Diskusjon
bildecytometri-metoden som foreslås i dette arbeidet, demonstrerer evnen til raskt og effektivt å analysere autofagi i levende celler for screening av potensielle legemidler som kan indusere eller hemme autofagiske aktiviteter, for eksempel å fremme clearance av misfoldede proteiner assosiert med nevrodegenerasjon, eller hemme stoffresistens forbundet med kreft. Begrensning i dagens metoder kan overvinnes ved bildecytometri og unike reagenser for å utvikle en ny metode for autofagideteksjon. Cellometersynet har tidligere blitt brukt til fluorescerende cellebaserte analyser (Chan et al., 2011, 2012b; Robey et al., 2011), Og Cyto-ID autophagy-fargestoffet har vist seg å spesifikt flekke autofagosomer i levende celler. I dette arbeidet er Cyto-ID-fargestoffet vist å kolokalisere MED RFP-LC3 i sultet HeLa-celler, som ytterligere validerer spesifisiteten av fargestoffet. Den utviklede bildebaserte autofagideteksjonsmetoden er benchmarked mot standard flowcytometri ved å sammenligne autofagi-aktivitetsresultatene i Næringssultede Jurkat-celler. Resultatene viste en økning av fluorescerende intensitet i næringssultede celler, og en reduksjon for gjenopprettede Jurkat-celler. IMIDLERTID er de målte aaf-verdiene for bildecytometri betydelig høyere enn flowcytometri, noe som kan skyldes forskjeller mellom instrumentering og metoder. Cellometer Vision image cytometer bruker en ladekoblet enhet for fluorescensmåling, MENS FACS Calibur flow cytometer bruker et foto-multiplikatorrør (PMT). I tillegg var metoden for å analysere fluorescerende intensiteter også forskjellig mellom de to systemene. Flowcytometeret måler totale fluorescenssignaler fra hver celle, mens det bildebaserte systemet tar bilder og analyserer fluorescerende fargete autofagosomer i cellene, noe som kan gi mer nøyaktige målinger av autofagiaktivitet. Cellometer-programvaren kan analysere fluorescens av celler ved å summere de totale fluorescerende pikslene i hver celle, eller måle bare de høye fluorescerende intensitetspikslene fra autofagosomer i hver celle. En annen forskjell kan skyldes skjærspenning av flowcytometri som påvirker levedyktigheten til målcellene (Robey et al., 2011).
Autofagisk flux er også en viktig analyse for å utvikle en ny deteksjonsmetode. CQ brukes til å hemme lysosomal nedbrytning av autofagosomer, hvor den autofagiske aktiviteten vil være høyest for Næringssultede Jurkat-celler i NÆRVÆR AV CQ på grunn av synergistisk interaksjon mellom behandlingene. Den neste høyeste Ville Være Jurkat-celler i sult uten CQ. Bare En liten økning i autofagisk aktivitet vil bli vist Av Jurkat-celler med CQ bare i forhold til kontrollen på grunn av akkumulering av basale autofagolysosomer. De autofagiske fluxresultatene fra begge instrumentene viste lignende trender, MEN aaf-verdiene målt i bildecytometri er signifikant høyere. Disse resultatene viste at bildecytometrisk deteksjonsmetode lett kunne implementeres for å undersøke autofagiaktivitet, til tross for de potensielt instrumentspesifikke kvantitative forskjellene I aaf-verdiene.
for å demonstrere at bildecytometri kan være en potensiell teknologi for screening av legemidler, må evnen til å analysere prøver under flere forhold testes. Bildecytometri brukes til å måle autofagisk aktivitet av Jurkat-celler behandlet med rapamycin i ulike konsentrasjoner, for å demonstrere muligheten for bildecytometri til å måle dose-responseffekter over en tidsstudie. Som et resultat er bildebasert cytometri i stand til å oppdage forskjellene i autofagisk aktivitet på tvers av ulike eksperimentelle forhold. I Fig. 8.6, den autofagiske aktiviteten (målt ved aaf-verdier) er den høyeste etter 18 h inkubasjon. En liten reduksjon I aaf-verdier er vist mellom 8 og 4 h inkubasjon, noe som kan skyldes at cellene ikke tillater fullstendig gjenoppretting etter den første behandlingen. I tillegg kan adherente celler som human prostate cancer cell line (PC-3) også måles ved hjelp av bildecytometri-metoden. Bildeoppløsningen Av Cellometersyn kan analysere fluorescerende merkede autofagosomer (puncta), observert i både fluorescerende bilder og fluorescensintensitetshistogrammer.
det er også viktig å demonstrere evnen til å karakterisere forskjellige legemiddelforbindelser ved å sammenligne deres autofagiske dose-responseffekt for legemiddeloppdagingskampanjer. Doseresponseffekter av tamoksifen og rapamycin sammenlignes direkte ved bruk av bildecytometri. Resultatene ved 18 h inkubasjon viste at rapamycin induserte et høyere nivå av autofagi aktivitet enn tamoxifen. Det er viktig å merke seg at tamoxifen ved 100 µ er svært cytotoksisk, noe som fører Til Jurkat celledød og oppløsning etter 18 timers inkubasjon. Den bildebaserte verifiseringen av cytotoksisitetseffekten i tamoksifen ved høy konsentrasjon kan være svært nyttig for å eliminere usikkerhet fra bare spredningsplott og histogramresultater.Bildecytometri har vist sammenlignbare resultater med standard flowcytometri for fluorescerende cellebasert analyse (Chan et al., 2011; Robey et al., 2011). Bildebasert cytometri metoden kan tilby flere fordeler fremfor flowcytometri. For eksempel er antall celler som kreves for hver prøve (10-20 µ) betydelig mindre enn et konvensjonelt flowcytometer(300-500 µ). Det første oppsettet på flowcytometer krever at noen av målcelleprøver skal brukes TIL pmt-spenninger og kompensasjonsjustering. På den annen side pipetter mange bildecytometre celler inn i et tellekammer som kan skannes flere ganger. Derfor er målcelleprøver ikke bortkastet under den første optimaliseringen av eksponeringstidsjustering og fokusering. Enda viktigere, fordelen av å fange BR og fluorescerende bilder tillater forskere å visuelt verifisere ervervet fluorescens data. Dette kan hjelpe til med å identifisere cytotoksisitet som en kompliserende bivirkning av en medisinsk behandlingstest som induserer autofagi.Autofluorescens kan oppstå ved Bruk Av Cyto-ID Grønn autofagi fargestoff på grunn av plasttellingskammeret, men programvaren kan automatisk fjerne bakgrunnssignalet for å oppnå den faktiske målfluorescens uten å endre aaf-beregningen. I tillegg er photobleaching av fluorescerende prober i cellebaserte analyser minimert siden Cellometer Vision bruker lavere effekt Led i forhold til høy effekt lasere som brukes i andre instrumenter. Fremtidig forbedring Av Cellometers bildecytometer vil være å utvikle et høyere gjennomstrømning automatisert system som kan analysere flere celler for forbedret statistisk analyse, samt evnen til å analysere flere prøver samtidig, noe som letter høyere gjennomstrømning cellebasert legemiddel screening av inhibitorer og aktivatorer av autofagi, apoptose, nekrose og andre fysiologiske fenomener av interesse.