α-Hemolysin Fra Escherichia coli bruker endogen forsterkning gjennom P2X-reseptoraktivering for å indusere hemolyse

Resultater

HlyA-Indusert Hemolyse Krever Aktivering Av Purinergreceptorer.

Supernatant fra den α-hemolysin (HlyA)–produserende E. coli–stamme ARD6 lyser hest, menneske og murine erytrocytter (Fig. 1). Figur 1 viser HlyA-indusert hemolyse som en funksjon av tid. Time-lapse eksperimenter med murine og humane erytrocytter festet til dekkglass viste at HlyA-indusert hemolyse er en sekvensiell prosess. I løpet av de første 20 minuttene induserte HlyA crenation av de røde blodcellene som følge av cellekrymping, etterfulgt av en gradvis volumøkning og til slutt lysering av cellene (Fig. 1A og 1b, Film S1). Denne sekvensielle krympingen og hevelsen gjelder også på enkeltcellenivå. Således er det ikke forskjellige populasjoner av røde blodlegemer som enten krymper eller svulmer, men heller at en enkelt erytrocyt først krymper og deretter svulmer som følge av HlyA-applikasjon. Erytrocytt-suspensjonen (1,25%) ble inkubert med fortynnet E. coli supernatant (50 µl · ml−1). Erytrocytter fra de tre testede artene viste markert forskjell i respons til HlyA (Fig. 1C) med lavest følsomhet For HlyA i humane erytrocytter. I alle de følgende forsøkene ble mengden Tilsatt E. coli supernatant justert for å gi ≈50% hemolyse etter 60 minutters inkubasjon.

Vi bruker vanligvis filtrert E. coli (ARD6) supernatant for å indusere hemolyse med mindre annet er angitt. Denne tilnærmingen ble valgt for å sikre at våre resultater også ville gjelde in vivo hvor HlyA frigjøres fra E. coli sammen med forskjellige andre komponenter. Når vi valgte denne tilnærmingen, måtte vi imidlertid verifisere at hemolysen indusert Av HlyA-produserende E. coli faktisk kunne tilskrives HlyA. Derfor renset Vi HlyA fra VÅR ARD6-kultur. Etter rensing ble en suspensjon av den rensede HlyA separert på en 5-15% natriumdodecylsulfat (sds) gel. Et enkelt 100-kDa band dukket opp etter Coomassie r-farging, og massespektroskopi identifiserte bandet Som HlyA(Fig. S1 a og B). Som en ekstra kontroll brukte vi supernatanten Fra e. coli-stammen D2103, en ikke-patologisk laboratoriestamme av E. coli som ikke produserer HlyA. Supernatanten fra disse bakteriene induserte ikke hemolyse i humane, murine eller equine erytrocytter (Fig. S1D). Videre sammenlignet vi våre funn Med HlyA vennlig levert Av Prof. Sucharit Bhakdi, Universitetet I Mainz ,Tyskland(med aktivitet av 10 ng·ml-1 for ≈50% hemolyse, Fig. S2). I det følgende, når renset HlyA er nevnt, er det med henvisning til dette preparatet. Under våre første tester av den biologiske aktiviteten Til HlyA, oppdaget vi at ATP-scavenger apyrase fullstendig hemmet HlyA-indusert hemolyse av hest erythrocytter. Dette funnet var virkelig overraskende, da det innebar ekstracellulær ATP nødvendig for hemolysen påført Av HlyA-produserende E. coli. Siden ekstracellulær ATP er et signalmolekyl som aktiverer P2-reseptorer, kan våre funn tyde på at den rådende poremodellen for HlyA-indusert hemolyse kan være en forenkling. Derfor testet vi effekten AV ATP scavenging mer grundig. Vi fant at apyrase helt hemmet hemolyse av ikke bare hest, men også murine og humane erytrocytter (Fig. 2A). I tillegg reduserte heksokinase, som raskt nedbryter adenosintrifosfat (ATP) til adenosindifosfat (ADP), tilsvarende HlyA-indusert hemolyse i røde blodlegemer av murin og human opprinnelse på en konsentrasjonsavhengig måte (Fig. 2B). Dette funnet ble verifisert ved renset HlyA (Fig. 2b, innfelt). Det er verdt å merke seg at både apyrase og heksokinase i humane erytrocytter forsterket hlya-indusert hemolyse ved lavere konsentrasjoner. Sondringen kan tyde på en forskjell I P2 – reseptoruttrykksmønster på de røde blodcellene mellom artene.

For å validere relevansen av dette funnet var det viktig å finne ut om P2-reseptorantagonister påvirket hlya-indusert hemolyse. Den ikke-selektive p2-reseptorantagonisten PPADS-konsentrasjonen reduserte hemolyse indusert Av HlyA-produserende E. coli i hest, murine og humane erytrocytter (Fig . 2C). EC50-verdien for PPADS var henholdsvis 520 µ, 400 µ og 180 µ for humane, murine og equine erytrocytter. Dette funnet ble begrunnet for hele spekteret Av hlya-konsentrasjoner (Fig. 2d) testet i humane erytrocytter eksponert for renset HlyA. Forholdet mellom konsentrasjon og respons var forenlig med konkurrerende antagonisme, og det bør bemerkes at effekten av selv maksimale toksinkonsentrasjoner ble redusert av p2-reseptorblokkeren. P2-reseptoraktivering synes derfor å være involvert I HlyA-indusert hemolyse. Den ikke-selektive p2-reseptorantagonisten suramin reduserte også Konsentrasjonsavhengig HlyA-indusert hemolyse hos alle tre arter (data ikke vist). I høyere konsentrasjoner forårsaker suramin imidlertid dramatisk krymping av erytrocytter, og kan derfor ikke være egnet for evaluering Av p2-reseptorimplikasjon i erytrocytter.For å vurdere om effekten av den purinerge antagonisten på hemolyse bare var et resultat av økt osmolalitet, testet vi effekten av ekstracellulær sukrose på hlya-indusert hemolyse (data ikke vist). Sukrose (1 mM) bare svakt redusert hemolyse (5.1% ± 1.7%), mens 10 mM og 75 mM sukrose markert redusert hemolyse (28.5% ± 5.0%, 82.8% ± 5.2%). Gitt at konsentrasjonene av antagonister og Atpaser som ble brukt i denne studien aldri oversteg 1 mM, kan effekten ikke være et resultat av økt osmolaritet. Resultatene våre reflekterte heller ikke uselektiv binding mellom antagonistene og toksinet. Dette ble testet i equine erytrocytter, som ble preincubert Med HlyA i 10-15 minutter ved 37 hryvnias C eller i 30 minutter ved 4 hryvnias C, grundig vasket og re-suspendert med eller uten antagonistene. Fordi HlyA inkorporeres i membranen under preinkubasjonen, fortsatte erytrocytene å lyse i fravær av fri HlyA. Fig. S2 viser at ulike farmakologiske intervensjoner reduserte hemolyse etter HlyA var prebundet til erytrocyttene. Antagonistene var imidlertid mindre effektive når de ble tilsatt til vasket erytrocytter der den lytiske prosessen allerede var initiert.

Hvilke P2-Reseptor(Er) Er Involvert i HlyA-Indusert Hemolyse?

Erytrocytter uttrykker ulike typer p2-reseptorer. P2-reseptorene som er rapportert å være uttrykt i modne humane erytrocytter, inkluderer P2Y1 (14), P2Y2 (15), P2Y13 (15), P2X1 (15) og P2X7 (16), MENS P2Y1, P2X1, P2X4 og P2X7 ser ut til å være til stede i erytroide stamceller (17). For å teste hvilke av disse purinergreceptorene som deltar i den HlyA-induserte hemolysen, adresserte vi de aktuelle reseptorene individuelt. DA P2Y1-reseptoren er involvert i sorbitolindusert hemolyse av plasmodiuminfiserte humane og murine erytrocytter (14), testet vi om denne reseptoren var ansvarlig for HlyA-indusert hemolyse. P2Y1-reseptorantagonisten MRS2179 påvirket ikke den HlyA-induserte hemolysen (Fig. S3A) ved konsentrasjoner (opptil 500 µ) utover det som var nødvendig for å hemme hemolyse i Plasmodium berghei-infiserte erytrocytter (14). Siden det ikke er noen spesifikke antagonister FOR P2Y2-reseptorer, undersøkte vi effekten Av HlyA i transgene mus. Den HlyA-induserte hemolysen var lik i erytrocytter FRA P2Y2−/ – og p2y2+/+ mus (Fig. S3B). I TILFELLE AV P2Y13 testet vi antagonisten MRS2211, som har blitt rapportert å vise noe selektivitet mot P2Y13-reseptoren (18). MRS2211 reduserte HlyA-indusert hemolyse signifikant i humane og murine erytrocytter (Fig. S3C). Dette funnet motsier våre resultater med heksokinase (nedverdigende ATP TIL ADP), som skal stimulere i stedet for å hemme DEN ADP-sensitive P2Y13-reseptoren. Derfor bør heksokinase og MRS2211 gi motstridende resultater hvis p2y13-reseptoren er involvert. SIDEN DETTE ikke er tilfelle, ER P2Y13-reseptoren en usannsynlig kandidat for P2-reseptoren involvert i HlyA-indusert hemolyse. Vi kan ikke utelukke muligheten FOR AT inhiberingen produsert AV MRS2211 er mediert gjennom en Annen P2-reseptor.

i prinsippet forlater DETTE bare P2X-reseptorene som skal vurderes. Fig. 3A viser at Den ikke-selektive blokkeringen AV P2x-reseptorer Evans blue kraftig reduserte HlyA-indusert hemolyse, noe som tyder på AT en P2X-reseptor er involvert i denne hemolysen. Av p2x-reseptorene uttrykt i erytrocytter, betraktet VI P2X7 som den mest sannsynlige mediatoren For HlyA-indusert hemolyse av følgende årsaker. P2x7-reseptorene er kjent for å gjennomgå en overgang til en større permeabilitetstilstand, som til slutt fører til lysis i visse celler (12). P2X7-reseptoren har blitt rapportert å interagere med kanalproteinet pannexin1 (12), og komplekset skaper en betydelig porepermeabel for større molekyler som etidiumbromid (13). Pannexin1 uttrykkes i humane røde blodlegemer (19) og har nylig blitt foreslått SOM ATP-frigjøringskanal i erytrocytter (20). For å teste OM p2x7-reseptorer deltar I HlyA-indusert hemolyse, brukte vi antagonister med relativ selektivitet FOR P2X7: Brilliant Blue G (BBG), ATP-2′, 3′-dialdehyd (OxATP) og KN-62 (21). Alle antagonister konsentrasjon-dependently redusert hemolyse i hest, murine, og humane erytrocytter (Fig. 3). Equine og humane erytrocytter var mer følsomme for alle de testede stoffene sammenlignet med murine erytrocytter. I denne sammenheng bør det nevnes at den murine p2x7-reseptoren er kjent for å være mindre følsom OVERFOR KN-62 sammenlignet med den humane reseptoren (22). BESKYTTELSEN MOT hemolyse ved p2x-reseptorantagonisme ble igjen underbygget for hele konsentrasjonsområdet av renset HlyA i humane erytrocytter ved BRUK AV BBG som et eksempel PÅ EN P2X7-antagonist (Fig. 3D). Igjen viser antagonisten en betydelig effekt på HlyA-indusert hemolyse selv under hlya-konsentrasjoner som ga maksimal hemolyse. Inhiberingen av hemolyse Av OxATP ble verifisert ved bruk av renset HlyA i murine og humane erytrocytter (Fig. 3E, innfelt). Den nye selektive, konkurrerende p2x7-reseptorantagonisten A438079 reduserte hemolysen i humane erytrocytter, men var mindre effektiv i murine erytrocytter (Fig. 3F). Immunobloter av plasmamembranfraksjoner for p2x7-reseptoren bekrefter at humane og murine erytrocytter uttrykker et protein av relevant størrelse (66 kDa, Fig. 3G, og i Sin Helhet I Fig. S4B). Det vil kreve ytterligere undersøkelser for å fullt ut fastslå det relative bidraget AV P2X-reseptorer i HlyA-indusert hemolyse. Med våre nåværende verktøy kan vi ikke utelukke muligheten for bidrag fra andre P2X-reseptorer i HlyA-indusert hemolyse hos noen av de studerte artene.

Fig. S4A viser HlyA-indusert hemolyse i murine (P2X7+/+ og P2X7−/−) erytrocytter. De murine erytrocytene viser en tilsvarende grad av hemolyse som respons på HlyA uavhengig av deres genotype. P2X7 – / – musene og P2X7+/+ musene ble opprinnelig generert Av Pfizer og ble krysset tilbake TIL BALB / c-bakgrunn. Vi påviste ingen avvik mellom sensitiviteten for HlyA-indusert hemolyse i erytrocytter isolert fra BALB / c og c57bl / 6 mus (data ikke vist), selv OM C57BL / 6-stammen er kjent for å ha en genetisk variasjon I c-enden AV p2x7-reseptoren (23). Disse dataene stemmer overens Med den minimale effekten Av A438079 på murine erytrocytter og det lave proteinuttrykket AV p2x7-reseptoren i murine erytrocytter (Fig. 3F og 3G).

disse resultatene innebærer at det er minst en ekstra p2-reseptor involvert i HlyA-indusert hemolyse i murine erytrocytter. SIDEN P2X1 og P2X7 deler lignende inhibitorprofiler FOR BBG, KN-62 og OxATP (24), testet VI p2x1-antagonistene MRS2159 og NF449. MRS2159 konsentrasjon-avhengig hemmet hemolyse i erytrocytter fra hest (EC50:150@M) og mus (EC50: ≈250 µ). Humane erytrocytter var relativt ufølsomme for antagonisten, men ved en konsentrasjon over 250 µ så vi en liten og statistisk signifikant reduksjon (Fig. 4A). Denne effekten var mye mer uttalt hvis renset HlyA ble brukt(Fig. 4C). Dette innebærer at det kan være forskjeller i den cellulære responsen med hensyn til om De utsettes For HlyA i ren form eller i kombinasjon med andre E. coli-bestanddeler. NF449 konsentrasjon-hemmer avhengig Av HlyA-indusert hemolyse hos mennesker (Fig. 4B). NF449 var mye mindre effektiv i murine erytrocytter i samsvar med at murine P2X1-reseptoren var relativ resistent mot denne inhibitoren (25). DET bør understrekes at SELV OM NF449 er et suraminderivat, fremkalte det ikke de samme volumendringene i erytrocytter som suramin. Immunobloter AV p2x1-reseptoren er kjent for å vise opptil 4 bånd i forskjellige vev; et 45 kDa ikke-glykosylert, et 60 kDa glykosylert og et 95/120 kDa-bånd som kan være den polymeriserte formen av reseptoren (26, 27). I våre hender gjenkjente p2x1-reseptorantistoffet konsekvent et 45 KD-bånd og et svært svakt 60 kDa-bånd i blotter av plasmamembraner fra murine og humane erytrocytter (Fig. 4D). Interessant fant vi at uttrykksnivået 60 kDa-båndet var mye høyere I P2X7 – / – musene sammenlignet med kontroller(tilsvarende i tre preparater, Fig. 4D). I denne immunobloten justeres proteinnivåene for å unngå overbelastning av båndene FRA P2X7 – / – musene, som etterlater 60 kDa-båndet nesten uoppdagelig i P2X7+/+ musene. Denne tilsynelatende oppreguleringen AV p2x1-reseptoren kan potensielt skjule en hemolytisk fenotype i mus MED p2x7-reseptormangel. Samlet støtter disse dataene hypotesen om at BÅDE P2X1-og P2X7-reseptoren er relevante for HlyA-indusert hemolyse. Våre resultater peker på signifikante variasjoner mellom arter, HVOR p2x7-reseptoren er viktigere for hemolyse i humane erytrocytter.

HlyA-Indusert Hemolyse Forhindres av Pannexin1-Antagonister.

Karbenoksolon (28), meflokin og probenecid (30) har blitt brukt som antagonister med relativ selektivitet for pannexin1. Karbenoksolon reduserte signifikant nivået av hemolyse hos alle tre arter med tilsvarende følsomhet (Fig. 5A). Effekten av karbenoksolon ble igjen testet for hele spekteret Av hlya-konsentrasjoner (renset toksin, Fig. 5B), viser også betydelige effekter under maksimale hlya-konsentrasjoner. Meflokin og probenecid ble bare testet i murine og humane erytrocytter. EC50 for meflokin var 25 µ i mennesker og 18 µ i murine erytrocytter. Probenecid hemmet hemolyse i humane erytrocytter, MED EN EC50 PÅ 2 mM, men var mindre effektiv i murine erytocytter. Nylig har de kjente Cl-kanalantagonister NPPB og nifluminsyre vist seg å hemme pannexin-kanaler også (31). Begge stoffene reduserte HlyA-indusert hemolyse, med en vesentlig mer uttalt effekt på humane erytrocytter (Fig. S5).