Étiquetage expérimental de la RuBisCo:
Aedans(454): donneur F(58): accepteur
Études de liaison:
Termes:
Balle ADP: complexe de GroEL lié à GroES et ADP
ApoGroEL: Juste GroEL comlex (utilisé dans des études de liaison antérieures du substrat de RuBisCo)
Lin et al. déterminé que:
1. Il y avait une différence de FRET lors de la liaison du substrat à l’anneau trans de la balle ADP par rapport à l’anneau apoGroEL.
– Ceci a été évident par l’extinction de la fluorescence du donneur (B.)
– Cela indique une différence de conformation du substrat protéique.
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2. Trouvé un déploiement « passif » de protéines de substrat liées au cycle d’apogée.
– Cependant, ce déroulement s’est produit beaucoup plus lentement que le cycle de réaction fonctionnel de GroEL.
3. Il y a moins de déploiement « passif » du substrat lié au trans-anneau de balle ADP.
– Cela a été confirmé par des études de digestion par protéase.
– Cependant, c’est le complexe le plus physiologiquement pertinent.
– Est-ce donc un niveau efficace au maximum, ou seulement la première étape du cycle de réaction?
Pour tester la pertinence physiologique, ils ont ajouté de l’ATP à la réaction par balle de l’ADP et ont surveillé la FRET
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Lors de l’ajout d’ATP, ils ont trouvé:
– Une expansion initiale de conformation rapide et forcée
du substrat
– puis une phase de compactage plus lente
– Évidente sur la figure b |
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– La figure c indique que la cinétique de la phase de compactage est dépendante de la concentration de Groes, ce qui signifie qu’elle dépend du mécanisme de séquestration du complexe.
– Alors que la phase d’expansion est indépendante de la concentration de GroES.
A conclu qu’il y a deux phases de déploiement:
– Déploiement passif lent dû à la liaison du substrat à l’anneau trans de la chambre de GroEL (de la première expérience de liaison)
– Déploiement rapide, entraîné par l’ATP, dû au changement de conformation de la chambre de GroEL.
Le déploiement rapide ne dépend pas des GroES:
– Un excès d’une variante de GroEL à anneau unique, SR1, a été utilisé comme piège à GroES.
– SR1 est incapable de lier le substrat et de catalyser une réaction de déploiement, mais est capable de lier et de séquestrer des GroES pour déterminer la dépendance de la réaction sur la séquestration du substrat.
– Ils ont déterminé que le déploiement rapide surveillé par la FRETTE s’est produit sans le bouchon de GroES présent, et la phase de compactage subséquente n’a pas eu lieu.
– Ceci indique que la phase d’expansion rapide dépend du changement de conformation du GroEL induit par la liaison à l’ATP.
So.. le dépliage du substrat est-il nécessaire pour un pliage productif?
– Est-ce une étape essentielle, et importante pour le mécanisme de pliage GroEL / GroES?
– Ils ont constaté que la fraction de RuBisCo non indigène qui émerge dans l’état natif est proportionnelle à l’étendue du déploiement.
– Pour examiner cela, ils ont voulu mesurer le déroulement lent et passif du substrat dû à la liaison de GroEL seule (pas dépendante de l’ATP
)
– Ils ont de nouveau utilisé la liaison SR1 au substrat, cette fois non pas comme atrap, mais comme site de liaison à déploiement passif pour le substrat.
– Le temps d’incubation avec SR1 est corrélé à la quantité de dépliage, puisque le dépliage n’est dû QU’à la liaison du substrat.
– Ils ont déterminé qu’il existe une corrélation entre la quantité de dépliage et la protéine native.
– Ainsi, le dépliage forcé de GroEL / GroES est un moyen efficace de promouvoir le mécanisme de dépliage
nécessaire au repliement correct des protéines.
