Définition
Le marquage fluorescent est le processus de liaison des colorants fluorescents aux groupes fonctionnels contenus dans les biomolécules afin qu’ils puissent être visualisés par imagerie par fluorescence (nature.com ). La disponibilité de nouveaux fluorophores a radicalement changé les possibilités de détection sensible des biomolécules et d’analyse de leurs interactions. Les colorants fluorescents améliorés permettent maintenant des études auparavant impossibles des structures cellulaires et des processus cellulaires. Les étiquettes fluorescentes offrent de nombreux avantages, car elles sont très sensibles même à de faibles concentrations, sont stables sur de longues périodes et n’interfèrent pas avec la fonction des molécules cibles. L’imagerie ciblée des cellules marquées permet de les suivre in vitro et in vivo. L’utilisation de fluorophores différents dans un même échantillon peut également permettre l’observation simultanée de plusieurs molécules en même temps. Les fluorophores les plus couramment utilisés sont l’IsoThioCyanate de fluorescéine (FITC), les dérivés de la rhodamine (TRITC), la coumarine et la cyanine. Ces colorants organiques synthétiques sont utilisés pour marquer les biomolécules comme des protéines, des peptides, des anticorps, des acides nucléiques, des bactéries ou des levures. Les fluorochromes naturels, tels que la protéine fluorescente verte (GFP), peuvent également être utilisés pour marquer génétiquement les cellules vivantes.
- Marquage des protéines fluorescentes
Le marquage fluorescent permet aux chercheurs d’étudier la dynamique conformationnelle et les interactions moléculaires des protéines ou de suivre leurs mouvements afin de mieux comprendre leurs fonctions biologiques (Modesti M, 2011). Pour mieux comprendre la liaison au ligand récepteur, les structures protéiques et l’activité enzymatique, des peptides simples peuvent également être marqués. Les anticorps marqués au fluorochrome sont largement utilisés dans la recherche biomédicale pour détecter les antigènes dans les tests d’immunofluorescence et sont également des outils essentiels en immunodiagnostic. Pour garantir des résultats fiables, la conjugaison des fluorophores ne doit pas interférer avec les caractéristiques de liaison à l’antigène de l’anticorps (Nath N et al, 2016). - Marquage fluorescent des acides nucléiques
Les tests basés sur la fluorescence jouent un rôle majeur dans les études biophysiques de la structure, de la fonction et de la dynamique des acides nucléiques. Les progrès récents des méthodes de marquage et des systèmes d’imagerie ont permis l’observation directe in vivo de l’ADN et de l’ARN, et de leurs interactions avec d’autres composants cellulaires. L’imagerie par cellules vivantes des acides nucléiques a ouvert de nouvelles voies pour mieux comprendre l’organisation de la chromatine et la régulation de l’expression génique. (Dirks RW et coll., 2018). - Marquage fluorescent des polysaccharides
Les polysaccharides complexes, tels que l’héparine, sont des composants structurels de la matrice extracellulaire. Ces polysaccharides sont essentiels à l’adhésion, à la migration et à la croissance cellulaires (Prigent-Richard S. et al, 1998). Certains composés sont également connus pour leurs propriétés anticoagulantes, antithrombotiques, anti-inflammatoires, antivirales et antiangiogènes. Les méthodes basées sur la fluorescence facilitent l’identification de nouveaux polysaccharides bioactifs et la caractérisation de leurs fonctions biologiques (Roger O et al, 2002). - Marquage fluorescent des lipides
Les lipides cellulaires jouent un rôle crucial dans la cellule pour le stockage d’énergie, pour la formation de membranes cellulaires et pour les processus de signalisation intracellulaire (Maekawa M. et Fairn G, 2014). Le colorant lipophile Nile red est largement utilisé pour colorer les lipides intracellulaires afin d’analyser leur localisation et leur organisation (Greenspan P et al, 1985). De plus, pour étudier la dynamique des lipides, un marquage spécifique dans les cellules vivantes est également possible (Schultz C et al, 2010).
Techniques de marquage fluorescent
Les méthodes de marquage fluorescent couramment utilisées utilisent des techniques de marquage chimique, enzymatique, peptidique /protéique et génétique (Sahoo H, 2012, Toseland CP, 2013).
- Techniques de marquage chimique: Les fluorophores s’amarrent aux molécules cibles par modification chimique (liaison covalente ou non covalente). Les méthodes d’étiquetage chimique présentent plusieurs avantages car elles sont robustes, faciles à réaliser et très efficaces avec une large gamme de fluorophores. Ils conviennent mieux aux études in vitro qu’in vivo.
- Techniques de marquage enzymatique: Les réactions enzymatiques permettent un marquage rapide, hautement efficace et sélectif in vivo et in vitro et peuvent être utilisées pour cibler des protéines ou des cellules entières. Pourtant, en raison de la grande taille des étiquettes, des interférences avec la fonction des molécules cibles peuvent se produire.
- Étiquette peptidique/protéine : Une technique récemment développée, et très prometteuse, permet le marquage spécifique et sélectif des protéines par l’incorporation de courtes étiquettes fluorescentes qui ne perturbent ni le repliement ni la fonction de la molécule. Cette technique est également facile à réaliser et peut être utilisée pour étudier différents sites de protéines uniques en fonction de la spécificité de l’étiquette peptidique.
- Étiquetage génétique: L’étiquetage génétique peut être réalisé à l’aide de domaines protéiques, de petits peptides ou d’acides aminés simples qui sont marqués avec des colorants fluorescents et peuvent se fixer spécifiquement sur des sites le long des chromosomes in vivo. Cette approche permet de détecter des anomalies chromosomiques telles que des délétions ou des duplications.
- Étiquetage multicolore: Une exigence courante pour l’imagerie de cellules vivantes et pour les applications de cytométrie en flux est la capacité de suivre ou de détecter plusieurs protéines marquées par fluorescence en même temps. A cet effet, des colorants spécialement conçus avec un très grand décalage de Stokes peuvent être utilisés, ce qui permet la surveillance simultanée de différents processus biochimiques.
Essais basés sur la fluorescence
Les essais basés sur la fluorescence reposent sur la capacité des fluorophores à réémettre de la lumière après l’exposition à des particules lumineuses ou à des photons. La différence de longueur d’onde entre la lumière d’excitation et la lumière d’émission, appelée décalage de Stokes, peut être détectée dans des microscopes et des systèmes d’imagerie. Chaque fluorophore a un décalage de Stokes spécifique. Différents tests permettent aux chercheurs de localiser des biomolécules, de les observer en temps réel, d’étudier leurs interactions et d’étudier les activités enzymatiques.
- Microscopie à fluorescence
La microscopie à fluorescence permet l’identification des cellules et des composants cellulaires et le suivi de la physiologie cellulaire avec une grande spécificité. La microscopie à fluorescence sépare la lumière émise de la lumière d’excitation à l’aide de filtres optiques. L’utilisation de deux indicateurs permet également l’observation simultanée de différentes biomolécules en même temps. Alors que les systèmes d’imagerie conventionnels permettent une résolution de 200 à 300 nm en raison des limites de diffraction physique, les nouveaux microscopes à fluorescence à super résolution comme STED (épuisement des émissions stimulées) dépassent ces limites et fournissent des informations sur le monde nanométrique des molécules (Sanderson MJ et al, 2014). - Cytométrie en flux
La cytométrie en flux est largement utilisée dans la recherche fondamentale et la pratique clinique pour mesurer le signal de fluorophores spécifiques. Les cellules et les particules sont analysées et finalement triées en « temps réel » lorsqu’elles traversent le faisceau lumineux des détecteurs qui quantifient la fluorescence produite par les anticorps ou ligands marqués. Ces marqueurs se lient à des molécules spécifiques à la surface de la cellule ou à l’intérieur de la cellule permettant leur détection et leur quantification. Plusieurs paramètres tels que la taille et le volume peuvent être mesurés sur des cellules individuelles, et différents types de cellules peuvent être isolés et caractérisés (Nolan JT et Condello D, 2013). La cytométrie en flux trouve de larges applications dans des domaines tels que l’immunologie, l’hématologie, la médecine de transplantation, l’oncologie et la génétique. - Hybridation in situ par fluorescence (FISH)
L’hybridation in situ par fluorescence (FISH) permet la localisation de séquences d’ADN spécifiques sur les chromosomes. Des sondes d’ADN ou d’ARN fluorescentes sont utilisées pour hybrider et identifier des séquences d’ADN cibles complémentaires. Le POISSON a été traditionnellement utilisé pour cartographier les gènes sur les chromosomes, par exemple lors du Projet Génome humain. Aujourd’hui, l’hybridation in situ par fluorescence est principalement utilisée à des fins diagnostiques dans la détection d’anomalies chromosomiques ou dans l’analyse de cellules cancéreuses (O’Connor C, 2008). - Spectroscopie de corrélation de fluorescence (FCS)
La spectroscopie de corrélation de fluorescence (FCS) permet l’analyse des changements temporels de l’intensité de fluorescence des fluorochromes, qui sont causés par des influences chimiques, biologiques ou physiques. Le SCF a d’abord été introduit pour étudier l’interaction entre les médicaments et l’ADN et représente maintenant un outil sensible pour déterminer les niveaux de concentration et d’agrégation des protéines, ainsi que pour observer les interactions moléculaires (Tian Y et al, 2011). - Microarrays
Les microarrays permettent l’étude de l’expression des gènes dans différentes conditions. Des milliers de gènes peuvent être examinés en même temps sur des puces à ADN. Ce sont des lames microscopiques imprimées avec de minuscules taches contenant des séquences d’ADN connues qui peuvent se lier sélectivement à des molécules d’ARNm / ADNc marquées par fluorescence. Après hybridation, la puce à ADN est lue et les données sont utilisées pour créer des profils d’expression génique (Hoen PAC et al, 2003).
Étiquette fluorescente: Imagerie des cellules vivantes
L’observation cinétique des processus cellulaires à l’aide de la microscopie à fluorescence accélérée est devenue une technique fondamentale en biologie cellulaire, car l’imagerie des cellules vivantes peut fournir des informations très précieuses sur les mécanismes de croissance et de transport cellulaires. Un défi majeur de la microscopie en accéléré consiste à minimiser les effets phototoxiques résultant du photoblanchiment. L’exposition à la lumière détruit progressivement les molécules fluorescentes conduisant à une réduction du signal de fluorescence et à la formation de radicaux libres susceptibles d’endommager les cellules. Par conséquent, il est crucial pour la méthode d’imagerie des cellules vivantes de trouver un équilibre entre la réduction de l’exposition à la lumière autant que possible et l’obtention de signaux utiles pour observer les cellules. Les scientifiques doivent également créer un environnement physiologique permettant de reproduire étroitement la dynamique in vivo. (Ettinger et Wittmann T, 2014).
Marquage fluorescent PromoCell
La disponibilité de nouveaux fluorophores a radicalement changé les possibilités de détection sensible des biomolécules et d’analyse de leurs interactions. Les colorants fluorescents améliorés permettent maintenant des études auparavant impossibles des structures cellulaires et des processus cellulaires. PromoCell fournit une large gamme de fluorophores de haute qualité pour le marquage fluorescent de diverses biomolécules: marquage des protéines, marquage des anticorps, marquage des acides nucléiques (marquage de l’ADN, marquage de l’ARN), ainsi que des kits d’étiquetage complets et des conjugués fluorescents prêts à l’emploi.
Nos colorants promofluorés sont des alternatives rentables aux fluorophores de premier plan bien connus et couvrent le spectre des longueurs d’onde du bleu au rouge lointain. Ils présentent une intensité de fluorescence et une photostabilité exceptionnelles, une forte absorption de la lumière, un rendement quantique de fluorescence élevé et une bonne solubilité dans l’eau et peuvent être utilisés pour la microscopie à fluorescence, l’hybridation in situ fluorescente (FISH), la spectroscopie de corrélation de fluorescence (FCS) et les puces (protéines, ADN). Certains d’entre eux offrent un décalage de Stokes extra large, ce qui les rend parfaitement adaptés aux applications de marquage multicolore ou de cytométrie en flux. Des colorants promofluorés sont disponibles, par ex. sous forme d’esters NHS, de maléimides et d’étiquettes modifiées par des acides aminés prêts pour un couplage covalent ou comme conjugués avec de la biotine, de la phalloïdine et des désoxynucléotides (DUTP). De plus, nous fournissons également des kits de marquage d’anticorps de haute qualité pour les protéines & avec différents colorants promofluorés.