La souche III d’Encéphalitozoon cuniculi est une Cause d’Encéphalitozoonose chez l’Homme et le Chien

Résumé

Les microsporidies sont des organismes eucaryotes intracellulaires obligatoires que l’on trouve chez un large éventail d’hôtes vertébrés et invertébrés. Encephalitozoon cuniculi est couramment trouvé chez les lapins domestiques et les rongeurs et se produit également chez les chiens, les autres canidés et les primates, y compris les humains. Le séquençage de l’ADN des gènes de l’ARN ribosomique a été utilisé pour identifier ces parasites au niveau de l’espèce et pour définir les souches I, II et III d’E. cuniculi. Huit nouveaux isolats de chiens ont été caractérisés comme souche III d’E. cuniculi par l’utilisation de méthodes moléculaires. Cette souche a également été identifiée dans des isolats d’humains immunodéprimés, suggérant le potentiel zoonotique de cette espèce parasite. Une excrétion prolongée de spores microsporidiales chez des chiens asymptomatiques est également rapportée.

Encephalitozoon cuniculi est un protozoaire intracellulaire obligatoire du phylum Microspora et est un parasite commun des lapins domestiques et des rongeurs. De temps en temps, ces parasites ont été signalés chez d’autres hôtes, notamment des chiens, des renards bleus (Alopex lagopus) et un petit nombre d’autres carnivores sauvages. Un nombre croissant de rapports décrivent également une maladie clinique chez l’homme causée par E. cuniculi, mais la ou les sources de l’infection humaine sont inconnues.

Historiquement, l’identité du parasite était basée sur des caractéristiques morphologiques et parfois ultrastructurales. Récemment, des membres morphologiquement similaires du genre Encephalitozoon ont été spécifiés grâce à l’utilisation de caractéristiques immunologiques et à la caractérisation moléculaire des gènes de l’ARN ribosomique. Les isolats d’E. cuniculi ont été divisés en souches I, II ou III, en fonction du nombre de répétitions d’une séquence à 4 bases (5′-GTTT-3′) dans la région de l’espaceur transcrit interne (ITS) du gène de l’ARN ribosomique. Deux isolats de chien E. cuniculi ont été désignés souche III sur la base de la présence de 4 répétitions de séquences. Par la suite, 4 isolats humains ont été identifiés comme la souche III (isolats « Donovan » GenBank X98466, CDC: V282 et IPZ: MX-H5) et comme la souche I dans deux rapports d’Europe. Cette étude étend ce travail en identifiant 8 isolats supplémentaires d’E. cuniculi provenant de 4 épidémies comme souche III. Bien qu’aucune donnée épidémiologique n’ait confirmé directement la transmission de chien à homme, les données moléculaires suggèrent que les chiens pourraient servir de réservoirs potentiels de parasites. De plus, l’excrétion à long terme de spores par des chiens asymptomatiques a été documentée, renforçant encore la probabilité de transmission zoonotique du parasite.

Matériaux et méthodes

Isolats de parasites

Les corps de 7 chiots de 3 portées non apparentées et de 1 chien ont été soumis pendant 18 mois au Laboratoire de diagnostic vétérinaire du Texas pour une évaluation post-mortem. Les animaux provenaient de quatre sources indépendantes de différentes régions du Texas. Un diagnostic d’encéphalitozoonose a été posé dans chaque cas sur la base des résultats histologiques. Huit isolats de parasites ont été établis à partir de tissus frais des animaux: 5 isolats ont été dérivés de tissus cérébraux ou rénaux de camarades de litière de chiots Boston terrier âgés de 5 à 7 semaines (2 mâles, 3 femelles) décédés d’une maladie neurologique (isolats 1-5, portée 1). L’isolat 6 provient du cerveau d’un terrier maltais mâle âgé de 10 semaines qui était 1 des 4 compagnons de litière (portée 2) décédé d’une maladie neurologique. L’isolat 7 provient du cerveau d’un chiot caniche miniature femelle de 10 semaines (portée 3) décédé d’une maladie neurologique. L’isolat 8 provient du rein d’un teckel miniature femelle de 18 mois décédé d’une insuffisance rénale (tableau 1).

Au post-mortem, les tissus ont été prélevés de manière aseptique et homogénéisés (homogénéisateur de tissus Ten Broeck; Corning, Corning, NY) à l’aide de PBS, pH 7.2, plus 2 × solution antibiotique-antimycotique (Gibco, Gaithersburg, MD). Les spores microsporidiales ont été purifiées à partir de l’homogénéat de tissu hôte en utilisant une méthode de gradient de densité de Percoll précédemment décrite modifiée en changeant la vitesse de centrifugation à 600 g. Les microsporidies ont été cultivées dans des cellules RK-13 (ATCC CCL-37) en utilisant un milieu RPMI 1640 additionné de sérum fœtal bovin à 5% et de 2× solution antibiotique-antimycotique (Gibco) comme décrit précédemment. La culture parasitaire et l’analyse de l’ADN ont été effectuées sur plusieurs mois en fonction de la réception des différents échantillons de cas, de sorte que la possibilité de contamination croisée accidentelle était négligeable.

Isolement de l’ADN

Pour les isolats 1 à 6 et 8, les parasites ont été cultivés en culture à court terme afin de générer des spores adéquates pour la caractérisation moléculaire. Pour l’isolat 7, les parasites ont été directement purifiés du tissu cérébral frais du chiot pour l’isolement de l’ADN. Pour la plupart des isolats, l’ADN a été extrait de spores purifiées à l’aide de la matrice Instagene (BioRad, Hercules, CA), suivant le protocole du fabricant pour les cultures bactériennes. Pour une partie du travail moléculaire avec les isolats 6 et 8, les spores ont été traitées comme décrit précédemment, et l’ADN a été extrait des spores par une méthode d’extraction standard du phénolchloroforme à l’aide d’un système de tubes microfuges en gel de partitionnement (light phase Lock Gel system; Fabricant 5 Prime → 3 Prime, Westchester, PA) pour optimiser la récupération de l’ADN. L’ADN a été précipité à l’éthanol, le culot a été remis en suspension dans du TE (Tris 10 mM, EDTA 1 mM, pH 7,6) et la concentration d’ADN a été estimée à l’aide de rapports A260: A280 par spectrophotométrie UV (Ultraspec Plus; Pharmacia, Piscataway, NJ). L’ADN extrait de spores dérivées de cultures tissulaires d’Encephalitozoon hellem a été utilisé comme témoin positif, et un témoin négatif composé uniquement de réactifs a été inclus dans toutes les réactions d’extraction et de séquençage.

Séquençage partiel de l’ADN et analyse du gène de l’ADN ribosomique de petite sous-unité (ARNr SSU)

Une partie de l’extrémité 5’du gène de l’ARNr SSU de chacun des 8 isolats a été amplifiée en utilisant la paire d’amorces PMP1 et PMP2, comme décrit précédemment. La réaction en chaîne par polymérase (PCR) pour chaque isolat a été effectuée en suivant les instructions du fabricant (Réactifs de base de PCR GeneAmp, N808-0009; Perkin-Elmer Cetus/Roche Molecular Systems, Branchburg, NJ). L’amplification a été réalisée dans un thermocycleur (PTC-200 Peltier; MJ Research, Watertown, MA). Après dénaturation initiale pendant 5 min à 95°C, la Taq polymérase (0,5 U) a été ajoutée à chaque réaction de 25 µL. Les échantillons ont ensuite subi 35 cycles de dénaturation (94°C, 30 s), de recuit (60°C, 30 s) et d’extension (72°C, 1 min) suivis de 10 min à 72°C pour l’extension finale. Les nucléotides non incorporés ont été éliminés à l’aide de colonnes de chromatographie (Micro Bio-Spin 30; BioRad). Les échantillons ont été maintenus à 4°C jusqu’à ce qu’ils soient traités pour un séquençage automatisé.

Analyse de l’ADN de la région ITS

Une partie de la région ITS du gène de l’ARN ribosomique de chaque isolat a été amplifiée par PCR avec la paire d’amorces int530f et int580r, en utilisant les méthodes d’amplification décrites ci-dessus. Le produit de PCR résultant a été séquencé dans un séquenceur d’ADN automatisé (modèle 377; Perkin-Elmer Applied Biosystems / Roche Molecular Systems, Branchburg).

Séquençage automatisé de l’ADN

L’ADN amplifié par PCR de chaque isolat a été amplifié pour une séquence automatisée avec un kit commercial (ABI Prism Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready-Reaction Kit; Promega, Madison, WI) en suivant les instructions du fabricant. Toutes les réactions ont été exécutées dans un thermocycleur (MJ Research Minicycler). Les échantillons ont ensuite subi 35 cycles de dénaturation (94°C, 30 s), de recuit (60°C, 30 s) et d’extension (72°C, 1 min) suivis de 10 min à 72°C pour l’extension finale. Les produits d’extension ont été purifiés à l’aide de colonnes de chromatographie (Micro Bio-Spin; BioRad), séchés dans une centrifugeuse sous vide (Savant Instruments, Holbrook, NY) et stockés à -20°C jusqu’à ce qu’ils soient séquencés dans un séquenceur automatisé (Perkin-Elmer 377 ABI Applied Biosystems).

À l’aide d’un logiciel d’alignement (Séquenceur; Codes de gènes, Ann Arbor, MI), des séquences consensuelles de ∼265 bases ont été obtenues pour une partie du gène de l’ARNr SSU pour chaque isolat de parasite. Ces séquences ont été évaluées pour leur homologie par rapport aux séquences d’encéphalitozons précédemment rapportées dans la base de données NCBI GenBank à l’aide d’une simple recherche de BLASTN.

Essai de mobilité hétéroduplex d’ADN double brin

L’ADN de l’isolat 6 a été amplifié par PCR avec la paire d’amorces int530f et int580r comme décrit précédemment. Les produits amplifiés par PCR ont été dosés pour la génération d’hétéroduplexes et d’homoduplexes en utilisant des isolats d’E. cuniculi précédemment caractérisés provenant de divers hôtes.

Résultats

Un total de 8 isolats de parasites provenant de 4 éclosions cliniques distinctes ont été établis en culture tissulaire. Les caractéristiques microscopiques lumineuses et les caractéristiques de croissance in vitro des parasites suggèrent qu’il s’agit d’E. cuniculi, un microsporidien précédemment signalé chez le chien ainsi que chez d’autres hôtes. Le séquençage partiel de l’extrémité 5′ du gène de l’ARNr SSU de chaque isolat (GenBank AF144246–AF144253) a confirmé l’identité des parasites en tant qu’E. cuniculi, puisque tous les spécimens présentaient une homologie à 100% avec des séquences précédemment publiées (GenBank L39107dEZORGOA, L17072¦EZORGSMALL; X98470¦ECDSSRR2).

L’analyse par hétéroduplex et le séquençage de la région ITS du gène de l’ARN ribosomique ont en outre caractérisé tous les isolats de chiens en tant que souche III, confirmant des rapports antérieurs de variations subtiles entre les isolats d’E. cuniculi de divers rongeurs, lapins et hôtes humains. La figure 1 illustre la formation d’homoduplex d’ADN entre l’isolat canin 6 et un isolat de souche III précédemment caractérisé ainsi que la formation d’hétéroduplex entre l’isolat 6 et les autres souches d’E. cuniculi.

Discussion

La signification biologique de plusieurs souches d’E. cuniculi n’a pas encore été clarifiée; cependant, la capacité de distinguer entre les souches de parasites peut fournir un outil pour retracer les sources d’infection dans les études épidémiologiques. Nos données moléculaires identifiant 8 isolats microsporidiens de chiens comme souche III d’E. cuniculi concordent avec une étude précédente qui classait 2 isolats de chiens comme souche III. Des isolats de lapin, de souris et de renard ont été signalés comme souches I ou II. Ces données suggèrent que la souche III pourrait être principalement associée aux chiens. Les isolats humains ont été identifiés comme souche III dans l’hémisphère occidental et comme souche I en Europe. Bien que la ou les sources d’exposition humaine à E. cuniculi est inconnu, il existe de plus en plus de preuves que les animaux peuvent servir de réservoirs d’infection et qu’il existe une possibilité de transmission zoonotique de l’organisme entre les animaux et les humains. Il est intéressant de noter que les différences géographiques et culturelles dans la propriété des animaux de compagnie peuvent jouer un rôle dans l’exposition humaine, car les chiens sont des animaux de compagnie courants aux États-Unis, tandis que les lapins sont fréquemment gardés comme animaux de compagnie ou comme nourriture en Suisse et dans d’autres pays européens.

L’examen des échantillons de selles et d’urine des parents cliniquement normaux du Boston terrier et de 1 chiot de la portée 1 a montré de faibles niveaux d’excrétion de spores pendant ⩾4 mois après la mort des compagnons de litière (isolats 1 à 5; données non publiées). Cette observation suggère en outre un mécanisme possible de transmission directe ou indirecte des parasites du chien à l’homme par la contamination d’environnements localisés par des excrétions urinaires et fécales du chien. Bien qu’aucune étude épidémiologique n’ait évalué la relation entre la propriété/ l’exposition d’un animal et les infections microsporidiales humaines, dans un seul cas où des enfants ont été exposés à des chiots atteints d’encéphalitozoonose manifeste, 1 enfant sur 3 a été séroconverti. D’autres isolats d’E. cuniculi provenant de divers hôtes doivent être analysés pour évaluer plus avant le risque de maintenir des animaux de compagnie potentiellement infectés dans les ménages de personnes immunodéprimées à haut risque d’infections microsporidiales.

Remerciements

Nous remercions les pathologistes du Laboratoire de diagnostic médical vétérinaire du Texas Jay Hoffman, Joanne Mansell et Bruce Abbitt d’avoir fourni des tissus canins pour cette étude.