- Myoblaster vedta en langstrakt form for å skille og regulere deres actin nettverk til spredning området
- den romlige organisasjonen av actin-nettverket og kjernen er regissert av myoblastmorfologien
- celleforlengelse forbedrer myoblast kontraktilitet
- kontraktiliteten til cellepar økte etter fusjonen og økte på langstrakte mikromønstre
- Actomyosin kontraktilitet fremmer myotube differensiering
- myoblast forlengelse utløser yap nuclear export, som er avgjørende for differensiering av myoblaster i myotubes
Myoblaster vedta en langstrakt form for å skille og regulere deres actin nettverk til spredning området
for å vurdere forholdet mellom celle form, actin nettverk og fokale adhesjoner, vi dyrket C2C12 myoblaster på et homogent lag av fibronectin (FN). Etter 24 timer i kultur ble myoblaster løst og farget for actin for å bestemme deres morfologiske parametere(Fig. 1A). FN-belagte substrater tillot etablering av spesifikke celle-substratinteraksjoner ved å rekruttere spesifikke transmembranintegriner. Faktisk uttrykkes flere α integrin-underenheter som kombineres med β 1 underenhet under skjelettmyogenese, som er viktige ved myogen cellemigrasjon, myoblastfusjon, muskelfibermodning eller ved vedlikehold av muskelintegritet32,33. Ytterligere eksperimenter utført på laminin (LAM)-belagte substrater indikerte at både morfologiske parametere (celle form indeks, celle omkrets og celleområde, Supplerende Fig. 1A) og celle-substrat interaksjoner (antall og areal av fokale adhesjoner, Supplerende Fig. 1B) var statistisk lik PÅ FN og LAM, validere FN belegg for å studere in vitro morfologier AV C2C12 myoblaster under fusjon / differensiering prosessen.
vi kvantifiserte celleformindeksen (CSI) som karakteriserte myoblastens morfologi ved å gi informasjon om den cellulære forlengelsen. Avrundede celler har EN CSI nær 1, mens langstrakte celler har en CSI nær 0. VI fant AT CSI varierte fra 0,1 til 0,8 med en middelverdi på 0.37 ± 0,15 (n = 101), noe som tyder på en stor variasjon i cellemorfologier (Fig. 1B). Myoblaster viste en gjennomsnittlig omkrets på 259 ± 82 µ (Fig. 1C, n = 101) og et bredt spekter av spredningsområder (fra ~1000 til ~4000 µ2), med en gjennomsnittlig verdi på 2057 ± 618 µ2 (Fig. 1D, n = 101). Disse funnene oppnådd PÅ C2C12 myoblaster ble styrket ved å utføre ytterligere morfologiske målinger (CSI, celleperimeter og celleområde) på primære humane myoblaster (16ubic, Supplerende Fig. 2A) som kommer fra biceps av en pasient upåvirket AV FSHD (dvs. som har blitt bekreftet å mangle en 4qa sletting). Som vist I Supplerende Fig. 2B-D, viser våre resultater AT CSI for 16ubiske myoblaster varierte fra 0,14 til 0,86 med en gjennomsnittsverdi på 0,44 ± 0,17 (n = 90), noe som tyder på en stor variasjon i cellemorfologier for humane myoblaster, som observert FOR C2C12-celler. Samlet viser våre resultater at variabiliteten av cellemorfologier ikke er avhengig av celletypen eller noen artefakt av cellekulturen.Vi studerte deretter fordelingen av aktinfilamenter i en populasjon AV C2C12 myoblaster for å forstå om variabilitetsspredningsområdene kan modulere actin cytoskelettet. Våre funn viste at den totale fluorescensintensiteten Til f-actin-nettverket var lineært relatert til celleområdet (Fig. 1E, n = 31, R2 = 0,748), noe som tyder på at jo større myoblast sprer seg, jo flere aktinfilamenter dannes. Som vist I Supplerende Fig. 3, vi neste preget fordelingen av vinculin inneholdt adhesjoner å bestemme hvordan variasjoner av celle form påvirke celle-substrat interaksjoner I C2C12 myoblaster. Vi fant at det totale arealet av celle-substratadhesjoner per celle økte med celleområdet(Fig. 1F, n = 31, R2 = 0,783) og med fluorescensintensiteten Til F-actin (Fig. 1G). Våre resultater indikerer AT C2C12 myoblaster antar en rekke celleformer og spredningsområder, men tilpasser både mengden aktinfilamenter og vinculinadhesjoner til deres spredning. For å få mer innsikt i rollen som celleform for myoblast-differensiering, vurderer vi utviklingen av celleformatforholdet under spredning (P0 ved 6 timer og P2 ved 48 timer) og differensiering (D2 ved 96 timer) stadier (Fig. 1H). Som vist I Fig. 1I,J, våre funn viser at myoblastene økte sideforholdet fra 0.40 ± 0.16 (P0) til 0.36 ± 0.09 (P2) og 0.24 ± 0.07 (D2), noe som tyder på at myoblastene forlenges betydelig og tar i bruk et sideforhold på 1:4 for å skille seg ut. I tillegg indikerte våre resultater at aktinstressfibrene var svært orientert Ved D2(Supplerende Fig. 4A,B), tilsvarende også betydelige kjernefysiske forlengelser (Supplerende Fig. 4C). Samlet viser våre funn At F-actin-nettverket moduleres ved modifikasjoner av myoblast-morfologien og indikerer at myoblaster differensiering krevde cellulær forlengelse opp til et aspektforhold på 1: 4.
den romlige organisasjonen av actin-nettverket og kjernen er regissert av myoblastmorfologien
vi kontrollerte den iboende variabiliteten i myoblastmorfologier ved å bruke klebende mikromønstre for å standardisere deres spredningsområder og kontrollere deres former. Ved å bruke en mikrokontakttrykkteknikk20 skapte vi adhesive mikromønstre av fibronektin (FN) med et konstant areal på 1600 µ 2 og forskjellige geometrier. Vi brukte avrundet (CSI = 1), kvadrert (CSI = 0,79), trekantet (CSI = 0,60) og forskjellige aspektforhold av rektangulær (CSI = 0,50 og 0,34 for 1: 4 og 1:7 aspektforhold, henholdsvis) FN mikromønstre til kultur individuelle myoblaster (Fig. 2A). Disse forskjellige geometrier av mikromønstre tillot å standardisere in vitro myoblast-formen over et bredt spekter og å kontrollere spredningsområdet.
for å kvantitativt bestemme til rollen av cellen geometri på romlig organisering av actin cytoskeleton,vi bestemt orienteringen av actin filamenter for hver celle form34, 35. Aktinfilamenter farget med falloidin ble fargekodet som en funksjon av deres orientering med en fargegradient som spenner fra lyseblå når aktinfilamenter ble organisert parallelt (0°) til den horisontale aksen og rød (+90°) eller oransje (-90°) for de organisert vinkelrett på den horisontale aksen (Fig . 2B). Vi observerte at aktinfilamenter i avrundede celler ble fordelt tilfeldig, med retninger fra -90° til +90°. Kvadrerte celler utstilt aktin filamenter organisert i tre hoved vinkel domener: 0° til 25°, 50° til 90° og -50° -90°, mens trekantet celler viste actin filamenter hovedsakelig organisert i henhold til tre sider av mønster på 0°, 60° og -60°. Interessant fant vi at aktinfilamenter var svært orientert parallelt med den lange celleaksen (0°) for rektangulære celler med 1:4 (CSI = 0,50) og 1:7 (CSI = 0,34) aspektforhold. Kvantifiseringen av vinculinholdige adhesjoner indikerte ingen statistiske forskjeller i adhesjonsområder mellom cellemorfologier (Supplerende Fig. 5A-C–, mens orienteringen av fokale adhesjoner ble modulert av celleform (Supplerende Fig. 5D, E), som observert for aktinfilamenter. Våre funn viser at både 1:4 og 1: 7 rektangulære myoblaster tillater en sterkere organisering av actin cytoskeleton (Fig. 2C) og fokale adhesjoner, noe som tyder på at myoblast forlengelse fører til dannelse av kontraktile dipoler.Med Tanke på cellekjernens rolle i differensiering av myoblastene i myotubene, undersøkte vi neste om endringer i celleform og cytoskelettarkitektur kan modulere formen og orienteringen av nukleus36. Vi fant at det kjernefysiske aspektforholdet økte betydelig med senking AV CSI(Fig. 2D). Faktisk viste avrundede celler (CSI = 1) på sirkulære mikromønstre en avrundet kjerne preget av et gjennomsnittlig sideforhold på 1,11 ± 0,06, mens rektangulære celler med et sideforhold på 1:4 (CSI = 0,50) og 1:7 (CSI = 0,34) viste store nukleare deformasjoner med sideforhold på henholdsvis 1,39 ± 0,21 og 2,19 ± 0,23. Vi la også merke til at orienteringen av kjernen ble modulert av cellemorfologien(Fig. 2E). Vi fant at orienteringen av kjernen i avrundede, kvadrerte og trekantede celler strakte seg over et bredt spekter av vinkler (fra ~15° til ~60°), med en gjennomsnittlig orientering på ~40° (sirkulær, n = 11), ~33° (firkantet, n = 14) og ~43° (trekant, n = 10) i forhold til den horisontale aksen. For rektangulære celler indikerte resultatene våre at kjernen var orientert parallelt med celleaksen med en gjennomsnittlig vinkel på ~14° (1:4, n = 15) og ~2° (1:7, n = 10).
celleforlengelse forbedrer myoblast kontraktilitet
det neste spørsmålet vi adresserte var hvordan endringer i celleform påvirker myoblast kontraktilitet. For å svare på dette spørsmålet, brukte vi traction force mikroskopi (TFM) for å bestemme trekkspenninger utøves av micropatterned myoblaster. Som vist I Fig. 3A vi observerte at de maksimale spenningene ble utøvd ved ekstremitetene til de mikropatterte myoblastene, uavhengig av celleformen. Som observert tidligere på andre celletyper37, den kontraktile stress akkumulert fortrinnsvis i hjørnene (firkanter og trekanter) eller på begge ekstremiteter (1:4 og 1: 7 rektangler) av micropatterned myoblaster. Vi kvantifiserte den totale stress utøves av individuelle micropatterned myoblasts å avgjøre om cellen morfologi modulerer cellekontraktilitet. Som vist I Fig. 3b, avrundede celler (CSI = 1) utøvde en total spenning på 170,7 ± 46,4 N / m2, mens rektangulære celler (CSI = 0,34, sideforhold 1:7) utøvde en større total mengde stress (295,9 ± 156.8 N / m2), noe som tyder på at langstrakte celleformer fører til økte trekkspenninger. Videre fant vi at rektangulære formede celler (CSI = 0,34, sideforhold 1:7) viste den større maksimale spenningsverdien (684,3 ± 257,8 Pa, Fig. 3C), mens avrundede myoblaster viste den laveste maksimale spenningsverdien(351,5 ± 123,6 Pa). Med tanke på at kontraktile spenninger ble utøvd ved celleperiferien, og at senking AV CSI fører til økte trekkspenninger, plottet vi maksimal spenningsverdi som en funksjon av avstanden fra massesenteret til enden av cellen (Fig. 3D), som representerer 22.6 µ (CSI = 1), 28.28 µ (CSI = 0.79), 33.98 µ (CSI = 0.60), 41.23 µ (CSI = 0.50) og 53.45 µ (CSI = 0.34). Som vist I Fig. 3D, fant vi at det maksimale kontraktile stresset økte lineært med avstanden fra sentroid til ekstremiteten av cellen (R2 = 0,958, n = 65), noe som tyder på at langstrakte morfologier av myoblaster utøver flere trekkstyrker.
for å bestemme bidraget fra actomyosin-nettverket i etableringen av kontraktile krefter i myoblaster ble C2C12-celler behandlet Med G-actin-sekvestrerende legemiddel Latrunculin B (LatB) og med myosin II-inhibitoren Blebbistatin (Bleb). Immunostained myoblaster med falloidin indikerte At LatB og Bleb-behandlede celler viste et diffust aktinnettverk(Fig. 3E), som viser at begge stoffene påvirket signifikant organisasjonen Av F-actin. VI brukte tfm på micropatterned myoblaster behandlet med begge legemidler for å bestemme rollen til actomyosin-nettverket i etableringen av kontraktile krefter i myoblaster av forskjellige geometrier. Våre funn indikerer At LatB-behandling induserte et signifikant tap av kontraktilitet, som økte med celleforlengelsen. Faktisk viste avrundede celler et tap av kontraktilspenning på ~62%, mens 1:4 og 1: 7 rektangulære celler behandlet med LatB ble preget av et tap av kontraktilspenning på henholdsvis ~88% og ~86% (Fig . 3F). I tillegg fant vi at kontraktilspenningen av 1:4 rektangulære celler behandlet Med Bleb ble karakterisert ved et tap på ~80% av den kontraktile kraft, viser at myosin II molekylære motorer er sentrale aktører i myoblast kontraktile krefter.Til sammen indikerer disse resultatene at kontraktiliteten til actomyosin-nettverket forbedres i langstrakte myoblaster gjennom etablering av et tett nettverk av parallelle actomyosinfibre.
kontraktiliteten til cellepar økte etter fusjonen og økte på langstrakte mikromønstre
for å forstå hvordan myoblast morfologi kan påvirke kontraktile egenskaper av myotubes, vurderer vi en minimal modell av to myoblaster. Vi først bestemt trekkraft utøves av celle dubletter På P1 (24 h i spredning media) belagt på mikromønstre av varierende former(Supplerende Fig. 6A). Det var ingen statistiske forskjeller i kontraktilspenning mellom det brede spekteret AV CSI (Supplerende Fig. 6B), til tross for en veldefinert orientering av actin-nettverket (Supplerende Fig. 6C) og kjernene (Supplerende Fig. 6D, E) på 1:4 og 1: 7 rektangulære mikromønstre. Basert på denne observasjonen kvantifiserte vi deretter kontraktilspenningen som utøves av celledobler dyrket på sirkulære (CSI = 1) og rektangulære (CSI = 0,50, 1:7 aspektforhold) FN mikromønstre i løpet av fem ekstra dager (D5, Fig. 1H) i differensieringsmedium. Vi brukte MitoTracker Red CMXRos( ThermoFisher Scientific), en levende mitokondriell farging, for å sikre at myoblast dubletter ble smeltet (Fig. 4A) 38. Som vist I Fig. 4B, C, fant vi at det totale kontraktile stresset var noe økt i smeltede celledubletter dyrket på sirkulære mikromønstre (267 ± 64 Pa) sammenlignet med sirkulære ubrukt celledubletter (157 ± 37 Pa), mens smeltede forlengede dubletter var mer enn to ganger mer kontraktile (543 ± 193 Pa) enn ubrukte forlengede dubletter (211 ± 73 Pa). Disse resultatene indikerer at den cellulære kontraktiliteten økte etter cellefusjon og ble signifikant forbedret for langstrakte morfologier.