Les lymphocytes T humains expriment CD25 et Foxp3 lors de l’activation et présentent des phénotypes effecteurs/mémoire sans fonction régulatrice /suppressive

L’activation des lymphocytes T induit l’expression de CD25 et Foxp3 associés à la différenciation des phénotypes effecteurs et mémoires

Les PBMC ont été stimulés avec de la bryostatine-1 (5 nM) et ionomycine (1 µM) (B/I) en présence de 80 U/mL d’IL-2 (Peprotech) pendant 16 h. L’activation B / I imite les signaux intracellulaires qui entraînent l’activation des cellules T en augmentant l’activité de la protéine kinase C et le calcium intracellulaire, respectivement. Les cellules ont été lavées trois fois et cultivées à 106 cellules/mL en milieu complet avec 40 U/mL d’IL-2 (Peprotech) pendant 3 jours et l’expression de Foxp3 a été déterminée par cytométrie en flux. L’expression de FoxP3 a également été déterminée sur des lymphocytes T fraîchement isolés au jour 0. Comme le montre la Fig. 1A (panneau supérieur), la présence d’IL-2 seule pendant 3 jours n’a pas augmenté de manière marquée l’expression de Foxp3 ou de CD25 au-dessus des niveaux de référence au jour 0 (Fig. 1C). Cependant, l’activation B/I a induit l’expression de Foxp3 et de CD25 dans les lymphocytes T CD4+ et CD8+ (Fig. 1A, panneau central). Lors de l’activation B / I, les lymphocytes T CD4 + CD25 + Foxp3+ ont été augmentés de 1% à 23% (P = 0,016) et les lymphocytes T CD8 + CD25 + Foxp3+ ont été augmentés de 0,6% à 9% (P = 0,013). L’extension de la culture en présence d’IL-2 pendant 6 jours sans stimulation supplémentaire a retenu les lymphocytes T CD4 + CD25 + Foxp3+ au-dessus des niveaux de référence chez les lymphocytes T non activés (1% vs 7%; P = 0,031) tandis que les lymphocytes T CD8 + CD25 + Foxp3+ ont chuté aux niveaux de référence (0,6%). Ces résultats suggèrent que l’expression induite par l’activation de Foxp3 dans les lymphocytes T CD4 + CD25+ est plus stable que celle des lymphocytes T CD8 + CD25+. Le nombre absolu de lymphocytes T a augmenté 3 et 6 jours après la stimulation et l’expansion B/ I en présence d’IL-2 (Fig. 1B). L’activation des lymphocytes T au moyen d’Abs anti-CD3 / CD28 pendant 3 jours a produit des résultats similaires à ceux de l’activation B / I en augmentant les lymphocytes T CD4 + CD25 + FoxP3 + de 0,4% à 8,7% (Fig. 1C). Les analyses de phénotypes des lymphocytes T ont révélé des phénotypes effecteurs CD44+ et mémoire CD44+ CD62L+ avant et 6 jours après l’activation B/I (Fig. 1D, panneau supérieur). Alors que les lymphocytes T effecteurs CD4+ et CD8+ étaient réduits après activation (18% à 9% et 21% à 13%, respectivement), les lymphocytes T mémoire CD4+ et CD8+ étaient augmentés (82% à 91% et 79% à 87%, respectivement). Lors de l’activation B / I, les lymphocytes T CD4+ ont montré une augmentation de 6 fois de l’expression de FoxP3 dans les phénotypes CD44+, CD62L + (CD44+: 2,6% à 15%; CD62L +: 2% à 12%). De plus, les lymphocytes T CD4+ et CD8+ ont montré une expression FoxP3high après l’activation par rapport à l’expression FoxP3low au jour 0 (Fig. 1D, panneaux du milieu et du bas). Toutes les cellules T CD4+ Foxp3+ ont exprimé CD44 parmi lesquelles 80% ont également exprimé CD62L (Fig. 1D, panneau du milieu, à l’extrême droite). Ces données montrent que 20% des lymphocytes T CD4+ Foxp3+ sont effecteurs et 80% sont des phénotypes de mémoire. Une tendance phénotypique similaire a été détectée pour les lymphocytes T CD8+ Foxp3+, montrant 100% de CD44+ dont 67% de lymphocytes T CD62L+ (Fig. 1D, panneau inférieur, à l’extrême droite). Ces résultats montrent que 33% des lymphocytes T CD8+ Foxp3+ sont effecteurs et 67% sont des phénotypes de mémoire. Données présentées aux Fig. 1A-D suggère que l’expression accrue de FoxP3high dans les cellules T effectrices était due à la différenciation cellulaire plutôt qu’à la prolifération cellulaire, car le pourcentage relatif des cellules T effectrices CD44 + CD62L diminuait après l’activation de B / I. Un mécanisme similaire peut exister dans les cellules T de la mémoire en raison de l’expression de FoxP3high après activation par rapport à FoxP3low au jour 0.

L’expression de FoxP3 induite par l’activation dans les lymphocytes T CD4+ ne transmet pas la fonction régulatrice in vitro

Les lymphocytes T ont été marqués avec CFSE et stimulés avec de l’Abs anti-CD3 (1 ug /ml) et anti-CD28 (1 ug/ml) en présence ou en absence du CD4+CD25 activé par B/I + Cellules T FoxP3 + (rapports répondeur: suppresseur 2: 1 et 20: 1) pendant 3 jours. L’analyse par cytométrie en flux a montré des taux similaires de prolifération des lymphocytes T CD8+ fermés en l’absence ou en présence de lymphocytes T FoxP3+ inductibles (Fig. 2A, 60 % contre 61 % et 65 %). L’activation CD3/CD28 a également induit l’expression de FoxP3 dans les lymphocytes T CD4+ répondeurs. Les lymphocytes T CD4+ FpxP3+ fermés ont également montré une prolifération de 70 à 75% lors de l’activation (Fig. 2 BIS). L’analyse de l’apoptose des lymphocytes T a révélé des taux d’apoptose similaires chez les lymphocytes T répondeurs en l’absence ou en présence de lymphocytes T CD4+ FoxP3+ (Fig. 2B, 57% contre 57 et 59%). La majorité des lymphocytes T CD4+ FoxP3+ activés par B /I (74-76%) se sont révélés apoptotiques lors de l’activation anti-CD3/ CD28 en co-culture avec des lymphocytes T répondeurs.

L’activation allogénique des lymphocytes T pendant la MLR induit l’expression de Foxp3 dans les lymphocytes T CD4+ CD25+ associés à un phénotype effecteur/mémoire

Nous avons effectué une MLR allogénique de 8 jours pour déterminer si l’induction de l’expression de Foxp3 dans les lymphocytes T était stable pendant la MLR et si une telle expression de Foxp3+ induite pourrait inhiber Prolifération des lymphocytes T. Des cellules répondeuses et stimulatrices ont été obtenues auprès de différents donneurs sains. Des cellules stimulatrices ont été irradiées (5000 rad) et cultivées avec des cellules répondeuses pendant 8 jours en présence de BrdU de 10 µM (BD Pharmingen). Les cellules ont ensuite été colorées avec de l’Abs pertinent et soumises à une analyse de cytométrie en flux. Comme le montre la Fig. 3A (panneau supérieur) 86% des lymphocytes T CD4 + CD25+ et 93% des lymphocytes T CD8 + CD25+ ont montré une incorporation de BrdU à la suite de la prolifération cellulaire. Aucune prolifération n’a été détectée dans les cellules du répondeur ou du stimulateur seules (données non présentées). Une telle prolifération allogénique a eu lieu en présence d’une expression de Foxp3 induite par l’activation dans les lymphocytes T CD4+ telle que 8% des lymphocytes T CD4+ étaient CD25+ Foxp3+ (Fig. 3A, panneau inférieur). Les cellules T CD8 + CD25+, en revanche, n’ont pas montré d’expression stable de Foxp3. Ces résultats sont cohérents avec notre observation de la Fig. 1 montrant que l’expression de Foxp3 dans les lymphocytes T CD4+ est plus stable que celle des lymphocytes T CD8+ 6 à 8 jours après l’activation des lymphocytes T. Dans des rapports précédents, des essais suppressifs in vitro ont été réalisés en présence de rapports élevés de lymphocytes T CD4+ CD25+ (Treg) sur les cellules répondeuses, afin de déterminer la fonction suppressive sur l’activation et la prolifération des lymphocytes T. De telles augmentations artificielles du rapport des cellules T CD4 + CD25+ aux cellules répondeuses réduiraient la validité in vivo de l’observation. La fréquence des lymphocytes T CD4 + CD25 + Foxp3+ induits pendant la MLR était de 8%, ce qui est considéré comme se situant dans la plage physiologiquement pertinente telle que rapportée par d’autres groupes. La fréquence des Tregs naturels chez la souris se situe également autour de cette plage, tout en ayant des effets régulateurs pour l’inhibition de l’auto-immunité. Si les cellules T CD4+ exprimant Foxp3 avaient une fonction régulatrice, elles auraient dû inhiber la prolifération cellulaire pendant la culture in vitro. Comme pour l’activation des lymphocytes T induite par B/I, les phénotypes des lymphocytes T dans une MLR comprenaient des effecteurs CD44+ (16 %) et des lymphocytes T mémoire CD44+ CD62L+ (84%) (Fig. 3B). Là encore, toutes les cellules T CD4+Foxp3+ ont exprimé CD44 parmi lesquelles 90% ont également exprimé CD62L (Fig. 2B). Ces données montrent que 10% des lymphocytes T CD4+ Foxp3+ sont effecteurs et 90% sont des phénotypes de mémoire. Une tendance phénotypique similaire a été détectée pour les lymphocytes T CD8+ Foxp3+, montrant 100% de CD44+ dont 76% étaient des lymphocytes T CD62L+. Ces résultats montrent que 24% des lymphocytes T CD8+ Foxp3+ sont effecteurs et 76% sont des phénotypes de mémoire. L’absence de fonction régulatrice chez ces lymphocytes T Foxp3+ peut être due à leur phénotype effecteur/mémoire puisqu’il a été rapporté que l’expression de Foxp3 dans les lymphocytes T de la mémoire humaine entraînait une diminution de l’activité suppressive. De plus, les cellules Treg de type 1 (Tr1) confèrent une fonction suppressive en l’absence d’expression de FoxP3. Étant donné le rôle de Foxp3 en tant que régulateur principal de l’engagement et du maintien de la lignée Treg chez la souris, il ne semble pas avoir une fonction de régulation aussi fiable de l’engagement de la lignée Treg chez les lymphocytes T humains.