- Résumé
- 1. Introduction
- 2. Matériaux et méthodes
- 2.1. Animaux
- 2.2. Cultures cellulaires
- 2.3. Test de coloration par immunofluorescence
- 2.4. Western Blot
- 2.5. Réaction en chaîne de la polymérase quantitative (en temps réel) (PCR en temps réel)
- 2.6. Analyse statistique
- 3. Résultats
- 3.1. La Distribution des astrocytes Marqués par NDRG2, GFAP et S100ß dans différentes régions cérébrales
- 3.2. Les morphologies des Astrocytes Marqués par NDRG2, GFAP et S100ß dans différentes régions cérébrales
- 3.3. La colocalisation de NDRG2, GFAP et S100ß dans les astrocytes de différentes Régions cérébrales
- 3.4. L’expression des protéines NDRG2, GFAP et S100ß dans différentes régions cérébrales
- 4. Discussion
- Disponibilité des données
- Divulgation
- Conflits d’intérêts
- Contributions des auteurs
- Remerciements
- Matériaux supplémentaires
Résumé
Les astrocytes possèdent des caractéristiques morphologiques différentes selon la région cérébrale dans laquelle ils se trouvent. Cependant, aucun des marqueurs astrocytaires actuels ne peut marquer toutes les sous-populations avec succès. Il est donc essentiel d’identifier le marqueur approprié pour une recherche scientifique spécifique. Ici, nous avons comparé la distribution et l’expression protéique de trois marqueurs astrocytaires: NDRG2, GFAP et S100ß, dans le cortex, l’hippocampe et le thalamus. Les astrocytes NDRG2- et S100ß-positifs étaient répartis de manière plus uniforme que les astrocytes GFAP-positifs dans tout le cerveau. Les immunoréactivités NDRG2 et S100ß étaient les plus fortes dans le cortex dorsal et le thalamus, tandis que l’immunoréactivité GFAP était la plus forte dans l’hippocampe. De plus, les niveaux d’expression protéique de NDRG2, GFAP et S100ß chez les souris adultes étaient les plus élevés dans le cortex, l’hippocampe et le thalamus, respectivement. Nous avons également détecté la morphologie des astrocytes et constaté que, dans le corps calleux et le pédoncule cérébral, des astrocytes positifs au GFAP ont été trouvés avec des processus plus nombreux et plus longs que les astrocytes positifs au NDRG2 et au S100ß. Ces résultats démontrent que NDRG2 et S100ß sont plus convenablement utilisés pour visualiser la distribution globale et les changements du nombre d’astrocytes, ainsi que pour marquer les astrocytes dans le cortex et le thalamus. GFAP, cependant, est plus approprié pour marquer les astrocytes dans le corps calleux, le pédoncule cérébral et l’hippocampe. Ces résultats aident à guider les chercheurs dans le choix du marqueur astrocytaire approprié et suggèrent des différences de qualités immunologiques des astrocytes en fonction du tissu dans lequel ils se trouvent.
1. Introduction
Les astrocytes ont longtemps été considérés comme des cellules auxiliaires qui ne fournissent qu’un soutien trophique, métabolique et structurel aux neurones. Cependant, ces dernières années, des recherches approfondies ont montré qu’ils jouent un rôle crucial dans les fonctions physiologiques et pathologiques cérébrales. Les astrocytes aident au maintien de l’homéostasie ionique et des barrières hémato-cérébrales, à la formation et à l’élimination des synapses, ainsi qu’au contrôle du flux sanguin cérébral et à la régulation du recyclage des neurotransmetteurs, de l’excitotoxicité du glutamate et du stress antioxydant. Il est important de noter que les astrocytes possèdent des diversités morphologiques, démographiques et fonctionnelles dans différentes régions cérébrales. Par conséquent, l’identification du marqueur le plus approprié pour les sous-groupes polymorphes et multiples d’astrocytes est essentielle à la recherche sur la multifonction astrocytaire.
La protéine acide fibrillaire gliale (GFAP) est le marqueur astrocytaire le plus couramment utilisé, mais en tant que principal filament intermédiaire composant le cytosquelette, la GFAP n’a été immunomarquée qu’à environ 15% du volume total des astrocytes, et plus de 40% des astrocytes se sont révélés négatifs à la GFAP dans l’hippocampe du rat adulte. De plus, le GFAP a mal marqué les astrocytes humains protoplasmiques et s’est exprimé tardivement dans le développement des astrocytes fibreux.
Un autre marqueur astrocytaire couramment utilisé est le S100ß, un peptide de liaison au Ca2+ abondant dans le cytoplasme et le noyau des astrocytes qui est impliqué dans la régulation du cycle cellulaire et la modification du cytosquelette. Cependant, S100ß est également exprimé dans une sous-population d’oligodendrocytes matures, dans les cellules épithéliales du plexus choroïde et dans quelques neurones. Les lacunes du GFAP et du S100ß dans l’étiquetage des astrocytes peuvent entraîner des inexactitudes ou même des erreurs dans l’exploration des fonctions des astrocytes.
Le gène N-Myc 2 régulé en aval (NDRG2) a été découvert pour la première fois dans une banque d’ADNc cérébral humain normal par une méthode d’hybridation soustractive basée sur la PCR. C’est un suppresseur de tumeur et un gène lié au stress cellulaire associé à la prolifération et à la différenciation cellulaires. NDRG2 est largement exprimé dans le cortex cérébral, le bulbe olfactif, le médio-cérébral, l’hippocampe et le thalamus. Plus important encore, NDRG2 est spécifiquement exprimé dans les astrocytes du cerveau. Ainsi, NDRG2 est considéré comme un nouveau marqueur astrocytaire, en particulier pour les astrocytes matures, non réactifs et non proliférants. Cependant, la question de savoir si NDRG2 est plus fiable que GFAP et S100ß en tant que marqueur astrocytaire, ainsi que les différences de distribution et d’expression dans différentes régions cérébrales, n’a pas été rapportée.
Dans la présente étude, nous avons comparé la distribution, l’expression des protéines et la colocalisation mutuelle des marqueurs astrocytaires NDRG2, GFAP et S100ß dans tout le cerveau de souris. Nous avons cherché à identifier le marqueur le plus approprié pour les astrocytes dans différentes régions cérébrales.
2. Matériaux et méthodes
2.1. Animaux
Des souris mâles C57BL/6 jeunes, adultes et âgées de 1 mois, 3 mois, 6 mois, 9 mois et 12 mois ont été obtenues auprès du Centre des animaux expérimentaux de l’Université Central South. Les animaux étaient libres de manger et de boire, maintenus à une température de 25 ± 1 ° C et logés avec un cercle clair-foncé de 12: 12 h pour simuler le rythme circadien de l’animal. Tous les efforts ont été déployés pour minimiser la souffrance animale et réduire le nombre d’animaux utilisés. Toutes les procédures d’expérimentation animale ont suivi un protocole approuvé par le Comité d’Éthique pour l’Expérimentation Animale du Comité de Soins et d’utilisation des Animaux de l’Université Central South, en Chine.
2.2. Cultures cellulaires
Les cellules HT22 (une lignée cellulaire neuronale) et les cellules MA1800-57 (une lignée cellulaire astrocytaire) ont été cultivées dans le Milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM, HyClone) contenant 10% de sérum fœtal bovin (FBS, Gibco), 50 U/mL de pénicilline et 50 µg/mL de streptomycine. Les cellules OLN-93 (une lignée cellulaire oligodendrogliale) ont été conservées dans du DMEM additionné de FBS à 10%, de glutamine à 2 mM, de pénicilline à 50 U/mL et de streptomycine à 50 µg/mL. Les cellules ont toutes été maintenues à 37°C dans un mélange de 95% d’air atmosphérique et de 5% de CO2. Les cellules HT22, les cellules OLN-93 et les cellules MA1800-57 ont été ensemencées sur lames et ont été colorées avec des anticorps contre la protéine 2 associée aux microtubules (MAP2), l’α-tubuline et la GFAP, respectivement.
2.3. Test de coloration par immunofluorescence
Après anesthésie des souris avec du pentobarbital de sodium (50 mg / kg), leurs cerveaux ont été extraits et fixés avec 0,9% de solution saline héparinisée à froid et 4% de paraformaldéhyde. Après postfixation, les cerveaux ont été successivement déshydratés dans des solutions à 20% de saccharose et à 30% de saccharose. Des sections de 10 µm d’épaisseur ont été préparées à l’aide d’une trancheuse congelée Leica CM1900. Les coupes cérébrales ont été incubées dans 1% d’H2O2 pendant 15 min et 0,3% de Triton X-100 pendant 15 min, avec 3×lavages en post-incubation de PBS entre chaque traitement. Les coupes ont ensuite été bloquées dans du sérum de chèvre normal à 5% pendant 1 h à température ambiante et incubées pendant une nuit à 4 ° C dans une boîte humidifiante avec des anticorps primaires comme suit: anticorps anti-GFAP de souris (#3670, 1: 500, Technologie de Signalisation Cellulaire); anticorps anti-NDRG2 de lapin (#5667, 1: 200, Technologie de Signalisation Cellulaire); anticorps anti-NDRG2 de souris (#DA281-6A5, 1:100, Sigma); anticorps anti-S100ß de lapin (# 2017-1, 1:500, Epitomics); anticorps anti-Glutamine Synthétase (GS) de souris (#MAB302, 1:200, Millipore); anticorps anti-MAP2 de lapin (#ab32454, 1:500, Abcam); et anticorps anti-α-tubuline de souris (#T6199,1:500, Sigma). Ensuite, les sections ont été incubées avec des mélanges d’anticorps secondaires Alexa-488 (vert, Invitrogen) et Alexa-647 (rouge, Invitrogen) conjugués anti-lapin d’âne ou anti-souris d’âne pendant 2 h dans l’obscurité à température ambiante. Le 4,6-Diamidino-2-phénylindole (DAPI) (ZLI-9557, Zsbio) a été utilisé pour colorer les noyaux. Les sections ont été montées avec 50% de glycérol. Enfin, les coupes ont été vues et photographiées à l’aide d’un microscope à fluorescence Olympus BX51 (Japon). Les anticorps utilisés dans notre étude ont été largement utilisés dans nos études précédentes et par d’autres chercheurs, et la sensibilité et la spécificité de ces anticorps ont été confirmées.
2.4. Western Blot
Le cortex, l’hippocampe et le thalamus ont été prélevés sur des souris C57BL/6 âgées de 1 mois, 3 mois, 6 mois, 9 mois et 12 mois. Les échantillons ont été homogénéisés dans du tampon RIPA et la concentration des échantillons de protéines a été mesurée par le kit de dosage de protéines BCA (Pierce Biotechnology, États-Unis). Les échantillons de protéines ont été séparés par 10% de SDS-PAGE (kit de gel SDS-PAGE, CW0022S, Chine) et transférés électriquement sur des membranes en polyfluorure de vinylidène (PVDF). Les composants du kit de Gel SDS-PAGE comprenaient un Acr-Bis à 30%, un Tampon de Gel de Séparation SDS-PAGE, un Tampon de Gel d’empilement SDS-PAGE, un APS (persulfate d’ammonium) et du TEMED (N, N, N ‘, N’-tétraméthyléthylènediamine). Par la suite, les membranes ont été bloquées dans du lait sec non gras à 5% dilué dans du TBST (TBS avec 0,05% de Tween 20) pendant 1 h à température ambiante puis incubées avec des anticorps primaires spécifiques : anticorps anti-GFAP de souris (#3670,1:1000, Technologie de Signalisation Cellulaire); anticorps anti-NDRG2 de lapin (#5667, 1: 1000, Technologie de Signalisation Cellulaire); anticorps anti-S100ß de lapin (#2017-1, 1: 1000, Epitomics); et anticorps anti-GAPDH de lapin (#5174, 1: 1000, Technologie de Signalisation Cellulaire) pendant une nuit à 4 ° C. Les membranes ont ensuite été incubées avec un anticorps secondaire anti-lapin ou anti-souris conjugué HRP (Thermo Scientific, USA ) pendant 2 h. Des signaux chimiluminescents ont été développés à l’aide du réactif de Chimiluminescence de la Foudre Occidentale Plus (PerkinElmer Life Sciences; Wellesley, MA) et détectée par un analyseur d’images LI-COR Odyssey System (LI-COR Biotechnology, USA). L’immunoréactivité des bandes protéiques a été analysée quantitativement par le logiciel Bio-Rad® Image Lab™. Les valeurs de densité de bande ont été normalisées en GAPDH.
2.5. Réaction en chaîne de la polymérase quantitative (en temps réel) (PCR en temps réel)
Le cortex, l’hippocampe et le thalamus ont été collectés sur des souris C57BL/6 âgées de 1 mois, 3 mois, 6 mois, 9 mois et 12 mois. L’ARN total a été isolé à l’aide d’un kit d’ARN TransZol Up Plus (Code No. ER501-01, Transgen, Chine) et quantifiée à l’aide d’un NanoDrop 2000. Ensuite, 1000 ng d’ARN total ont été transcrits en inverse dans une réaction de 20 µL à 42 °C pendant 15 min, suivie de 85 °C pendant 5 sec à l’aide d’un SuperMix de synthèse d’ADNc Tout-en-un de Premier brin TransScript® pour qPCR (Code No. AT341, Transgen, Chine). Les composants du kit comprenaient un SuperMix Tout-en-Un 5 × TransScript® pour qPCR (TransScript® RT, Inhibiteur de RNase, Apprêt Oligo (dT) 18 Ancré, Apprêt aléatoire (N9), dNTPs, tampon), un SuperMix de contrôle sans RT 5 × TransScript® Tout-en-Un pour qPCR, un Dissolvant gDNA et une eau sans RNase. Le SuperMix de contrôle sans RT tout-en-un 5×TransScript® pour qPCR a été utilisé comme contrôle négatif. La PCR en temps réel a été réalisée dans une réaction de 20 µL selon le manuel du fabricant pour le SuperMix qRNA vert à pointe TransStart (Code No. AQ141, Transgen, Chine). Les séquences d’amorces d’ARNm utilisées se trouvent dans le tableau 1. La réaction a été effectuée à 94°C pendant 30 sec, suivie de 40 cycles de 94°C pendant 5 sec, 60°C pendant 15 sec et 72°C pendant 19 sec sur le système de détection PCR en Temps Réel ViiA7 (Thermocycleur 2720, Applied Biosystems). Les amorces et les séquences dérivées de l’expression relative de l’ARNm ont été analysées à l’aide de la formule.
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2.6. Analyse statistique
Des tests statistiques ont été réalisés à l’aide du logiciel PRISM v7.0 (GraphPad). Des comparaisons entre deux groupes ont été effectuées à l’aide des tests t de Student. Des comparaisons entre différents groupes ont été effectuées à l’aide d’ANOVA unidirectionnelle avec le post-test de Tukey. Toutes les valeurs ont été présentées comme la moyenne ± ET. Les valeurs de p < 0,05 ont été considérées comme statistiquement significatives.
3. Résultats
3.1. La Distribution des astrocytes Marqués par NDRG2, GFAP et S100ß dans différentes régions cérébrales
Les régions du cerveau de souris ont été identifiées en marquant les noyaux cellulaires. De plus, un atlas correspondant du cerveau de souris a été utilisé pour vérifier les régions spécifiques analysées (figure 1). Nous avons ensuite utilisé la coloration par immunofluorescence pour détecter la distribution des astrocytes marqués par NDRG2, GFAP et S100ß dans différentes régions cérébrales de souris mâles adultes âgées de 6 mois. Les astrocytes NDRG2- et S100ß-positifs étaient plus abondants et répartis plus uniformément que les astrocytes GFAP-positifs dans tout le cerveau (figure 2). Les astrocytes NDRG2 positifs étaient concentrés dans le cortex dorsal (Région 1) et le thalamus (Région 5), mais moins dans l’hippocampe (Région 4), le corps calleux (Région 3) et le cortex ventral (Région 2) et le moins dans le pédoncule cérébral (Région 6) (Figures 2(a) et 2(b)). Les astrocytes positifs au GFAP étaient les plus concentrés dans l’hippocampe; moins ont été détectés dans le corps calleux et le pédoncule cérébral et presque indétectables dans le cortex dorsal, le cortex ventral et le thalamus (Figures 2 (a) et 2(c)). Les astrocytes S100ß-positifs étaient principalement concentrés dans le cortex dorsal et le thalamus, moins dans l’hippocampe et le cortex ventral, et encore moins dans le pédoncule cérébral et le corps calleux (Figures 2(b) et 2(c)). La distribution des astrocytes NDRG2-positifs était similaire à celle des astrocytes S100ß-positifs.
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Les astrocytes de différentes régions cérébrales présentaient des immunoréactivités inégales à NDRG2, GFAP et S100ß (Figure 2). Les astrocytes du cortex dorsal et du thalamus ont réagi fortement à NDRG2 et à S100ß, mais faiblement à GFAP. Les astrocytes de l’hippocampe ont réagi fortement à la GFAP et modérément à la NDRG2 et à la S100ß. Les astrocytes du cortex ventral, du corps calleux et du pédoncule cérébral ont réagi faiblement à modérément à NDRG2, GFAP et S100ß (tableau 2).
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+++: fortement positif; ++: modérément positif; +: faiblement positif.
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La distribution des astrocytes marqués par NDRG2, GFAP et S100ß dans différentes régions cérébrales de souris mâles était similaire à celle des souris mâles âgées (12 mois) (Figure 3).
3.2. Les morphologies des Astrocytes Marqués par NDRG2, GFAP et S100ß dans différentes régions cérébrales
Les astrocytes sont principalement divisés en deux types: les astrocytes fibreux dans la matière blanche et les astrocytes protoplasmiques dans la matière grise. Par conséquent, nous avons comparé les morphologies des deux types marqués par différents marqueurs dans le corps calleux (substance blanche, Région 3) et l’hippocampe (matière grise, Région 4) (Figure 4). Les résultats de souris mâles adultes (6 mois) ont montré que les astrocytes NDRG2- et S100ß-positifs présentaient une forme étoilée caractérisée par un soma grand et rond ainsi que des processus cytoplasmiques courts et grossiers qui avaient peu de branches. Les astrocytes positifs au GFAP présentaient une forme radiale caractérisée par de petits soma, de longs processus et des multibranches (Figure 4). De plus, dans le corps calleux et le pédoncule cérébral, les astrocytes marqués par GFAP présentaient des processus plus longs et plus abondants que ceux marqués par NDRG2 et S100ß (Figures 5 et 7).
3.3. La colocalisation de NDRG2, GFAP et S100ß dans les astrocytes de différentes Régions cérébrales
NDRG2 était presque colocalisée avec GFAP dans les astrocytes du cortex ventral, du corps calleux et du pédoncule cérébral, et principalement colocalisée avec GFAP dans les astrocytes de l’hippocampe (Figures 5 et 8(a)). NDRG2 n’avait presque pas de colocalisation avec la GFAP dans les astrocytes du cortex dorsal et du thalamus (figure 5). NDRG2 et S100ß ont présenté une colocalisation presque complète dans les astrocytes des six régions cérébrales (Figures 6 et 8(b)). GFAP et S100ß présentaient une colocalisation significative dans les astrocytes du cortex ventral, du corps calleux et du pédoncule cérébral et une colocalisation presque complète dans les astrocytes de l’hippocampe (figure 7). Le GFAP et le S100ß n’avaient pratiquement aucune colocalisation dans les astrocytes du cortex dorsal et du thalamus (figure 7).
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Nous avons également détecté la colocalisation de NDRG2 et d’un autre fabricant astrocytaire, la glutamine synthétase (GS), dans les astrocytes du cerveau de souris. NDRG2 et GS présentaient une colocalisation significative dans les astrocytes (figure s1a). NDRG2 et GS ont présenté une colocalisation complète dans les astrocytes fibreux du corps calleux et dans les astrocytes protoplasmiques de l’hippocampe (Figure s1b). L’expression de la protéine NDRG2 dans les cellules de la lignée cellulaire neuronale HT22, les cellules de la lignée cellulaire oligodendrogliale OLN-93 et les cellules de la lignée cellulaire astrocytaire MA1800-57 ont également été détectées (figure s2). La protéine NDRG2 a été détectée dans les cellules MA1800-57 et a été à peine détectée dans les cellules HT22 et les cellules OLN-93 (figures s2a et s2b).
3.4. L’expression des protéines NDRG2, GFAP et S100ß dans différentes régions cérébrales
Nous avons utilisé le western blot pour détecter les niveaux d’expression des protéines NDRG2, GFAP et S100ß dans trois régions cérébrales de souris mâles adultes (6 mois): le cortex, l’hippocampe et le thalamus (Figure 8(c)). Nous avons analysé les niveaux d’expression de ces marqueurs dans la même région cérébrale (Figure 8(d)). Dans le cortex, le niveau d’expression de NDRG2 était nettement supérieur aux niveaux d’expression de GFAP et de S100ß (p< 0,001, p < 0,05). Le niveau d’expression de S100ß était également beaucoup plus élevé que GFAP (p< 0,05). Dans l’hippocampe, le niveau d’expression de la GFAP était supérieur à NDRG2 et S100ß (p<0.01), et le niveau d’expression de NDRG2 était un peu inférieur au niveau d’expression de S100ß, bien que la différence ne soit pas statistiquement significative. Dans le thalamus, le niveau d’expression de S100ß était significativement plus élevé que les niveaux d’expression de GFAP et de NDRG2 (p < 0,01), tandis que le niveau d’expression de NDRG2 était similaire à celui de GFAP.
Ensuite, nous avons analysé les niveaux d’expression d’un même marqueur dans différentes régions cérébrales (Figure 8(e)). Le niveau d’expression de NDRG2 dans le cortex était beaucoup plus élevé que dans l’hippocampe et le thalamus (p< 0,01), et aucune différence significative n’a été observée entre l’hippocampe et le thalamus. Le niveau d’expression de la GFAP dans l’hippocampe était le plus élevé parmi les trois régions (p< 0,001, p< 0,01); aucune différence significative n’a été observée entre le cortex et le thalamus. Le niveau d’expression de S100ß dans le thalamus était significativement plus élevé que dans le cortex et l’hippocampe (p<0.01), sans différence significative observée entre ces deux derniers.
Nous avons également détecté les taux de protéines de NDRG2, GFAP et S100ß dans le cortex, l’hippocampe et le thalamus de souris mâles âgées de 1 mois, 3 mois, 6 mois, 9 mois et 12 mois (Figures 9(a) -9 (f)). Les niveaux de protéines de NDRG2 et de GFAP dans le cortex, l’hippocampe et le thalamus augmentaient progressivement avec l’âge (p< 0,05, p< 0,01). Les niveaux de protéines de S100ß dans le cortex et le thalamus, mais pas dans l’hippocampe, ont augmenté progressivement avec l’âge (p<0.05, p < 0,01, p< 0,001). Les taux d’ARNm de NDRG2, de GFAP et de S100ß dans le cortex, l’hippocampe et le thalamus de souris mâles âgées de 1 mois, 3 mois, 6 mois, 9 mois et 12 mois étaient cohérents avec ceux des taux de protéines (p< 0,05, p < 0,01, Figures 9 (g) -9 ( i)).
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4. Discussion
Dans cette étude, nous avons constaté que les astrocytes marqués par NDRG2 et S100ß étaient distribués plus largement et uniformément que ceux marqués par GFAP dans tout le cerveau des souris jeunes, matures et âgées. Cela suggère que NDGR2 et S100ß sont des marqueurs plus appropriés pour observer la distribution globale et les changements de nombre d’astrocytes. De plus, nos résultats ont montré que les astrocytes de différentes régions cérébrales présentaient différents niveaux d’immunoréactivité à NDRG2, GFAP et S100ß, ce qui suggère que, dans le cortex et le thalamus, NDRG2 et S100ß sont des marqueurs astrocytaires plus appropriés que GFAP. L’immunoréactivité inégale des astrocytes à NDRG2, GFAP et S100ß pourrait également être due à la sensibilité et à la spécificité des anticorps que nous avons utilisés. De plus, les morphologies des astrocytes marqués par NDRG2 et S100ß étaient similaires les unes aux autres, mais étaient évidemment distinctes de celles marquées par GFAP car ces marqueurs étiquetaient des structures cytosquelettiques différentes. NDRG2 tache le cytoplasme et les membranes cellulaires et tache faiblement le noyau. GFAP colore principalement le soma et les processus, mais pas le noyau, tandis que S100ß colore le noyau et une partie du cytoplasme et des processus. En comparant les morphologies des astrocytes marqués par NDRG2, GFAP et S100ß, nous avons trouvé que le GFAP était un marqueur plus approprié pour les astrocytes du corps calleux, du pédoncule cérébral et en particulier de l’hippocampe. Les protéines NDRG2 et S100ß ont été exprimées le plus dans le cortex et le thalamus, respectivement. Nous en déduisons que NDRG2 convient mieux aux astrocytes du cortex tandis que S100ß convient mieux aux astrocytes du thalamus lors de la quantification de la densité astrocytaire. Les différents modèles d’expression protéique de NDRG2, GFAP et S100ß dans le cortex, l’hippocampe et le thalamus ont confirmé l’hétérogénéité fonctionnelle astrocytaire.
Les astrocytes jouent un rôle important dans le maintien de l’homéostasie et participent activement à presque tous les troubles neurologiques, tels que les accidents vasculaires cérébraux ischémiques, les lésions cérébrales traumatiques, la maladie d’Alzheimer et la maladie de Parkinson. Il a été démontré que la morphologie astrocytaire, l’expression des gènes et la fonction différaient entre les différentes régions du cerveau. Les astrocytes fibreux et les astrocytes protoplasmiques sont deux sous-populations majeures identifiées par leur morphologie. Les astrocytes fibreux ont des processus longs et minces et une apparence d’étoile, tandis que les processus protoplasmiques ont de nombreux processus fins, qui entrent en contact avec les synapses et les recouvrent. Fait intéressant, de nombreux gènes sont exprimés de manière hétérogène par des sous-ensembles d’astrocytes. Ces gènes codent des protéines telles que des transporteurs de glutamate et des canaux ioniques, ainsi que des récepteurs de glutamate, de dopamine et d’opioïdes.
L’hétérogénéité de l’expression des gènes impliquait la diversité fonctionnelle des astrocytes. Par exemple, l’absorption du glutamate diffère selon les différents sous-ensembles. De plus, les oscillations calciques spontanées diffèrent selon les différentes couches du cortex somatosensoriel. Les astrocytes corticaux de la couche 1 ont montré une activité Ca2+ asynchrone fréquente, tandis que les astrocytes de la couche 2/3 ont montré une activité Ca2+ synchrone peu fréquente. Dans le cortex, les astrocytes répondent au glutamate et à la noradrénaline avec une augmentation du calcium, tandis que les astrocytes de l’hippocampe présentent des réponses calciques à l’ATP, au GABA, au glutamate, à l’acétylcholine, aux prostaglandines et aux endocannabinoïdes. Des études ont également montré que les astrocytes cultivés de différentes régions du cerveau ont des capacités différentes pour stimuler la croissance et la ramification des neurites. Comme les astrocytes de différentes régions cérébrales présentent des caractéristiques morphologiques et fonctionnelles différentes, il est crucial pour les chercheurs en astrophysique d’identifier le marqueur le plus approprié pour les astrocytes de différentes régions cérébrales.
Bien que plusieurs protéines aient été signalées comme étant exprimées sélectivement par les astrocytes, aucune n’a été démontrée comme étant entièrement limitée à tous les sous-types astrocytaires. Le GFAP, le marqueur astrocytaire le plus utilisé, est exprimé préférentiellement dans les astrocytes de matière blanche par rapport à ceux de matière grise et ne parvient pas à marquer tous les processus des astrocytes. Plus important encore, il existe des sous-ensembles d’astrocytes négatifs GFAP qui présentent des courants K+ dépendants de la tension, tandis que les astrocytes positifs GFAP présentent le schéma classique des courants indépendants du temps et de la tension.
Des études antérieures ont montré que S100ß était capable de marquer les astrocytes dans la substance grise et la substance blanche; cependant, il était également exprimé dans quelques oligodendrocytes et neurones. S100ß s’est avéré être exprimé le plus dans les astrocytes du thalamus, un sous-type de cellules qui participent au nettoyage des débris daergiques produits par la dégénérescence des terminaux daergiques dans la maladie de Parkinson en facilitant la présence de lysosomes et la formation d’autophagosomes. L’analyse transcriptomique des astrocytes a identifié la famille des aldéhydes déshydrogénases 1, membre L1 (ALDH1L1), comme marqueur astrocytaire. Cependant, ALDH1L1 a également marqué des oligodendrocytes. De même, les transporteurs excitateurs d’acides aminés, le transporteur glutamate/ aspartate (GLAST), la glutamine synthétase (GS), le transporteur glutamate-1 (GLT-1), la vimentine, la connexine 43, l’aquaporine 4 et la glycoprotéine de surface cellulaire CD44 présentaient également des limitations lors du marquage des astrocytes.
NDRG2 est spécifiquement exprimé dans les astrocytes de rats et de souris et est associé à la croissance et à la maturation du cerveau embryonnaire en développement. En plus de la prolifération cellulaire, de la différenciation et des transports transmembranaires, la NDRG2 participe également aux réponses au stress, à la dépression, aux maladies ischémiques et aux troubles neurodégénératifs. Chez la souris et l’homme, le NDRG2 participe au développement du trouble déficitaire de l’attention/hyperactivité (TDAH), une maladie associée au centre de locomotion dans le cortex cérébral. Flugge et coll. a détecté l’expression de NDRG2 dans le cerveau des humains, des ouistitis, des musaraignes, des rats et des souris, et a suggéré que NDRG2 était un nouveau marqueur astrocytaire, en particulier pour les astrocytes matures, non réactifs et non proliférants. Dans cette étude, nous avons d’abord détecté le schéma de distribution des astrocytes NDRG2 positifs dans différentes régions cérébrales et des différences avec les astrocytes marqués par les marqueurs classiques GFAP et S100ß.
Les astrocytes et les marqueurs astrocytaires ont changé pendant le vieillissement normal du cerveau. Des travaux antérieurs ont montré que les astrocytes sont activés tôt dans le vieillissement, et l’augmentation significative des astrocytes positifs au GFAP a été trouvée dans les régions hippocampiques de souris âgées. Les niveaux de protéine GFAP et d’ARNm GFAP ont augmenté dans diverses parties du cerveau vieillissant, telles que le cortex cérébral, l’hippocampe et le cervelet. Des divergences subsistent entre les divers rapports de S100ß dans le cerveau vieillissant. De plus en plus, des études ont montré que la NDRG2 est associée à des troubles liés à l’âge tels que la maladie d’Alzheimer. Dans notre étude, les niveaux d’ARNm GFAP et NDRG2 dans le cortex, l’hippocampe et le thalamus ont progressivement augmenté avec l’âge, tandis que les niveaux d’ARNm S100ß dans l’hippocampe et le thalamus ont augmenté avec l’âge, mais pas dans le cortex.
Il faut noter qu’actuellement, de nombreux marqueurs en plus de ceux que nous avons testés, tels que ALDH1L1, GLAST, GLT-1, CD44 et vimentine, sont utilisés pour étiqueter les astrocytes. Dans notre étude, nous n’avons comparé que les astrocytes cérébraux classiques marqués par le nouveau marqueur proposé NDRG2 et les marqueurs les plus couramment utilisés: GFAP, S100ß et GS dans le cerveau.
En conclusion, notre étude indique que NDRG2 et S100ß sont des marqueurs plus appropriés pour les astrocytes du cortex et du thalamus, respectivement, ainsi que pour observer la distribution globale et les changements du nombre d’astrocytes dans le cerveau. Pendant ce temps, GFAP est supérieur à NDRG2 et S100ß lors de l’étiquetage des processus et des branches des astrocytes dans le corps calleux, le pédoncule cérébral et surtout l’hippocampe. Notre étude montre l’importance de choisir le marqueur le plus approprié pour les astrocytes dans différentes régions cérébrales de souris, ce qui fournit des conseils aux chercheurs en neurosciences lors de l’exploration des fonctions astrocytaires.
Disponibilité des données
Les données utilisées pour étayer les résultats de cette étude sont incluses dans l’article.
Divulgation
Zengli Zhang et Zhi Ma sont les co-premiers auteurs.
Conflits d’intérêts
Les auteurs déclarent n’avoir aucun conflit d’intérêts.
Contributions des auteurs
Zengli Zhang et Zhi Ma ont également contribué à cette étude.
Remerciements
Ce travail a été soutenu par la Fondation des Sciences Naturelles de Pékin (n ° 7194321 à Lixia Zhang), la Fondation Nationale des Sciences Naturelles de Chine (n ° 81801138 à Yulong Ma, n ° 81771206 à Wangyuan Zou), la Bourse de Recherche pour Jeunes Chercheurs de l’Association des Anesthésistes Chinois (n ° 21700001 à Yulong Ma), la Fondation Miaopu de la PLA Chinoise Hôpital général (no. 18KMM47 à Lixia Zhang), et la Commission de technologie de la Science municipale de Beijing & (no. 1811000017180022 à Hang Guo).
Matériaux supplémentaires
Figure supplémentaire 1. La colocalisation de NDRG2 et GS dans les astrocytes. Figure supplémentaire 2. L’expression de la protéine NDRG2 dans les lignées cellulaires. (Documents supplémentaires)