Le double blocage de CD47 et HER2 élimine les cellules cancéreuses du sein radiorésistantes

Lignées cellulaires

Cancer du sein humain Les lignées cellulaires MCF-7, MDA-MB-231, BT474, BT549, SKBR3, glioblastome U251 et cancer du côlon HCT116 ont été achetées auprès d’ATCC. Les cellules MCF-7, MDA-MB-231, BT474, BT549 et U251 ont été maintenues dans un milieu DMEM additionné de 10% de FBS, et les cellules SKBR3 maintenues dans un milieu RPMI-1640 avec 10% de FBS. Les cellules HCT116 ont été maintenues dans le milieu 5a de McCoy avec 10% de FBS. Les lignées cellulaires MCF7/C6 et MDA-MB-231/C5 radiorésistantes qui ont été clonées à partir de fractions survivantes de cellules MCF7 et MDA-MB-231 après irradiation répétée; les cellules souches du cancer du sein surexprimant HER2 (HER2+ / CD44+ / CD24- / BCSC faibles) ont été isolées à partir de MCF7/ C626. Des cellules 4T1 du cancer du sein triple négatif de souris ont été maintenues dans un milieu DMEM avec 10% de FBS. Les monocytes humains THP-1 ont été cultivés dans un milieu RPMI-1640 formulé par l’ATCC, additionné de 10% de FBS, d’HEPES de 15 mM, de 4,5 g/l de glucose et de 2-mercaptoéthanol jusqu’à une concentration finale de 0,05 mM. Mφ de souris BRUT 264.7 cellules ont été cultivées en milieu DMEM avec 10% de FBS suivant la méthode de culture ATCC. Toutes les lignées cellulaires ont été testées avec une contamination négative des mycoplasmes avec le kit de test PCR MycoSensor (Agilent Technologies, Catalogue #302108).

Plasmides et réactifs

Le vecteur luciférase contrôlé par le promoteur CD47 a été construit par clonage de la région promotrice CD47 humaine (-1554 nt) en plasmide basique pGL2 à partir de sites KpnI/Hind III. La suppression des sites putatifs de liaison NF-kB (TGGAAGCT-764-757) a été réalisée à l’aide d’un kit de mutation rapide (Stratagene, La Jolla, CA). Les séquences d’amorces utilisées: 5 ′-GTGGTCGGGTACCTGCCCGCTCGCCCCTCGCGGGCTCTGCG-3′ (sense) and 5 ′-CGCAGAGCCCGCGAGGGGCGAGCGGGCAGGTACCCGACCAC-3′ (antisense).

pGL2-NF-κB-luc plasmid was constructed with the 3 NF-κB-binding sites: GTGGGTTCCC, TCGCCACTCCCC, and TGGAAAGTCCCC by blunt-end ligation. IMD-0354 (Catalog # I3159) and TNF-α (Catalog # T0157) were purchased from Sigma. The lentiCRISPR v2 vector was purchased from the Addgene plasmid repository (Catalog # 52961). Herceptin was obtained from the UC Davis Comprehensive Cancer Center Pharmacy as left-over medicine (Genentech, NDC 50242-132-01). Le Lapatinib (numéro de catalogue S1028) a été acheté auprès de Selleckchem. L’anticorps anti-CD47 (B6H12) pour IHC, ICC et western blot a été acheté à Santa Cruz (Catalogue #sc-12730). L’Anti-CD47-FITC pour la cytométrie en flux a été acheté auprès de BD Biosciences (Catalogue #556045). L’anticorps anti-CD47 humain (B6H12) pour le test de phagocytose a été extrait de l’hybridome B6H12.2 (ATCC® HB-9771™). L’anticorps anti-souris CD47 pour l’inhibition tumorale in vivo a été extrait de l’hybridome MIAP301 fourni par le Dr William Frazier (École de médecine de l’Université de Washington). Un anticorps anti-CD11b pour la coloration IHC a été acheté auprès d’Invitrogen (Catalogue #MA5-17857). L’anticorps monoclonal anti-α-tubuline de souris pour western blot a été acheté auprès de Sigma-Aldrich (Catalogue #T6074). L’anticorps monoclonal anti-β-actine de souris pour western blot a été acheté chez Sigma-Aldrich (Catalogue #A5441). L’anticorps Anti-HER2 / ERBB2 (Catalogue #29D8) pour la coloration IHC et le western blot a été acheté auprès de Cell Signaling Technology (Catalogue #2165). L’anticorps Anti-HER2-APC pour l’analyse de cytométrie en flux a été acheté auprès de BD Biosciences (Catalogue #340554).

Immunoblotting

Des protéines de cellules ou de tissus tumoraux ont été extraites dans du tampon RIPA lysis (Pierce) complété par un cocktail d’inhibiteurs de protéase et de phosphatase (Signalisation cellulaire). La concentration en protéines a été déterminée à l’aide du test BCA (Pierce). Les lysats ont ensuite été dénaturés et des échantillons contenant 30 µg de protéines ont été soumis à une électrophorèse dans un gel de poly-acrylamide SDS à 10%, suivie d’un transfert sur des membranes de difluorure de polyvinylidène (Bio-Rad). Après blocage avec du lait sec non gras à 5%, la membrane a été exposée à l’anticorps primaire et incubée à 4 °C pendant une nuit. Les blots ont été visualisés par marquage avec des anticorps secondaires couplés à la HRP (Sigma-Aldrich) et incubation avec le réactif de détection de western blot d’Amersham ECL (Catalogue #RPN2106). Les blots ont été développés sur un développeur Konica SRX101A et quantifiés avec ImageJ.

Analyse de cytométrie en flux

Les cellules collectées ont été rincées avec du PBS contenant 0,5% de BSA dans du PBS et les pastilles cellulaires ont été incubées avec des anticorps primaires marqués par fluorescence à 37 ° C pendant 30 min, suivies d’un lavage trois fois avec 0,5% de BSA/PBS. Tous les anticorps ont été titrés pour optimiser la condition avant d’être appliqués à l’expérience. L’analyse par cytométrie en flux a été réalisée à l’aide du cytomètre FACS Canto II (BD) et l’analyse ultérieure a été réalisée à l’aide du logiciel FlowJo (Tree Star, Ashland, OR, USA). Les stratégies de déclenchement étaient basées sur les propriétés FSC et SSC et ont été mises en place pour des populations de cellules positives dans les canaux FITC, APC.

Tissus de cancer du sein humain

Des tissus de cancer du sein HER2 frais et congelés positifs et négatifs ont été fournis par le Biorepository du Centre de cancérologie UC Davis Comprehensive (IRB # 283665 et IRB # 218204) financé par la subvention de soutien du Centre de cancérologie UC Davis Comprehensive (CCSG) attribuée par le National Cancer Institute (NCI P30CA093373) avec toutes les informations sur le patient bloquées, à l’exception des résultats diagnostiques. D’autres échantillons pathologiques de cancer du sein humain, y compris les sections non colorées de 4 µm d’épaisseur de cancer du sein primaire apparié à base de paraffine fixée au formol (FFPE) et les cancers du sein récurrents, ont été obtenus auprès du département de pathologie de l’Université d’État de l’Ohio avec l’approbation de la recherche IRB (#2002H0089).

Immunohistochimie (IHC)

La coloration immunohistochimique a été effectuée sur des coupes de tissus FFPE de 4 µm d’épaisseur. Brièvement, les lames ont été deparaffinisées et réhydratées, et les antigènes ont été récupérés pendant 40 min dans un tampon citrate (pH 6,1) à 95 °C. L’activité de la peroxydase endogène a été bloquée par une solution de H2O2 à 3%. L’incubation primaire des anticorps a été effectuée à 4 °C pendant une nuit, suivie du kit Vectastain ABC (Vector Laboratories) à RT pendant 30 min selon les instructions du fabricant. Les produits de réaction ont été détectés à l’aide d’un kit de substrat de Peroxydase et contre-colorés à l’hématoxyline (Vector Laboratories). Deux pathologistes chevronnés étaient chargés du diagnostic des cancers du sein en clinique et de l’évaluation des tumeurs expérimentales. L’expression de CD47 a été évaluée en utilisant à la fois l’intensité de coloration et le pourcentage de cellules colorées. L’intensité de coloration a été notée 0: négative; 1: faible; 2: modérée; 3: forte. Une expression élevée a été définie comme une forte intensité de coloration dans plus de 25% des cellules tumorales; une expression moyenne était une intensité de coloration modérée dans plus de 25% des cellules tumorales; une faible expression était une faible intensité de coloration dans plus de 25% des cellules tumorales ou une coloration modérée dans <25% des cellules tumorales utilisant les lignes directrices ASCO-cap63 a été utilisée pour l’interprétation de l’immunohistochimie HER2 (IHC), et l’expression de la protéine HER2 a été notée IHC 0 négative (pas de coloration ou de coloration membranaire incomplète et faiblement / à peine perceptible et dans ≤10% des cellules tumorales invasives) ou négative IHC 1+ (coloration membranaire incomplète qui est faible / à peine perceptible et dans > 10% des cellules tumorales invasives); IHC équivoque 2+ (coloration membranaire circonférentielle incomplète et / ou faible/ modérée et dans > 10% des cellules tumorales invasives; et ou coloration membranaire complète et circonférentielle intense et dans ≤10% des cellules tumorales invasives); IHC positive 3+ (coloration membranaire circonférentielle complète et intense dans plus de 10% des cellules tumorales invasives). Si les résultats étaient équivoques (2+), des tests réflexes ont été effectués en utilisant l’hybridation in situ (ISH). Lors de la détection de l’expression CD47 de tumeurs irradiées in vivo, les tumeurs de souris traitées ont été enlevées et fixées dans du paraformaldéhyde à 4% dans du PBS pendant 24 h. Les échantillons ont été déshydratés avec de l’éthanol de série (70%, 95% et 100%) pendant 48 h avant d’être incorporés dans la solution de paraffine (Polysciences).

Immunocytochimie (ICC)

Les cellules ont été ensemencées sur des lamelles rondes et cultivées à 60-80% de confluence, suivies d’un rinçage avec du PBS, d’une fixation dans 4% de paraformaldéhyde (pH 7,2) et d’une perméabilisation avec 0,1% de Triton X-100 dans du PBS. Les cellules ont ensuite été incubées dans une solution bloquante pendant 15 min avant incubation avec l’anticorps primaire pendant une nuit à 4 °C avec des dilutions 1:250. Les cellules ont été incubées avec des anticorps secondaires conjugués au TR ou au FITC dilués au 1:1000 dans la solution bloquante pendant 1 h à température ambiante dans l’obscurité et analysées en microscopie confocale.

Identification des protéines antigéniques associées au rayonnement

La souris C57/B6 a été utilisée comme hôte d’immunisation avec 5 × 106 cellules MCF7/C6 en 0.1 ml de volume injecté à la base de la queue ou du pied par souris, suivi d’un boostage avec le même volume de cellules au 14ème jour. Au 5ème-7ème jour suivant le deuxième défi, les souris ont été euthanasiées et le sérum a été collecté pour détecter les molécules antigéniques exprimées dans les cellules BC radiorésistantes. Afin de distinguer les RAAP des molécules non spécifiques exprimées dans les cellules épithéliales mammaires normales et les cellules MCF7 sauvages, une procédure de pré-nettoyage a été effectuée avec le sérum brut par les étapes suivantes. Deux millions de cellules épithéliales mammaires normales humaines MCF10A ont été préparées dans une solution contenant 1 mm d’EDTA/PBS sans trypsine pour éviter de digérer certaines des protéines sensibles, suivie d’un rinçage avec du PBS deux fois. Les cellules ont été granulées puis desserrées en tapotant le fond du tube puis en ajoutant 1 ml d’anti-sérums de souris et en tournant à 4 °C pendant 2 h. Le mélange a ensuite été centrifugé à 9391 × g pendant 5 min à 4 °C et les surnageants ont été collectés, ce qui a été répété une fois. Le premier antisérum nettoyé a ensuite été nettoyé par incubation avec des cellules MCF7 de type sauvage en utilisant les mêmes procédures et répété six fois. L’antisérum purifié final a ensuite été testé par western blot contre le lysat de protéines provenant de cellules MCF10A, de cellules MCF7, de cellules MCF7 / C6 et de cellules RD-BCSC triées par marqueurs de cellules souches du cancer du sein HER2 + / CD44 + / CD24− ainsi que par aldéhyde déshydrogénase (ALDH) 64. CD47 et HER2 ainsi que d’autres RAAP dans les cellules BC radiorésistantes ont été identifiés par des western blots ou par immunoprécipitation de protéines membranaires purifiées à partir de cellules RD-BCSC et les fractions éluées ont été analysées via LC / MS. Les RAAP membranaires résultantes ont été regroupées avec un certain nombre de protéines et de catégories fonctionnelles protéiques.

Édition CRISPR de HER2 et CD47

Les SGRNA ont été conçus en suivant les instructions publiées par le logiciel de conception CRISPR du laboratoire Dr Zhang (http://crispr.mit.edu) et le protocole établi qui a été décrit dans la publication précédente65. Quatre Oligos ont été conçus correspondant aux SGRNA humains ont été synthétisés et clonés dans le vecteur lentiCRISPR v2 en suivant le protocole d’amplification de la bibliothèque pooled de Zhang Lab GeCKO. Pour minimiser la possibilité d’un ciblage non spécifique, trois oligos de sgRNA de chaque gène de ciblage ont été synthétisés et testés. Le sgRNA avec la meilleure efficacité de knockout déterminée par western blot a été choisi pour des expériences ultérieures. Les séquences de sgRNA ont été utilisées pour les cellules humaines et de souris comme suit :

hHer2gRNA_F:CACCGCGGCACAGACAGTGCGCGCGTC

hHer2gRNA_R: AAACGACGCGCACTGT CTGTGCCGC

hCD47gRNA_F: CACCGTAAATATAGATCCGGTGGTA

hCD47gRNA_R: AAACTACCAC CGGATCTATATTTAC

mHer2gRNA_ F: CACCGTGATGGCCCTCGCCCCTCGG

mHer2gRNA_ R: AAACCCGAGGGGCGAGGGCCATCAC

mCD47gRNA_F: CACCGCCCTTGCATCGTCCGTAATG

mCD47gRNA_R: AAACCATTACGGACGATGCAAGGGC

The lentiviral particles were generated using 293T cells following the protocol from Addgene. For gene editing, the isolated BCSC sphere cells or MCF7/C6 cells were trypsinized into single cells and plated 1. 2.5 × 105 cells/0.5 ml per well in the 12-well plates. Après incubation pendant 12 h, 1 ml de surnageant contenant un virus avec 8 ng de polybrène a été ajouté aux cellules suivi d’une incubation pendant 6 h. Puis, 0,5 ml de milieu régulier supplémentaire contenant 10% de FBS inactivé à la chaleur a été ajouté et mis en culture pendant une nuit. Le milieu d’infection a été remplacé par un milieu frais de 2 ml contenant 10% de FBS et cultivé pendant 72 h. Les cellules ont été passées dans des boîtes de culture tissulaire de 60 mm et sélectionnées par culture dans de la Puromysine de 0,3 µg / ml pendant 1 semaine et l’élimination du gène ciblé a été vérifiée par immunoblot.

Analyse de la luciférase

Des cellules ont été transfectées avec des reporters de la luciférase pGL2-basic-CD47 ou pGL2-basic-CD47-ΔNF-kB ou pGL2-NF-kB, et l’activité de la luciférase a été mesurée par luminomètre (Promega, Madison, WI). Pour la normalisation de l’efficacité de la transfection rapporteuse, la concentration protéique totale des lysats a été mesurée avec le kit de dosage des protéines BCA (Pierce, Rockford, IL) avec BSA comme étalon.

Essai d’immunoprécipitation à la chromatine (ChIP)

Les cellules ont été réticulées avec du formaldéhyde (1% final) pendant 10 min, lavées avec du PBS glacé et collectées dans un tampon de lyse SDS (1% SDS, EDTA 10 mM, Tris 50 mM, pH 8. 1). La chromatine a été cisaillée par sonication, pré-nettoyée avec des billes d’agarose conjuguées à la protéine G et incubée avec des IgG anti-p65, anti-c-Rel ou normales à 4 C pendant une nuit. Après ajout de la protéine G pendant 2 h à 4 °C, le complexe a été lavé de manière séquentielle avec des tampons de lavage du complexe immunitaire à faible et à forte teneur en sel (0. 1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mm EDTA, 20 mm Tris-HCl pH 8.1 plus NaCl de 150 mm pour les tampons à faible teneur en sel et NaCl de 500 mM pour les tampons à haute teneur en sel) suivi du tampon TE (deux fois). L’interaction ADN-facteur de transcription a été inversée après l’ajout de NaCl et l’incubation à 65 °C pendant la nuit. Après digestion de la RNase A et de la protéinase K, les fragments d’ADN ont été purifiés par extraction phénol/chloroforme et précipitation à l’éthanol. Les ADN ont été purifiés et utilisés pour la PCR avec des amorces spécifiques pour la région du promoteur du gène englobant les sites de liaison NF-kB. Les amorces CD47 étaient:

5′-CGTGGACCAGGACACCTAGG-3′ (sense)

5′-AGGGAAGAGAACCGCATAGG-3′ (antisense)

The PCR amplification of the IκB promoter region (1134/902) was also included as positive. The primers for NF-κB-binding site in the IκB promoter were:

5′-TGTAGCACCCATTAGAAACACTTC-3′ (sense)

5′-TTCTTGTTCACTGACTTCCCAAT-3′ (antisense).

Preparation of anti-human and anti-mouse CD47 antibodies

Hybridoma for monoclonal mouse anti-human CD47 antibody (B6H12.2), IgG2b were obtained from ATCC. L’anticorps monoclonal anti-souris CD47 IgG2a du rat (MIAP301) et l’hybridome ont été obtenus auprès du Dr William Frazier (École de médecine de l’Université de Washington). Les deux lignées cellulaires d’hybridomes ont été maintenues en milieu IMDM avec 20% de FBS. Les anticorps ont été purifiés à partir d’un surnageant d’hybridome à l’aide de résine de protéine G de GenScript (Catalogue #L00209) selon les procédures standard de fabrication. Les échantillons ont ensuite été concentrés de 10 à 20 fois à l’aide de dispositifs centrifuges Microsep de Pall Life Sciences. Les concentrations d’IgG purifiées ont été déterminées en mesurant l’absorbance à OD280.

Essai de phagocytose

Les cellules THP1 de monocytes humains et les cellules Mφ BRUTES 264,7 de souris (ATCC, TIB-71) ont été maintenues dans un incubateur à 5% de CO2 à 37 °C66 à une densité approximative de 1 × 106/ml. Environ 0,8 × 106 cellules / ml de 264,5 cellules BRUTES ou 1 × 106 cellules THP1 ont été ensemencées sur une plaque à 6 puits. Après 24 h d’incubation, 264,7 cellules BRUTES ont été activées par traitement avec 0,1 µg/ml de lipopolysaccharide (LPS) pendant 24 h. Les cellules monocytaires THP1 ont été différenciées par le 12-myristate 13-acétate de Phorbol (PMA) (40 nM) pendant 48 h. Les macrophages activés ont été colorés au Dio à la concertation finale 40 nM dans un milieu pendant 20 min suivi d’un rinçage trois fois au milieu. Les cellules cancéreuses ont été marquées avec du DDAO à 1 µM (solution mère de 5 mM dans du DMSO stocké à -20 °C) dans du PBS à 37 °C pendant 15 min et lavées avec du PBS contenant 1% de FBS. Des cellules cibles marquées au DDAO (1 × 106) ont été ajoutées aux Mφ DIO-colorés et incubées dans un volume final de 2 ml à 37 ° C pendant 2 h. Après l’incubation, les Mφ et les cellules cibles ont été récoltées avec trois lavages à l’EDTA-PBS suivis d’une trypsinisation à 0,25%. La phagocytose a été évaluée en évaluant les cellules à double marquage (DIO+ / DDAO+), qui représentent les cellules cancéreuses du sein phagocytées par des Mφ matures, par cytométrie en flux. Le logiciel FlowJo a été utilisé pour l’analyse.

Essai de survie clonogénique

L’essai de survie clonogénique a été réalisé après irradiation avec ou sans traitement (Lapatinib, 10 µM pendant 72 h; anticorps anti-CD47 10 µg/ml pendant la nuit). Les cellules traitées ont été cultivées pendant 10 à 14 jours et les colonies ont été fixées, colorées avec une tache bleue de Coomassie. Les colonies contenant plus de 50 cellules ont été comptées comme des clones survivants et normalisées selon l’efficacité de placage de chaque lignée de cellules tumorales simulées.

Dosage du taux de remplissage des lacunes

La capacité de remplissage des lacunes a été mesurée avec 1 × 106 cellules cultivées dans chacune des plaques à 6 puits jusqu’à une confluence à 100 % suivie d’une famine cellulaire de 24 h. Ensuite, l’écart a été créé en grattant le plat en diagonale avec une pointe de pipette stérile. Les cellules ont été soit laissées non traitées, soit traitées avec 10 µg/ml d’IgG ou d’anticorps anti-CD47 pendant la durée de l’expérience. La capacité de remplissage a été surveillée pendant 72 h et des images représentatives ont été prises au jour 0 (jour de raclage) et au jour 3.

Formation de tumeurs

Les cellules ont été tamisées avec des crépines à cellules de 40 µm (Catalogue #352340. Corning) et des suspensions unicellulaires ont été ensemencées dans des boîtes de Pétri de 60 mm à faible fixation à une densité de 1000 cellules/ml. Les cellules ont été cultivées en milieu basal épithélial mammaire sans sérum (MEBM), additionné de B27 (Catalogue #17504-044. Life Technology), 20 ng/ml EGF (Catalogue #4022-500. Bio-vision), 20 ng/ml basic -FGF (Catalogue #13256-029. Invitrogen), et 4 µg / ml d’héparine (Catalogue #80603-686 EMD MILLIPORE). Les cellules ont été cultivées pendant 10 jours et les tumeurs ont été dénombrées en microscopie optique.

Essai d’invasion de Transwell

Aliquotes (0. 4 ml) de Matrigel (Catalogue #356231. BD Biosciences) ont été dilués dans un tampon d’enrobage : Tris 0,01 M (pH 8,0), NaCl 0,7% à la concentration finale de 200-300 µg/ml. Environ 100 µl ont été chargés dans la chambre supérieure du puits transwell à 24 puits (Catalogue #3422. Costar) et incubé à 37 °C pour gélifier environ 1 h. Retirez délicatement le tampon de revêtement restant de la membrane de support perméable sans perturber la couche, puis ajoutez des cellules (2,5 × 104 / ml). La chambre inférieure a été remplie de 800 µl de milieu MEM contenant 5 µg/ml de fibronectine (Catalogue #SC-29011. Santa Cruz). Le puits trans avec des cellules traitées différemment a été incubé pendant 48 h et coloré avec le kit de coloration Diff-Quick (Catalogue #K7128. IMEB INC).

Préparation de fragments de F(ab’)2

CD47 Les fragments de F(ab’)2 ont été produits par clivage de résine de papaïne d’IgG à l’aide d’un kit de préparation de F(ab’)2 (Catalogue #786272. G- Bioscience) selon les recommandations du fabricant et la procédure rapportée67. Après digestion de la papaïne, le fragment Fab a été séparé des IgG non digérées et la région Fc avec la colonne de Spin de la protéine A du Kit de fragmentation Fab Les colonnes de dessalement GT-600 SpinOUT ont été fournies pour garantir que l’échantillon d’anticorps initial soit la condition optimale pour la fragmentation Fab et l’IgG anti-souris CD47 purifiée a été collectée pour le traitement in vivo de la tumeur de souris.

Rayonnement de cellules BC avec CRISPR-KO CD47 et / ou HER2

Pour tester in vivo l’efficacité de l’inhibition tumorale par rayonnement avec un statut CD47 et HER2 déficient, 5 × 105 cellules 4T1 /C2 avec CRISPR-knockout de CD47 (CD47−/−), HER2 (HER2−/−) ou double (CD47− /− /HER2−/−) ont été implantées dans les coussinets adipeux mammaires de BALB /c (n = 6 par groupe). La croissance tumorale a été évaluée en mesurant le volume tumoral tous les 2 jours à partir du jour 7 jusqu’à ce que les volumes tumoraux atteignent la limite. Pour évaluer la radiosensibilité de tumeurs de statut différent de CD47 et HER2, un rayonnement tumoral local a été administré avec 5 Gy à chaque tumeur au jour 9 et la croissance tumorale a été mesurée tous les deux jours jusqu’à ce que les tumeurs témoins atteignent la limite maximale.

RT de souris BC avec traitement anti-CD47 et/ou HER2

Pour des tests in vivo d’inhibition tumorale avec un seul anticorps CD47 en présence ou en absence de radiothérapie, le traitement anti-CD47 a suivi le protocole de Willingham et al20 avec quelques modifications. Des souris femelles immunodéprimées (BALB / c) âgées de huit semaines (Laboratoires Charles River, Sacramento, États-Unis) ont reçu une injection de 1 × 105 cellules 4T1 du sein de souris dans les 4e glandes mammaires. Cinquante microlitres de PBS contenant 100 µg de fragments d’IgG témoins ou d’anti-CD47 F(ab’) ont été injectés dans le site tumoral (jour 1) ou dans les tissus tumoraux (jour 15) et répétés tous les deux jours jusqu’à la fin des expériences. Les volumes tumoraux ont été surveillés tous les 5 jours. Pour un traitement par radiothérapie, anti-CD47, ou une radiothérapie combinée à un anti-CD47, les animaux porteurs de tumeurs 4T1 ont été répartis aléatoirement en différents groupes de traitement et un groupe témoin (5 à 10 souris par groupe). Le rayonnement local tumoral a commencé lorsque le volume tumoral atteint 200 mm3 avec le FIR (5 Gy / jour / tumeur pour quatre fractions en utilisant une source IR à micro-faisceau; dose totale = 20 Gy) combiné à trois injections tumorales d’anti-CD47 F (ab ‘). La radiosensibilité des tumeurs irradiées in vivo avec présence ou absence d’anti-CD47 F (ab’) a été évaluée par mesure du volume tumoral à la fin des expériences. Les animaux ont été euthanasiés lorsque les tumeurs mesuraient ~ 1400 mm3 ou lorsque les animaux semblaient inconfortables même lorsque la tumeur était inférieure à 1400 mm3 pour se conformer aux réglementations UCD IACUC pour l’utilisation d’animaux vertébrés dans la recherche. Le protocole d’utilisation et de soins des animaux de radiothérapie in vivo a été approuvé par le Comité Institutionnel d’Utilisation et de Soins des Animaux de l’Université de Californie à Davis (IACUC 15315).

Pour des tests in vivo d’inhibition tumorale avec des anticorps doubles contre CD47 et HER2 en présence ou en l’absence de radiothérapie, des souris femelles immunodéprimées (BALB /c) âgées de huit semaines (Charles River Laboratories, Sacramento, USA) ont été injectées avec 1 × 105 cellules mammaires 4T1 de souris dans les 4ème glandes mammaires. Lorsque les volumes tumoraux atteignaient environ 200 mm3, les souris étaient divisées au hasard en quatre groupes (6 souris par groupe). Des fragments de PBS, d’IgG, d’anti-CD47 F(ab’) (100 µg) ou d’Herceptine (5 mg/kg) ont été injectés dans les tissus tumoraux 4 h avant radiothérapie locale (5 Gy par jour pendant 2 jours). Des injections ont été effectuées et la taille des tumeurs a été surveillée tous les deux jours jusqu’à la fin des expériences. Les souris ont été euthanasiées lorsque les tumeurs mesuraient ~ 1400 mm3 ou lorsque les animaux semblaient inconfortables même lorsque la tumeur était inférieure à 1400 mm3 pour se conformer aux réglementations UCD IACUC pour l’utilisation d’animaux vertébrés dans la recherche. Le protocole d’utilisation et de soins des animaux de radiothérapie in vivo a été approuvé par le Comité Institutionnel d’Utilisation et de Soins des Animaux de l’Université de Californie à Davis (IACUC 15315).

Des macrophages infiltrés par des tumeurs et une phagocytose des macrophages

Des cellules 4T1 du cancer du sein de souris exprimant le GFP ont été implantées dans les 4e coussinets graisseux mammaires de souris BALB/c et le traitement a été commencé lorsque les tumeurs ont atteint environ 200 mm3 par injection tumorale de 50 µl de PBS contenant 100 µg d’IgG témoin, de fragments d’anti-CD47 F (ab’), d’Herceptine ou des deux anticorps tous les deux jours pendant trois fois. La RT locale tumorale a été administrée aux jours 10 et 11 avec 5 Gy / jour / tumeur pour deux fractions, dose totale = 10 Gy, et les expériences ont été terminées 2 jours après la fin des traitements par anticorps. Des tumeurs ont été extraites et des coupes FFPE ont été préparées pour une coloration par immunofluorescence selon la procédure standard: les lames ont été deparaffinisées et réhydratées, et les antigènes ont été récupérés pendant 40 min dans un tampon citrate (pH 6,1) à 95 ° C. Pour éliminer l’autofluorescence, les lames ont été trempées dans une solution de dés-autofluorescence (0,5 M CuSO4, 0,05 M NH4COOH dans H2O) à TA pendant 48 h, rincées à l’eau 5 min 3 fois, puis bloquées avec 1 : 100 sérum de cheval. L’incubation primaire des anticorps s’est faite à 4 °C pendant une nuit : anti-GFP (1:100 ; Dako), anti-CD11b (1:100; Millipore); Après lavage, les lames ont été incubées avec des anticorps secondaires conjugués fluorescents dilués 1: 250 (Rhodamine pour CD11b, Alexa Fluor 488 pour GFP) à RT pendant 1 h puis montées avec une solution Antifade Vectashield contenant du DAPI (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA). La phagocytose médiée par les macrophages a été détectée par microscopie fluorescente à l’aide du logiciel Axiovision (Zeiss, Allemagne) et des microphotographies ont été quantifiées par ImageJ.

Analyse statistique

Toutes les données expérimentales obtenues à partir d’études cellulaires in vitro et d’essais sur des animaux sont présentées en moyenne ± SE, analysées à l’aide du test t de Student à deux queues pour deux groupes ou de l’ANOVA pour plusieurs groupes. La signification statistique des courbes de survie de Kaplan–Meier a été évaluée à l’aide d’un test de Mann–Whitney. Le nombre d’expériences indépendantes et les répliques ont été indiqués dans les légendes de la figure. Les valeurs P < 0,05 ont été considérées comme significatives et sont indiquées par des astérisques comme suit : *P <0.05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001.

Résumé des rapports

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le Résumé des rapports de recherche sur la nature lié à cet article.