4.3 BBB – crossing BSABS conçus avec des anticorps à domaine unique
Les sdAbs sont de petits fragments d’anticorps monomères (15 kDa) se liant à l’antigène qui offrent divers avantages par rapport aux autres fragments d’anticorps en tant que « blocs de construction » pour les bsAbs. Ils se présentent dans la nature comme la partie se liant aux antigènes des anticorps à chaîne lourde chez les espèces de camélidés (appelées VHH) et les poissons cartilagineux (appelés VNAR) ou peuvent être générés à partir d’IGG classiques en obtenant ou en concevant des domaines VH ou VL monomères stables (Hamers-Casterman et al., 1993; Hussack et coll., 2012; Kim et coll., 2014; Nuttall, 2012; Ward, Güssow, Griffiths, Jones, &Hiver, 1989). Les SDAB sont très stables et compacts et ils peuvent accéder à des épitopes en creux dans des protéines, telles que des cavités réceptrices ou des sites actifs d’enzymes, qui sont souvent « cachés » des IGG classiques et peuvent atteindre des affinités de liaison cibles comparables à celles des anticorps classiques (Lauwereys et al., 1998; Staus et coll., 2014). Ces unités de liaison aux antigènes monomères ne s’apparient pas avec des chaînes légères, ce qui en fait d’excellents blocs de construction pour les BSAB hétérodimérisés car elles évitent les difficultés d’appariement incorrect des chaînes légères (Hamers-Casterman et al., 1993; Saerens, Ghassabeh, &Muyldermans, 2008). Les BSAB hétérodimériques peuvent être créés avec un ou les deux « bras » étant des sdAb, ce dernier étant de structure similaire aux anticorps à chaîne lourde camélidés (Fig. 3E). Les SDAB peuvent également être utilisés dans diverses fusions mono, bi ou tétravalentes avec des anticorps thérapeutiques classiques ou des FAB (Fig. 3E), entraînant généralement des molécules plus petites et moins complexes, par rapport à celles générées avec des SCFV ou des FAB comme blocs de construction, qui ont tendance à être biophysiquement bien comportées et faciles à produire (Holliger& Hudson, 2005). L’humanisation des VHH ainsi que l’ingénierie des sdAbs sont bien décrites, permettant de générer facilement des sdAbs humains (ized) avec une affinité cible optimale et des propriétés biophysiques exceptionnelles (Vincke et al., 2009).
Pour évaluer l’utilisation potentielle du camélidé VHH FC5 comme porteur de BBB au sein d’anticorps ciblant le SNC bispécifiques, des fusions monovalentes et bivalentes (terminus N et C) de FC5 avec du Fc humain ont été conçues et évaluées in vitro et in vivo (Farrington et al., 2014). L’affinité apparente de liaison (Kdapp) au BEC de rat de la fusion FC5Fc bivalente était de 75 nM, alors que la liaison FC5Fc monovalente se situait dans la plage micromolaire. Les analyses des taux de transmigration apparents (Papp) sur un modèle BBB in vitro, de l’exposition apparente au SNC dérivée de la pharmacocinétique sérum / LCR des constructions d’anticorps administrées de manière systémique et des réponses pharmacologiques provoquées par des peptides neuroactifs imperméables à la BBB conjugués chimiquement dans le modèle de douleur de Hargreaves, ont fourni la preuve d’un transport amélioré de la BBB de ces molécules d’anticorps de grande taille (75 kDa) médiées par FC5: (1) les valeurs de Papp in vitro étaient d’environ 200 cm / min pour les molécules de fusion Fc N-terminales mono et bivalentes (FC5Fc) par rapport à 4-8 cm/min pour le contrôle VHH A20.Les fusions 1Fc ou EG2Fc; (2) l’exposition apparente au SNC de la fusion FC5Fc était 30 fois plus élevée que les fusions anticorps-Fc du domaine témoin; (3) la puissance pharmacologique systémique des conjugués FC5Fc avec les neuropeptides dalargine ou galanine dans le modèle de douleur inflammatoire de Hargreaves était jusqu’à 60 fois plus élevée que les conjugués FC5–neuropeptides monomères. Ce résultat a été attribué à la longue demi-vie circulatoire (~ 96 h) des conjugués FC5Fc–par rapport aux conjugués FC5–neuropeptides; (4) divers conjugués de neuropeptides VHH–Fc témoins n’ont montré aucune efficacité systémique; (5) la fusion de FC5 avec le terminus C de Fc a entraîné une capacité de passage de BBB atténuée. Contrairement aux anticorps porteurs de BBB ciblant le TfR, les protéines de fusion FC5Fc mono et bivalentes présentaient un taux de transcytose similaire in vitro, des profils pharmacocinétiques plasma /LCR similaires et une puissance systémique similaire dans le modèle pharmacodynamique in vivo, malgré des différences d’affinité de liaison apparente et de valence (Farrington et al., 2014). Ces études ont démontré que l’anticorps FC5 à domaine unique traversant le BBB peut être utilisé comme support de BBB plate-forme dans les « demi-anticorps » hétérodimérisés et comme fusion bi- ou tétravalente plus facilement évolutive avec les IGG classiques (Farrington et al., 2014).
Un autre avantage potentiel des VHH en tant que porteurs de BBB est leur résistance naturelle aux défis biophysiques extrêmes, tels que la température et le pH, ainsi qu’à la dégradation de la protéase (Kim et al., 2014), souvent rencontrés dans divers compartiments endocytaires lors de la transcytose. Les fusions FC5 et FC5Fc sont internalisées en BEC via des vésicules revêtues de clathrine et sont triées en endosomes précoces. Fait intéressant, FC5 a également été trouvé pour stimuler l’excrétion des microvésicules extracellulaires (exosomes) du BEC (Haqqani, Caram-Salas, et al., 2013; Haqqani, Delaney et coll., 2013) dans lequel des niveaux de FC5 et d’augmentation de son récepteur présumé Cdc50A ont été détectés par Western blot et spectrométrie de masse ciblée. Cette étude a suggéré que les exosomes rejetés pourraient être la vésicule finale de la voie RMT libérée de la surface abluminale portant le complexe récepteur-anticorps (schématisé à la Fig. 4). La voie RMT et la formation d’exosomes partagent certaines similitudes notables. Comme indiqué dans la première découverte d’exosomes, un anticorps anti-TfR a été suivi par microscopie électronique dans des réticulocytes (Théry, 2011) à partir de la surface des cellules, dans des fosses recouvertes de clathrine, à l’intérieur des endosomes précoces, à la surface des vésicules internes des endosomes multivésiculaires et enfin sur les exosomes libérés après fusion des endosomes multivésiculaires avec la membrane plasmique (Fig. 4). Le RMT semble se dérouler de manière similaire et il a été démontré que les microvésicules extracellulaires BEC contiennent plusieurs récepteurs connus pour transporter des macromolécules à travers le BBB via le RMT, y compris le TfR, le LRPs, le LDLR et l’IR (Haqqani, Delaney et al., 2013).
D’après les études décrites, il devrait être évident que le bras porteur BBB du bsAb ciblant le SNC nécessite une optimisation minutieuse pour chaque récepteur RMT. Des considérations importantes dans la conception de BSAB ciblant le SNC sont discutées ci-dessous en raison des « leçons apprises » du développement de bsAb TfR-BACE1 et de notre propre travail avec FC5 en tant qu’anticorps porteur de BBB.