Mécanismes d’action du Du-Huo-Ji-Sheng-Tang sur la Dégradation du Cartilage chez un modèle d’arthrose de Lapin

Résumé

Du-Huo-Ji-Sheng-Tang (DHJST) est une phytothérapie traditionnelle chinoise utilisée pour traiter l’arthrose. Dans la présente étude, l’effet thérapeutique de la DHJST sur la dégradation du cartilage dans un modèle d’arthrose chez le lapin a été étudié. Dans les articulations du genou des lapins, une transection du ligament croisé antérieur (ACLT) a été réalisée pour induire une arthrose expérimentale. À la fin de la sixième semaine, 30 lapins atteints d’ACLT ont été divisés en six groupes, le groupe témoin, le groupe DHJST et le groupe Osaminéthacine (SAOS), qui ont été suivis pendant encore 4 semaines. Les trois autres groupes de lapins atteints d’ACLT n’ont pas été traités par DHJST ou OSA, qui ont été sacrifiés après 6 semaines et ont servi de témoins temporels de 6 semaines. Les résultats ont indiqué qu’à la fin de la sixième semaine après la chirurgie, il y avait une dégénérescence histologique significative dans le groupe témoin par rapport au groupe normal. Dans le groupe témoin, le score moyen pour la dégénérescence histologique augmentait encore à la 10e semaine, et il y avait un score moyen significativement plus bas pour la dégénérescence histologique dans le groupe DHJST par rapport au groupe témoin. Pour rechercher le mécanisme potentiel, le niveau d’expression de VEGF et de HIF-1α ont été détectés. L’expression de l’ARNm VEGF et de l’ARNm HIF-1α est faible dans le groupe normal, tandis que les activités augmentent progressivement dans le groupe témoin. Cependant, par rapport à celui du même groupe modèle de point de temps, l’activité du VEGF et du HIF-1α a diminué de manière significative dans le groupe DHJST. En conclusion, le DHJST exerce un effet thérapeutique significatif sur les lapins arthrosiques, et des mécanismes sont associés à l’inhibition de l’expression du VEGF et du HIF-1α.

1. Introduction

L’arthrose (arthrose) est une maladie évolutive et débilitante qui peut prendre des années à se manifester cliniquement chez les personnes atteintes. Le vieillissement du cartilage et la sénescence des chondrocytes jouent un rôle important dans la pathogenèse et le développement de l’arthrose. Au cours du développement de l’arthrose, il y a souvent une augmentation focale de la mort cellulaire. De nombreux rapports ont révélé que la sénescence des chondrocytes contribue au risque de dégénérescence du cartilage en diminuant la capacité des chondrocytes à maintenir et à réparer le tissu cartilagineux articulaire. Comme il est théorisé que chaque chondrocyte est responsable du maintien de la matrice extracellulaire qui l’entoure et que les molécules matricielles produites dans une région du tissu ont une capacité très limitée à traverser le tissu, la perte focale de cellules viables pourrait être partiellement responsable de l’incapacité des tissus à réparer des dommages mineurs.

Actuellement, il n’existe pas de remède contre l’arthrose et les traitements disponibles ne font que ralentir la progression de la maladie. Au cours des 20 dernières années, la médecine traditionnelle chinoise (MTC) a connu des progrès significatifs contre l’arthrose, notamment en améliorant les résultats cliniques des patients, en inhibant la réaction inflammatoire et la dégénérescence du cartilage. Des études in vivo et in vitro ont également montré que la formule des herbes chinoises comporte de multiples actions complètes contre l’arthrose. Du-Huo-Ji-Sheng-Tang, composé de Radix Angelicae Pubescentis, Herba Taxilli, Herba Taxilli, Radix Acanthopanacis Bidentatae, Herba Asari, Radix Gentianae Macrophyllae, Cortex Cinnamomi et Poria, a été largement utilisé pour traiter l’arthrose. Il peut améliorer les symptômes cliniques, la fonction du genou et la qualité de vie des patients. Sur la base de nos connaissances sur la pathogenèse de l’arthrose dans la MTC, nous avons étudié l’effet de la DHJST sur la prévention de la dégénérescence cartilagineuse de l’arthrose chez le lapin et observé ses mécanismes.

2. Méthodes

2.1. Matériaux

Le système de détection colorimétrique de l’apoptose en impasse (test TUNEL) a été obtenu auprès de la société Nanjing Jiancheng Biotech (Chine). Le kit d’extraction d’ARN total Trizol, le marqueur moléculaire d’ADN, le SYBR Premix EX TaqTM et le kit Perfect Real Time ont été achetés auprès de Invitrogen Co. (USA). Herbes dans DJST (composées de Radix Angelicae Pubescentis, Herba Taxilli, Herba Taxilli, Radix Acanthopanacis Bidentatae, Herba Asari, Radix Gentianae Macrophyllae, Cortex Cinnamomi et Poria, fournies par Shanghai Huayu Chinese Herbs Co. Ltd., Chine) ont été accrédités par un pharmacognosiste selon des protocoles standard, préparés par l’Hôpital Municipal de Médecine traditionnelle chinoise de Shanghai, les composants ont été mélangés dans l’ordre avec le rapport de 2 : 1 : 1 : 1 : 0.2 : 1 : 0.3 : 1 ( poids sec), Les médicaments ont été extraits avec des méthodes standard selon la Pharmacopée chinoise (Pharmacopée chinoise et Comité, 2000). Ces médicaments bruts ont été trempés dans de l’eau distillée et bouillis deux fois pendant 30 min, et la solution médicamenteuse a été filtrée à travers un maillage, puis le filtrat a été concentré à 4 g mL−1 par une pompe à vide puis stocké à -20 ° C jusqu’à utilisation. Osaminéthacine (SAOS), chaque comprimé contient 25 mg d’indométacine et 75 mg d’aminoglucose (fournis par Hebei Jizhong Pharmaceutical Co. Ltd., Chine), a été utilisé comme médicament de contrôle positif.

2.2. Lapins et préparation des tissus

Des lapins blancs néo-zélandais âgés de quarante-huit mois ont été fournis par le Centre des animaux expérimentaux à l’Académie chinoise des Sciences. Trente lapins ont subi une transection unilatérale du ligament croisé antérieur (ACLT) sous anesthésie générale. Les lapins normaux n’ont pas subi de procédure.

À la fin de la sixième semaine, les 30 lapins atteints d’ACLT ont été divisés en six groupes, le groupe témoin, le groupe DHJST et le groupe OSA, qui ont été suivis pendant encore 4 semaines. Les trois autres groupes de lapins atteints d’ACLT n’ont pas été traités par DHJST ou OSA, qui ont été sacrifiés après 6 semaines et ont servi de témoins temporels de 6 semaines. Les décoctions ont été administrées par voie orale à la dose 0.923 g (kg−1 · j−1) pendant 4 semaines, des lapins du groupe AOS ont reçu 0,09 g (kg−1 · j−1) d’AOS pendant une période de 4 semaines, le groupe témoin modèle et le groupe normal ont été administrés par voie orale avec le même volume de solution saline physiologique.

Des lapins ont été sacrifiés pour l’échantillonnage. Le protocole a reçu l’approbation du comité d’expérimentation Animale du Centre Médical Universitaire de Shanghai, en Chine. Les tibias du lapin ont été retirés et le cartilage articulaire du tibia a été immédiatement stocké à -80 ° C. Les tibias ont été soigneusement disséqués et nettoyés du muscle adjacent et immédiatement fixés dans du formol à 10% pendant 24 heures. Les tibias ont ensuite été décalcifiés pendant 4 semaines dans de l’acide tétraacétique à 100 g /L d’éthylènediamine, lavés dans du PBS, déshydratés par une série d’éthanol et noyés dans de la paraffine de manière standardisée pour assurer une bonne orientation. Des coupes de tissu de paraffine (7 µm) ont été découpées de manière standardisée. Les coupes ont été déparaffinées pour des analyses histochimiques.

2.3. Évaluation histologique du cartilage

Une évaluation histologique a été réalisée sur les articulations fémorotibiales de lapins du groupe DHJST, du groupe OSA et des groupes témoins. Les sections ont été colorées avec du vert Safranin O-fast. Ces coupes histologiques de chaque site ont été évaluées à l’aide d’un système de classement Mankin modifié (tableau 1) par deux vétérinaires pathologistes indépendants et certifiés par le conseil.

2.4. Essai TUNEL

L’apoptose induite par l’H2O2 a été détectée en effectuant le test de marquage terminal dUTP nick end-labeling (TUNEL) médié par la désoxynucléotidédyl transférase à l’aide d’un kit Apo-DirectTM (CalBiochem, San Diego, CA). TUNEL a été effectué selon les instructions du fabricant. Brièvement, après des prétraitements et une exposition à H2O2, les cellules ont été récoltées, lavées, fixées, perméabilisées et marquées pour les ruptures de brins d’ADN, puis analysées sur un cytomètre en flux Coulter Epics Elite (Beckman-Coulter, Miami, États-Unis). Tous les essais ont été réalisés en trois exemplaires.

2.5. PCR quantitative fluorescente

L’ARN total a été extrait de 50 mg de cartilage dans les tibias articulaires à l’aide du réactif Trizol. La synthèse de l’ADNc a été réalisée en utilisant 4 µg d’ARN total par échantillon avec des amorces et des réactifs aléatoires contenus dans le kit de synthèse de l’ADNc de premier brin Revert Aid. Deux micro litres (2 µL) de chaque échantillon ont été utilisés pour la PCR en temps réel dans un système Rotor-Gene 2000 (Australie). La quantification relative a été calculée à l’aide de la quantification relative du seuil du cycle delta (). Le cycle seuil () pour l’ARNm CAPDH de contrôle endogène et les signaux cibles ont été déterminés, et la quantification relative de l’ARN a été calculée à l’aide d’une méthode comparative où

Les séquences d’amorces utilisées pour le facteur de croissance endothélial vasculaire (VEGF) sont: 5′-TGCCCACCGAGGAGTTCA-3 (en avant) et 5′-GGCCCTGGTGAGGTTTGAT-3 (en arrière) (longueur du produit: 75 pb).Les séquences d’amorces utilisées pour le facteur 1α inductible par hypoxie (HIF-1α) sont les suivantes: 5′-CAGTGCAAAAGACAGGTGGAAG-3 (en avant) et 5′-CCCTGTATGGTGGTGATGTTGT-3 (en arrière) (longueur du produit: 107 pb).Les séquences d’amorces utilisées pour GAPDH sont : 5′-CCGAGGGCCCACTAAAGG-3 (en avant) et 5′-GCTGTTGAAGTCACAGGAGACAA-3 (en arrière) (longueur du produit: 88 pb).

2.6. Analyse statistique

Tous les résultats ont été exprimés en moyenne et écart type (ET). Les données de mesure ont été analysées à l’aide d’une analyse unidirectionnelle des variances (ANOVA, SPSS 11.0). Les données de rang ont été analysées avec ridit. Le résultat de P <.05 était considéré comme statistiquement significatif.

3. Résultats

3.1. La dégénérescence histologique induite par l’ACLT chez le Lapin a été réduite par DHJST

Des coupes histologiques représentatives sont présentées à la figure 1. À la fin de la 10e semaine, nous avons observé une intégrité normale de la surface articulaire dans le groupe normal (Figure 1(a)). Dans le groupe témoin, avec une dégénérescence accrue, il y avait une perte de coloration verte O-fast à la Safranine accompagnant la formation de fentes qui s’étendaient dans les zones moyennes et profondes (Figure 1 (b)), et dans le groupe DHJST, il y avait une perte de coloration verte O-fast à la Safranine et une perte de coloration verte O-fast à la Safranine a été observée avec le regroupement des chondrocytes (Figure 1 (c)). Groupe OSA, avec perte de coloration verte O-fast à la Safranine, ces changements étaient similaires au groupe DHJST (Figure 1 (d)). À la fin de la sixième semaine après la chirurgie, il y avait des différences histologiques significatives dans le groupe témoin par rapport au groupe normal (P<.01). Dans le groupe témoin, le score moyen pour la coloration verte O-fast à la Safranine a encore augmenté à la 10e semaine par rapport à celui de la 6e semaine (P<.01) (Figure 2 a)). Au 10e week-end, il y avait des différences significatives dans le score de Mankin entre le groupe témoin et le groupe DHJST, il y avait un score moyen significativement plus bas pour la coloration verte à la Safranine O-fast dans le groupe DHJST par rapport au groupe témoin (P <.01) (Figure 2(b)), et aucune différence statistiquement significative dans le score de Mankin entre le groupe DHJST et le groupe OSA (P>.05).

(a)

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(d)

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Figure 1

Histological examination of cartilage (Safranin O-fast green staining, ×100).

(a)

(b)

(c)

(d)

(a)
(b)
(c)
(d)

Figure 2

The influence of DHJST on histological parameters and apoptotic of chondrocytes. Les résultats ont été présentés sous forme de moyennes ± ET (n = 5 par groupe) dans chaque colonne. *P <.01 par rapport au groupe témoin de l’arthrose à la 6e semaine, **P<.01, par rapport à ceux du groupe témoin de l’arthrose.

3.2. La DHJST a inhibé l’apoptose des cellules cartilagineuses

À la fin de la sixième semaine après la chirurgie, l’indice de cellule d’apoptose dans le groupe témoin par rapport à celui du groupe normal était significativement différent (P <.01). Dans le groupe témoin, l’indice de cellule d’apoptose était encore fortement augmenté (de la moyenne ± SD 0,35 ± 0,13 à la sixième semaine à 0,62 ± 0,10 à la 10e semaine; P <.01) (Figure 2 c)). À la fin de la 10e semaine, par rapport au groupe DHJST, l’indice de cellule d’apoptose augmente remarquablement dans le groupe témoin (P<.01) (Figure 2 d)). Il n’y avait pas de différences significatives dans l’indice des cellules d’apoptose entre le groupe OSA et le groupe DHJST (P>.05).

3.3. L’inhibition de l’expression de VEGF et de HIF-1α dans les cellules Cartilagineuses Est Associée à l’effet thérapeutique de la DHJST

La PCR quantitative fluorescente indique que l’expression de l’ARNm de VEGF et de l’ARNm de HIF-1α est faible dans le groupe normal; tandis que les activités augmentent progressivement et de manière significative dans le groupe témoin par rapport à celle du groupe normal (P <.01); Dans le groupe témoin, HIF-1α dans les chondrocytes articulaires commence à augmenter à la sixième semaine après la chirurgie, augmente encore à la 10e semaine par rapport à celle de la sixième semaine (moyenne ± SD 94,21 ± 20.12 à la sixième semaine, et 160,35 ± 72,27 à la 10e semaine; P<.05) (Tableau 2). Au 10e week-end, l’expression de l’ARNm VEGF et de l’ARNm HIF-1α dans le groupe DHJST était significativement diminuée par rapport à celle du groupe témoin après administration (P<.01). Bien que le taux d’ARNm VEGF et d’ARNm HIF-1α dans le groupe AOS ait eu tendance à être réduit de 4 semaines de traitement par AOS par rapport à celui du groupe témoin, il n’y avait pas de différence significative (tableau 3).

4. Discussion

Le modèle ACLT est l’un des modèles expérimentaux d’arthrose les plus utilisés. L’ACLT chez le lapin est de plus en plus utilisée dans les études sur l’arthrose car l’apparition de la maladie est rapide. L’utilisation de modèles expérimentaux d’ACLT revêt une importance clinique particulière, car la rupture du LCA se produit chez l’homme et conduit également au développement de l’arthrose. L’étude indique qu’une grande quantité d’apoptose des chondrocytes existe au stade progressif de l’arthrose chez le lapin induite par la chirurgie. L’apoptose des chondrocytes est l’un des changements caractéristiques du cartilage de l’arthrose. L’apoptose pathologique sous condition de stimulation nocive pourrait entraîner la libération de chimiotaxies ou de facteurs inflammatoires, ce qui aggrave les lésions cartilagineuses et active la douleur. Par conséquent, l’inhibition de l’apoptose des chondrocytes pourrait être une stratégie importante contre les modifications dégénératives des articulations du genou des lapins. L’indice d’apoptose des chondrocytes dans le groupe DHJST diminue significativement par rapport à celui du groupe modèle, suggérant que l’inhibition de l’apoptose des chondrocytes pourrait être l’un des mécanismes importants de la DHJST contre les changements dégénératifs.

Des études antérieures ont montré la nature hypoxique du microenvironnement des chondrocytes articulaires. Fait intéressant, les articulations arthritiques ont montré une diminution supplémentaire des niveaux d’oxygène, rôle de l’hypoxie lors de la pathogenèse de l’arthrose. Une étude récente a décrit que dans les chondrocytes articulaires, le stress catabolique et hypoxique sont de puissants inducteurs du facteur de transcription HIF-1, qui est le principal régulateur de l’adaptation cellulaire à de faibles niveaux d’oxygène. HIF-1 est d’une importance cruciale pour la survie et l’arrêt de la croissance des chondrocytes pendant le développement du cartilage, ainsi que pour la génération d’énergie et la synthèse matricielle des chondrocytes dans le cartilage sain et ostéoarthritique. Dans le cartilage arthritique, les taux de protéines de HIF-1 sont significativement augmentés et son activité est corrélée à la gravité des modifications dégénératives du cartilage. Le présent travail documente l’importance du facteur de transcription HIF-1α pour le maintien de l’intégrité du cartilage articulaire hypoxique. Les niveaux excédentaires de HIF-1α ont coïncidé avec une apoptose accrue des chondrocytes articulaires et ont conduit à des modifications dégénératives des articulations du genou des lapins. Après administration de DHJST, l’expression de HIF-1α diminue, par rapport à celle du groupe modèle. Les résultats montrent que l’action de DHJST sur la fonction régulatrice des chondrocytes, pourrait par inhibition de l’activité de HIF-1α.

Il est intéressant de noter que la différence d’expression du VEGF et du HIF-1α entre le groupe DHJST et le groupe OSA est significative après administration. Plusieurs études ont démontré que certains anti-inflammatoires non stéroïdiens, tels que l’indométacine, provoquent des effets anti-inflammatoires indépendants de l’activité HIF-1α, car l’indométacine n’inhibe pas la phosphatidylinositol 3-kinase ou la voie de la kinase régulée par le signal extracellulaire / protéine kinase activée par le mitogène, ainsi que l’activité Erk. En revanche, l’indométacine est capable d’activer le récepteur γ activé par le proliférateur du peroxysome, qui n’est pas sensible au salicylate de sodium ou à l’aspirine. L’inhibition de la phosphatidylinositol 3-kinase ou de la voie Erk est liée à l’inhibition de HIF-1α et des facteurs angiogéniques.

L’hypoxie et divers facteurs de croissance / cytokines améliorent l’expression du VEGF. Le VEGF n’est pas seulement l’un des facteurs d’angiogenèse les plus importants, il est également impliqué dans les processus inflammatoires de l’arthrose et contribue à des symptômes tels que la douleur et l’enflure en ciblant les membranes synoviales, les réponses inflammatoires chroniques sont souvent associées à la production de facteurs angiogéniques qui induisent une prolifération vasculaire, et dans la polyarthrite rhumatoïde, le VEGF est fortement exprimé dans les cellules synoviales. Étant donné que la surcharge mécanique est l’un des facteurs responsables de l’arthrose, nous avons étudié son effet sur l’expression du VEGF sur le cartilage du lapin, selon lequel l’expression du VEGF diminue après l’administration de DHJST, le résultat indique que le DHJST peut protéger le cartilage articulaire en supprimant l’expression du VEGF dans les chondrocytes (Figure 3).

Figure 3

Mécanismes de protection hypothétiques de la DHJST sur la dégradation du cartilage.

5. Conclusions

Jusqu’à présent, les ingrédients bioactifs du DHJST sont inconnus, mais notre étude indique que le DHJST exerce un effet thérapeutique significatif sur l’arthrose chez le lapin, par le biais de mécanismes d’inhibition de l’apoptose des chondrocytes et de régulation de l’expression du VEGF, HIF-1α dans les chondrocytes. Cela fournit des preuves scientifiques pour que la clinique applique la DHJST dans le traitement de l’arthrose.

Financement

La Fondation des Sciences naturelles de Shanghai (numéro de subvention: 08JC1418800).