DISCUSSION
Nos résultats montrent que, grâce à une planification minutieuse, une formation et une normalisation des réactifs et des protocoles, un réseau de laboratoires transnational a la capacité de produire des résultats de tests HAI cohérents et comparables. Les cinq laboratoires de santé publique et universitaires participant à cette étude faisaient partie du RCIRP, qui a été mis au point pour accroître la capacité nationale du Canada à soutenir la recherche sur les vaccins et d’autres types de grippe en cas de pandémie. Dans une situation de pandémie, avec des tests de grippe à volume élevé, à haute pression et dispersés géographiquement, la normalisation du test HAI sera d’une importance primordiale pour assurer la comparabilité des résultats entre les laboratoires. Les laboratoires du PCIRN ont montré un niveau élevé de reproductibilité en laboratoire, avec une précision de 99,8 % des doublons (99.2% à 100% par laboratoire), 97,8% des titres dans une plage de 2 fois sur des jours d’essai répétés (93,3% à 100% par laboratoire) et 91,1% des sérums d’essai présentant une reproductibilité du titre sur chaque répétition du protocole à six essais (60% à 100% par laboratoire). La reproductibilité interlaboratoire était également élevée, avec des titres médians pour toutes les répliques des quatre laboratoires non référencés à moins de 2 fois du laboratoire de référence pour 100 % des sérums testés. Sur une base par laboratoire, les titres de 94,3% et 98.9% des échantillons quantifiés dans une dilution unique des titres de laboratoire de référence et de consensus, respectivement (plages de 85% à 100% et de 95% à 100%). Ces pourcentages respectent les seuils d’acceptabilité typiques pour la variabilité des tests HAI (c.-à-d. qu’au moins 80 % des échantillons se trouvent à moins de 1 dilution des valeurs nominales et/ou des TMG pour tous les tests). La spécificité du test HAI (100 %) et la sensibilité (87,5 % à 100 %) des laboratoires du PCIRN étaient également bien conformes aux critères d’acceptation des études précédentes (c.-à-d., 100% des échantillons négatifs doivent être quantifiés comme étant inférieurs aux niveaux de quantification, et au moins 80% des échantillons positifs doivent être quantifiés comme positifs).
Pour la composante intralaboratoire de la variabilité du test HAI, la répétabilité dans les laboratoires du PCIRN semble similaire à celle démontrée dans d’autres études (5, 22). Une mise en garde de ces études précédentes était que pas plus de trois répétitions ont été examinées, malgré les pratiques courantes de validation des tests immunitaires consistant à examiner six essais répétés ou plus (24-27). En tant que tel, il n’est pas clair si leurs données sont directement comparables aux résultats déterminés sur six essais dans cette étude. Néanmoins, notre constat de 0% à 6,7% (médiane, 0%) d’essais avec des résultats différant de plus de 2 fois de ceux d’autres répétitions d’essais semble comparable aux 4,8% à 7,1% notés précédemment dans un laboratoire (22) et aux 0% à 15% (médiane, 2%) dans neuf laboratoires (5).
Nos résultats de reproductibilité élevée du titre HAI entre les laboratoires PCIRN géographiquement dispersés contrastent avec les rapports précédents montrant une variabilité importante entre les laboratoires internationaux effectuant ce test (5, 6, 9-12). Par exemple, les données d’une vaste étude collaborative (11 laboratoires) ont révélé des VCC par échantillon allant de 84% à 803% (VCC médian par virus de 138%, 155% et 261 %). D’autres études ont rapporté des VCG pour les échantillons de H1N1 et de H5N1 qui s’étendaient de 95 % à 345 % (11) et de 22 % à 582 % (6), et les TMG différaient entre les laboratoires jusqu’à 80 fois (11) ou 128 fois (9). Alors que les rapports précédents incluaient souvent un nombre plus élevé de laboratoires participants que l’étude actuelle, même si seulement six laboratoires ont fourni des données, le VCC interlaboratoires médian était de 83 % pour cinq échantillons de H1N1, 80 % d’entre eux dépassant une différence de 4 fois entre les laboratoires (11). En revanche, l’étude actuelle a montré que la médiane des VCC par virus n’était que de 39% et de 17%, avec 95% des échantillons dans une différence de 4 fois entre les laboratoires. Un échantillon a dépassé la différence de 4 fois; le titre n’était pas quantifiable pour cet échantillon dans un laboratoire, et la valeur la plus basse a donc été attribuée plutôt que mesurée. Si cet échantillon était omis des analyses, la VCC maximale serait de 75,5 %, ce qui représenterait une valeur inférieure à la VCC minimale dans d’autres études. Bien que cet échantillon ait montré une variabilité plus élevée que les autres, cette plage de mesure basse semblait en général moins précise que les plages plus élevées. Par exemple, la VCC variait de 43,4 % à 156,4 % pour des titres compris entre 10 et 80, contre 11,1 % à 53,1 % pour des titres plus élevés (Fig. 3). Une plus grande variabilité avec des échantillons de titres inférieurs a également été décrite précédemment (23) et a probablement contribué à des classifications de séroprotection incongrues dans la présente étude pour les trois échantillons de H1N1 dont les titres se rapprochent le plus du seuil de 40 (titres consensuels de 22, 24 et 43). Malgré cela, la précision diagnostique de la séroprotection dans les laboratoires du PCIRN est restée élevée dans l’ensemble (93,6 % lorsque des titres consensuels ont été utilisés pour définir la séroprotection et 89,5 % par rapport aux valeurs de laboratoire de référence).
Un accord élevé des titres HAI interlaboratoires dans les laboratoires du PCIRN peut être lié à l’harmonisation minutieuse des procédures de dosage et des réactifs du HAI dans l’ensemble du PCIRN. Les participants à des études antérieures qui ont montré une grande variabilité interlaboratoire ont généralement utilisé des méthodes de dosage de l’IHA qui variaient d’un laboratoire à l’autre. Les variables d’analyse considérées comme contribuant à la variabilité des résultats comprenaient la quantité de virus ajoutée, le système de culture virale (p. ex., œufs de poule embryonnés par rapport à la culture tissulaire), la durée du traitement par EMR, la dilution sérique initiale, le type et l’âge des CBR utilisés et le temps de décantation des CBR (5, 11, 12). Étonnamment, cependant, lorsque Wood et al. ils ont fourni aux participants des laboratoires commerciaux et publics participant aux essais de vaccins contre la grippe saisonnière en Europe une procédure opératoire normalisée détaillée à suivre et des réactifs/matériaux communs, ils ont signalé que la variation interlaboratoires n’était pas significativement améliorée (10). Les auteurs ont émis l’hypothèse que des « variations techniques locales » persistantes, ainsi que différents fournisseurs de RBC, auraient pu affecter la reproductibilité entre les laboratoires, mais ils ont noté que la poursuite de la normalisation dépassait les limites de faisabilité de leur étude. Des publications ultérieures ont interprété ces résultats comme indiquant que la normalisation des tests d’IHA entre laboratoires n’est, en général, pas une approche réalisable pour harmoniser les résultats d’IHA entre différents laboratoires (8, 12), et au moins un groupe a essayé de développer un test d’IHA modifié et plus robuste pour générer des données plus fiables et reproductibles (22).
Dans la présente étude, les laboratoires du PCIRN ont adhéré strictement au protocole de dosage HAI standard de l’Organisation mondiale de la Santé, accessible au public, dans lequel les points sujets à des variations techniques ou interprétatives étaient harmonisés entre les laboratoires avant le début de l’étude. Les réactifs clés (p. ex., EDR, RBC, stocks de virus) ont été obtenus autant que possible auprès des mêmes fournisseurs. De plus, le fait de limiter les essais à un seul technologue sur chaque site d’essai a permis une normalisation accrue. L’effet possible de l’utilisation de plusieurs personnes dans chaque laboratoire n’a pas été testé dans cette étude. Bien que l’utilisation de plusieurs opérateurs puisse potentiellement augmenter la variabilité, la seule étude qui a examiné cette possibilité pour les tests HAI n’a montré aucune différence significative entre les résultats de deux opérateurs dans le même laboratoire (22).
Les variations potentielles entre les laboratoires dans les souches virales cultivées pour être utilisées dans le test ont été minimisées entre les laboratoires du PCIRN en utilisant des stocks de semences virales provenant d’une source unique qui ont été cultivés dans la même lignée cellulaire dans des conditions similaires dans tous les laboratoires. Nous supposons que la reproductibilité interlaboratoire pourrait être encore améliorée si des stocks de travail viraux devaient être produits de manière centralisée et distribués aux laboratoires participants. L’importance des variations de souches virales pour les titres de paramètres de l’IHA est bien illustrée par les titres 2 à 3 fois plus faibles démontrés dans une étude lorsque l’essai de l’IHA utilisait une souche A/ Cal pH1N1 par rapport au réassortiant X179A qui possédait encore des hémagglutinines et des neuraminidases équivalentes (11). Malheureusement, les stocks n’ont pas été séquencés dans le cadre de cette étude, et nous ne pouvons donc pas vérifier que tous les laboratoires ont utilisé des virus avec des séquences d’hémagglutinine identiques. Même si des variations de séquence mineures avaient été introduites par la propagation locale des stocks de virus, la variabilité entre les laboratoires dans cette étude était faible, et il est donc difficile d’imaginer comment l’utilisation de stocks avec des séquences d’HA identiques pourrait réduire davantage la variabilité. Bien que les différences n’aient pas dépassé le double dans ce petit ensemble d’échantillons, des variations mineures de la séquence HA introduites par la propagation locale des stocks viraux pourraient expliquer les tendances à la sous-estimation des titres H1N1 et à la surestimation des titres H3N2.
Diverses études ont rapporté une variabilité interlaboratoire réduite des titres d’IHA en étalonnant les résultats par rapport aux normes internationales (6, 11-13); cependant, de telles normes n’existent pas pour les souches actuelles du virus de la grippe saisonnière B et de la grippe A H3N2, et la dérive antigénique constante des souches saisonnières qui entraîne la reformulation annuelle des vaccins pourrait bien nécessiter l’élaboration et la validation continues de nouvelles normes. Dans cette étude, la comparabilité interlaboratoire semble supérieure à celle obtenue grâce à l’utilisation d’étalons d’étalonnage, même les plus efficaces. Par exemple, après l’étalonnage avec IS 09/194, Wood et al. (11) ont indiqué que les différences maximales entre les MGT dans différents laboratoires ont diminué de 80 à 64 fois (c’est-à-dire une valeur encore sensiblement supérieure au facteur maximal de 11 dans la présente étude) et que les fourchettes de VCC entre laboratoires ont diminué de 95 % à 345 % (médiane, 105 %) à 34 % à 231 % (médiane, 109 %) – c’est—à-dire bien au-dessus de la fourchette de 0 % à 156 % (médiane, 27 %) observée dans la présente étude. De même, l’utilisation du remplacement IS 10/202 a réduit la VCC entre les laboratoires d’une plage de 108 % à 157 % à une plage de 24 % à 144 % sur cinq échantillons et les différences maximales entre les laboratoires de 43 à 21 fois (13), et, en utilisant la norme 07/150, Stephenson et al. (6) a réduit le VCC médian des échantillons du clade 1 de 15 NIBRG-14 H5N1 de 125 % (intervalle, 31 % à 582 %) à 61 % (34 % à 535 %).
Bien qu’il soit impossible de déterminer les raisons exactes du niveau élevé d’accord entre les laboratoires du PCIRN par rapport aux études précédentes, notre succès a été facilité par l’incitation que nous avions en tant que réseau national à travailler vers l’objectif commun d’établir des processus reproductibles. L’harmonisation détaillée et rigoureuse des processus et des réactifs entre les sites est peut-être le seul aspect « nouveau » que nous avons apporté à cette étude, par rapport à la littérature de longue date montrant une mauvaise reproductibilité des IHA entre les laboratoires. Cependant, nos données suggèrent qu’avec une normalisation rigoureuse, les variations inter-laboratoires des titres d’IHA peuvent être réduites à des niveaux similaires à ceux observés dans un seul laboratoire. Les prochaines étapes potentielles pour réduire au minimum les variations des titres HAI dans les laboratoires du monde entier seraient la mobilisation de réseaux / consortiums, la mise en œuvre de lignes directrices et / ou d’exigences réglementaires pour l’utilisation de procédures et de réactifs normalisés, une formation normalisée pour assurer la reproductibilité et la fourniture d’un soutien et / ou d’incitations pour que les laboratoires adoptent le concept de « normalisation ».