait complètement l’hémolyse non seulement des érythrocytes équins, mais aussi des érythrocytes murins et humains (Fig. 2 BIS). De plus, l’hexokinase, qui dégrade rapidement l’adénosine triphosphate (ATP) en adénosine diphosphate (ADP), a également réduit l’hémolyse induite par l’HlyA dans les globules rouges d’origine murine et humaine de manière dépendante de la concentration (Fig. 2B). Cette découverte a été vérifiée par HlyA purifiée (Fig. 2B, encart). Il convient de noter que, dans les érythrocytes humains, l’apyrase et l’hexokinase potentialisaient l’hémolyse induite par HlyA à des concentrations plus faibles. La distinction pourrait suggérer une différence dans le modèle d’expression du récepteur P2 sur les globules rouges entre les espèces.

Pour valider la pertinence de cette découverte, il était important de savoir si les antagonistes des récepteurs P2 influençaient l’hémolyse induite par le HlyA. L’antagoniste du récepteur P2 non sélectif PPADS a diminué de manière dépendante de la concentration de l’hémolyse induite par E. coli producteur de HlyA dans les érythrocytes équins, murins et humains (Fig. 2C). La valeur CE50 pour les PPAD était de 520 µM, 400 µM et 180 µM pour les érythrocytes humains, murins et équins, respectivement. Cette constatation a été corroborée pour l’ensemble de la gamme des concentrations de HlyA (Fig. 2D) testés sur des érythrocytes humains exposés à un HlyA purifié. La relation concentration-réponse était compatible avec l’antagonisme compétitif, et il convient de noter que l’effet des concentrations de toxines même maximales était réduit par le bloqueur des récepteurs P2. Ainsi, l’activation du récepteur P2 semble être impliquée dans l’hémolyse induite par HlyA. L’antagoniste non sélectif des récepteurs P2, la suramine, a également diminué en fonction de la concentration l’hémolyse induite par le HlyA chez les trois espèces (données non présentées). À des concentrations plus élevées, la suramine provoque cependant un rétrécissement dramatique des érythrocytes et peut donc ne pas convenir à l’évaluation de l’implication des récepteurs P2 dans les érythrocytes.

Pour évaluer si l’effet de l’antagoniste purinergique sur l’hémolyse était simplement le résultat d’une osmolalité accrue, nous avons testé l’effet du saccharose extracellulaire sur l’hémolyse induite par le HlyA (données non montrées). Le saccharose (1 mM) n’a que légèrement diminué l’hémolyse (5,1% ± 1,7%), tandis que le saccharose de 10 mM et 75 mM a nettement diminué l’hémolyse (28.5% ± 5.0%, 82.8% ± 5.2%). Étant donné que les concentrations des antagonistes et des ATPases utilisés dans cette étude n’ont jamais dépassé 1 mM, l’effet ne peut être le résultat d’une osmolarité accrue. Nos résultats ne reflétaient pas non plus une liaison non sélective entre les antagonistes et la toxine. Ceci a été testé sur des érythrocytes équins, qui ont été préincubés avec HlyA pendant 10-15 minutes à 37 ° C ou pendant 30 minutes à 4 ° C, soigneusement lavés et remis en suspension avec ou sans les antagonistes. Parce que HlyA est incorporé dans la membrane pendant la préincubation, les érythrocytes ont procédé à la lyse en l’absence de HlyA libre. Figue. S2 montre que diverses interventions pharmacologiques ont réduit l’hémolyse après que HlyA ait été pré-lié aux érythrocytes. Les antagonistes étaient cependant moins efficaces lorsqu’ils étaient ajoutés à des érythrocytes lavés dans lesquels le processus lytique était déjà initié.

Quel(s) Récepteur(s) P2 Est(sont) Impliqué(s) dans l’hémolyse induite par l’HlyA ?

Les érythrocytes expriment différents types de récepteurs P2. Les récepteurs P2 qui ont été rapportés comme étant exprimés dans les érythrocytes humains matures comprennent P2Y1 (14), P2Y2 (15), P2Y13 (15), P2X1 (15) et P2X7 (16), tandis que P2Y1, P2X1, P2X4 et P2X7 semblent être présents dans les cellules progénitrices érythroïdes (17). Pour tester lequel de ces récepteurs purinergiques participe à l’hémolyse induite par HlyA, nous avons abordé les récepteurs en question individuellement. Comme le récepteur P2Y1 est impliqué dans l’hémolyse induite par le sorbitol des érythrocytes humains et murins infectés par le plasmodium (14), nous avons testé si ce récepteur était responsable de l’hémolyse induite par le HlyA. L’antagoniste des récepteurs P2Y1 MRS2179 n’a pas affecté l’hémolyse induite par HlyA (Fig. S3A) à des concentrations (jusqu’à 500 µM) supérieures à ce qui était nécessaire pour inhiber l’hémolyse dans les érythrocytes infectés par Plasmodium berghei (14). Comme il n’y a pas d’antagonistes spécifiques pour les récepteurs P2Y2, nous avons examiné l’effet de HlyA chez les souris transgéniques. L’hémolyse induite par le HlyA était similaire chez les érythrocytes de souris P2Y2−/− et P2Y2+/+ (Fig. S3B). Dans le cas du P2Y13, nous avons testé l’antagoniste MRS2211, qui a montré une certaine sélectivité vis-à-vis du récepteur P2Y13 (18). MRS2211 a diminué de manière significative l’hémolyse induite par le HlyA chez les érythrocytes humains et murins (Fig. S3C). Cette découverte contredit nos résultats avec l’hexokinase (dégradant l’ATP en ADP), qui devrait stimuler plutôt qu’inhiber le récepteur P2Y13 sensible à l’ADP. Par conséquent, l’hexokinase et le MRS2211 devraient donner des résultats opposés si le récepteur P2Y13 est impliqué. Comme ce n’est pas le cas, le récepteur P2Y13 est un candidat peu probable pour le récepteur P2 impliqué dans l’hémolyse induite par HlyA. Nous ne pouvons exclure la possibilité que l’inhibition produite par MRS2211 soit médiée par un autre récepteur P2.

En principe, cela ne laisse que les récepteurs P2X à considérer. Figue. 3A montre que le bloqueur non sélectif des récepteurs P2X Evans blue a fortement réduit l’hémolyse induite par HlyA, suggérant qu’un récepteur P2X est impliqué dans cette hémolyse. Parmi les récepteurs P2X exprimés dans les érythrocytes, nous avons considéré le P2X7 comme le médiateur le plus probable de l’hémolyse induite par HlyA pour les raisons suivantes. Les récepteurs P2X7 sont connus pour subir une transition vers un état de perméabilité plus important, ce qui conduit éventuellement à une lyse dans certaines cellules (12). Il a été rapporté que le récepteur P2X7 interagit avec la protéine de canal pannexin1 (12), et le complexe crée un pore important perméable à des molécules plus grosses telles que le bromure d’éthidium (13). La pannexine1 est exprimée dans les globules rouges humains (19) et a récemment été suggérée comme canal de libération d’ATP dans les érythrocytes (20). Pour tester si les récepteurs P2X7 participent à l’hémolyse induite par le HlyA, nous avons utilisé des antagonistes avec une sélectivité relative pour le P2X7: G Bleu brillant (BBG), ATP-2′, 3′-dialdéhyde (OxATP) et KN-62 (21). Tous les antagonistes diminution dépendante de la concentration de l’hémolyse chez les érythrocytes équins, murins et humains (Fig. 3). Les érythrocytes équins et humains étaient plus sensibles à toutes les substances testées que les érythrocytes murins. Dans ce contexte, il convient de mentionner que le récepteur murin P2X7 est connu pour être moins sensible au KN-62 par rapport au récepteur humain (22). La protection contre l’hémolyse par l’antagonisme des récepteurs P2X a de nouveau été démontrée pour toute la gamme de concentration de HlyA purifiée dans les érythrocytes humains en utilisant BBG comme exemple d’antagoniste P2X7 (Fig. 3D). Encore une fois, l’antagoniste montre un effet substantiel sur l’hémolyse induite par l’HlyA, même sous des concentrations d’HlyA produisant une hémolyse maximale. L’inhibition de l’hémolyse par OxATP a été vérifiée à l’aide de HlyA purifiée dans les érythrocytes murins et humains (Fig. 3E, encart). Le nouvel antagoniste sélectif et compétitif du récepteur P2X7 A438079 a réduit l’hémolyse des érythrocytes humains, mais a été moins efficace dans les érythrocytes murins (Fig. 3F). Les immunoblots de fractions membranaires plasmatiques pour le récepteur P2X7 confirment que les érythrocytes humains et murins expriment une protéine de taille pertinente (66 kDa, Fig. 3G, et en entier sur la Fig. S4B). Il faudra approfondir les recherches pour établir pleinement la contribution relative des récepteurs P2X dans l’hémolyse induite par l’HlyA. Avec nos outils actuels, nous ne pouvons exclure la possibilité de contributions d’autres récepteurs P2X dans l’hémolyse induite par HlyA chez l’une des espèces étudiées.

Fig. S4A montre l’hémolyse induite par HlyA dans les érythrocytes murins (P2X7+/+ et P2X7-/-). Les érythrocytes murins présentent un degré similaire d’hémolyse en réponse à HlyA quel que soit leur génotype. Les souris P2X7−/− et les souris P2X7+/+ ont été générées à l’origine par Pfizer et ont été rétrocroisées en arrière-plan BALB/c. Nous n’avons détecté aucune divergence entre la sensibilité à l’hémolyse induite par HlyA dans les érythrocytes isolés de souris BALB/c et C57BL/6 (données non montrées), même si la souche C57BL/6 est connue pour avoir une variation génétique de l’extrémité C du récepteur P2X7 (23). Ces données sont cohérentes avec l’effet minime de l’A438079 sur les érythrocytes murins et la faible expression protéique du récepteur P2X7 dans les érythrocytes murins (Fig. 3F et 3G).

Ces résultats impliquent qu’il existe au moins un récepteur P2 supplémentaire impliqué dans l’hémolyse induite par HlyA dans les érythrocytes murins. Comme le P2X1 et le P2X7 partagent des profils d’inhibiteur similaires pour BBG, KN-62 et OxATP(24), nous avons testé les antagonistes du P2X1 MRS2159 et NF449. MRS2159 hémolyse inhibée de manière dépendante de la concentration dans les érythrocytes du cheval (CE50: 150 µM) et de la souris (CE50: ≈250 µM). Les érythrocytes humains étaient relativement insensibles à l’antagoniste, mais à une concentration supérieure à 250 µM, nous avons observé une réduction faible et statistiquement significative (Fig. 4 BIS). Cet effet était beaucoup plus prononcé si on utilisait du HlyA purifié (Fig. 4C). Cela implique qu’il pourrait y avoir des différences dans la réponse cellulaire selon qu’ils sont soumis à des HlyA sous forme pure ou en combinaison avec d’autres constituants d’E. coli. La concentration en NF449 inhibe de manière dépendante l’hémolyse induite par le HlyA chez l’homme (Fig. 4B). NF449 était beaucoup moins efficace dans les érythrocytes murins en accord avec le récepteur murin P2X1 étant relativement résistant à cet inhibiteur (25). Il convient de souligner que même si le NF449 est un dérivé de la suramine, il n’a pas provoqué les mêmes changements de volume dans les érythrocytes que la suramine. Les immunoblots du récepteur P2X1 sont connus pour présenter jusqu’à 4 bandes dans divers tissus; une bande non glycosylée de 45 kDa, une bande glycosylée de 60 kDa et une bande de 95/120 kDa qui pourrait être la forme polymérisée du récepteur (26, 27). Dans nos mains, l’anticorps du récepteur P2X1 a systématiquement reconnu une bande de 45 KD et une bande très faible de 60 kDa dans les taches de membranes plasmiques des érythrocytes murins et humains (Fig. 4D). Fait intéressant, nous avons constaté que le niveau d’expression de la bande de 60 kDa était beaucoup plus élevé chez les souris P2X7−/- que chez les témoins (similaire dans trois préparations, Fig. 4D). Dans cet immunoblot, les niveaux de protéines sont ajustés pour éviter une surcharge des bandes des souris P2X7−/−, ce qui laisse la bande de 60 kDa presque indétectable chez les souris P2X7+/+. Cette régulation ascendante apparente du récepteur P2X1 pourrait potentiellement cacher un phénotype hémolytique chez les souris déficientes en récepteur P2X7. Prises ensemble, ces données soutiennent l’hypothèse que les récepteurs P2X1 et P2X7 sont pertinents pour l’hémolyse induite par l’HlyA. Nos résultats indiquent des variations interspécifiques significatives, dans lesquelles le récepteur P2X7 est plus important pour l’hémolyse des érythrocytes humains.

L’hémolyse Induite par l’HlyA Est Empêchée par les Antagonistes de la Pannexine1.

La carbénoxolone (28), la méfloquine et le probénécide (30) ont été utilisés comme antagonistes avec une sélectivité relative pour la pannexine1. La carbénoxolone a considérablement diminué le niveau d’hémolyse chez les trois espèces présentant une sensibilité similaire (Fig. 5 BIS). L’effet de la carbénoxolone a de nouveau été testé pour toute la gamme des concentrations de HlyA (toxine purifiée, Fig. 5B), montrant également des effets importants sous des concentrations maximales de HlyA. La méfloquine et le probénécide ont été testés uniquement sur des érythrocytes murins et humains. La CE50 de la méfloquine était de 25 µM chez l’homme et de 18 µM chez les érythrocytes murins. Le probénécide inhibait l’hémolyse des érythrocytes humains, avec une CE50 de 2 mM, mais était moins efficace dans les érythocytes murins. Récemment, il a été démontré que les antagonistes connus des canaux Cl- NPPB et l’acide niflumique inhibent également les canaux de la pannexine (31). Les deux substances ont réduit l’hémolyse induite par le HlyA, avec un effet nettement plus prononcé sur les érythrocytes humains (Fig. S5).