Diverse motiv ensembler angir ikke-redundante DNA-bindende aktiviteter AV AP-1 familiemedlemmer i makrofager

Statistiske analyser

I Fig. 1c, forskjeller i genuttrykk ble testet ved hjelp av den uavhengige t-testen (frihetsgrad = 1, to-tailed) på to replikatforsøk (n = 2). Differensielt uttrykte gener I Fig. 1b ble identifisert Ved Hjelp Av EdgeR55 med standardparametere, og ved hjelp AV cut offs FDR < 0.05 og log2 fold endre ≥2. I Fig. 2c, forskjeller mellom hver gruppe (Veh, Delt og KLA 1 h) ble undersøkt ved hjelp av uavhengig t-test (frihetsgrad = 1, to-tailed); antall loci i hver gruppe for hver monomer er SOM følger ATF3 (Veh = 1447, Delt = 7460, KLA = 6997), Jun (2390, 3751, 3401), JunD (1351, 5976, 6422). Betydning for motiver I Fig. 4a ble beregnet ved hjelp av sannsynlighets-ratio-testen (frihetsgrad = 1) som sammenlignet prognosene gjort av den fullstendige tba-modellen og den forstyrrede TBA-modellen ved alle loki bundet I Veh-behandlede makrofager For Atf3 (n = 23 160), Jun (n = 15 548) og JunD (n = 19 653). Betydning for motiver I Supplerende Fig. 4C ble beregnet ved hjelp av sannsynlighets ratio test (frihetsgrad = 1) sammenligne spådommer gjort av full TBA modellen og forstyrret TBA modellen på alle loci bundet Av JunD I GM12878 (n = 7451), H1-hESC (n = 12,931), HepG2 (n = 41,318), K562 (n = 47,477), OG SK-N-SH (38,960). Betydning for motiver I Fig. 5b, Supplerende Fig. 5B, Og Utfyllende Fig. 5C ble beregnet ved hjelp av sannsynlighets-ratio-testen (frihetsgrad = 1) som sammenlignet prognosene gjort av den fullstendige tba-modellen og den forstyrrede tba-modellen ved alle loki bundet i KLA-behandlede makrofager for Atf3 (n = 36 745), Jun (n = 17 481), JunD (n = 31 641), Fos (n = 24 365), Fosl2 (n = 10 619) og JunB (n = 13 376). Signifikansverdier For Fig. 6f OG S6F ble beregnet ved Hjelp Av F-testen; antallet loci analysert for monomerer I Kjøretøybehandlede makrofager er ATF3 (n = 4163), Jun (n = 3004) og JunD (n = 4148); antall loci analysert for monomerer I KLA-behandlede makrofager er: Atf3 (n = 4577), Jun (n = 3232), JunD (n = 4366), Fos (n = 4477) og JunB (n = 3616).

Generere tilpasset genom FOR BALB/cJ

et tilpasset genom FOR BALB/cJ ved å erstatte invariante posisjoner av mm10 genomet med alleler rapportert Av Mouse Genomes Project (versjon 3 vcf-fil)43. FOR C57BL / 6J ble mm10 referansegenomet fra UCSC genome browser brukt. For å tillate sammenligninger MELLOM BALB/cJ og C57BL/6J under analysen ble koordinatene for det tilpassede genomet FOR BALB/cJ skiftet for å matche posisjonene til mm10 referansegenomet ved HJELP AV MARGE34. Vi analyserte ikke noen leser som falt innenfor slettinger I BALB / cJ. Leser som overlappes med en innsetting ble tildelt den siste overlappende posisjonen i referansestammen.

Analyse Av ChIP-seq topper

Sekvensering leser Fra ChIP-seq eksperimenter ble kartlagt til mm10 montering av mus referanse genomet (Eller balbc / J custom genome) ved hjelp av den nyeste versjonen Av Bowtie2 med standard parametere56. Kartlagt ChIP-seq leser for å identifisere antatte tf-bindingssteder MED HOMER57 findPeaks-kommandoen (med parametere-størrelse 200-L 0-C 0-fdr 0.9), ved hjelp av inngangsbrikkeeksperimentet som svarer til behandlingstilstanden. FOR å redusere antall falske positive topper, beregnet VI IDR ved hver topp (ved hjelp av versjon 2.0.3 av idr-programmet) med HOMER peak score beregnet for hvert replikere eksperiment som input TIL IDR og deretter filtrert alle topper som hadde IDR ≥ 0.0558. De novo motivene ble beregnet MED HOMER findMotifsGenome.pl kommando med standardparametere. Berikelse av de novo motiver ble beregnet ved hjelp av findKnownMotifs.pl program I HOMER med standardparametere.Kvantifisering AV rna uttrykk leser generert fra RNA – seq eksperimenter ble justert til mm10 mus referanse genomet (Eller balbc/J custom genome) ved HJELP AV STAR aligner med standard parametere59. For å kvantifisere uttrykksnivået for hvert gen, beregnet VI RPKM med lesene som var innenfor en ekson. Un-normalisert sekvensering leser ble brukt til å identifisere differensielt uttrykte gener Med EdgeR55; vi vurderte gener MED FDR < 0,05 og en endring i uttrykk mellom to eksperimentelle forhold to ganger eller større differensielt uttrykt. For å kvantifisere uttrykket av nascent Rna annoterte vi Våre ChIP-seq topper med antall GRO-seq leser (normalisert til 10 millioner) som var innenfor 500 bps av toppsenteret ved HJELP AV HOMER annotatePeaks.pl kommando.

tba-modellopplæring

for HVER AP-1-monomer under hver behandlingstilstand trente vi en modell for å skille bindingssteder for hver monomer fra et sett tilfeldig valgte genomiske loci. Settet med tilfeldige bakgrunnsloki som brukes til å trene hver modell, ble valgt i henhold til følgende kriterier: (1) gc-innholdsfordelingen av bakgrunnslokiene samsvarer MED gc-innholdet i bindingsstedene for en gitt monomer, (2) inneholder ingen tvetydige eller unappable posisjoner, og (3) antall bakgrunnssekvenser samsvarer med antall bindingssteder k. For hver av sekvensene i det kombinerte settet av bindingssteder og bakgrunnslokale, beregnet vi den høyeste log-odds-poengsummen (også referert til som motif score) for hvert av de n motivene som vil bli inkludert i model60 Motivkamper i begge retninger ble vurdert. Log-odds score mindre enn 0 ble satt til 0. Før vi trente en lineær modell, standardiserte vi log-odds-poengene for hvert motiv, skalerte settet med score for hvert motiv slik at gjennomsnittsverdien er 0, og variansen er 1. Standardisering skalerer scorene for alle motiver til samme rekkevidde (lengre motiver har en større maksimal score) og bidrar også til å redusere effekten av flerkollinearitet på modellopplæringen. Og så, funksjonene som brukes til å trene vår modell er en n by 2k matrise av log-odds score standardisert over hver rad. For å generere den tilsvarende rekke etiketter, vi tildelt hvert bindingssted en etikett på 1 og hver bakgrunn loci en etikett på 0. Ved hjelp av denne funksjonsmatrisen og etikettmatrisen trente vi vekter for hvert motiv ved hjelp Av En L1-straffet logistisk regresjonsmodell som implementert av scikit-learn Python package61. Motif-vektene som er vist i analysen vår, er middelverdiene på tvers av fem runder med kryssvalidering, og bruker 80% av dataene for trening og 20% for testing i hver runde. Modeller ble trent For ChIP-seqs generert i denne studien, samt data lastet ned fra NCBI – Genuttrykket Omnibus(tiltredelsesnummer GSE46494) og KODEDATAPORTALEN (https://www.encodeproject.org).

Kvantifisering av flere kollinearitet

for å vurdere omfanget av multi-kollinearitet i motif score-funksjonene vi pleide å trene våre modeller, tok vi hver funksjonsmatrise som tilsvarer hvert eksperiment og beregnet VIF for hver motif38. For å beregne VIF, bestemmer vi først koeffisienten Av bestemmelse, R2, for hvert motiv ved å regressere log-odds score for ett motiv mot log-odds score for de gjenværende motivene. Ved hjelp av bestemmelseskoeffisienten kan toleransen for hvert motiv beregnes som forskjellen mellom 1 og bestemmelseskoeffisienten (1-R2). VIF er gjensidig av toleransen \(\frac{1}{{1-r^2}}\). Vi brukte linear_model-modulen til sklearn Python-pakken for å beregne bestemmelseskoeffisienten.

Motiv clustering og sammenslåing

vi scoret likheten av ALLE par DNA sekvens motiver ved å beregne Pearson korrelasjon av justert posisjon sannsynlighet matriser (PPMs) som svarer til et gitt par motifs62. Pearson – korrelasjonen for et par motiv a og b med lengde i beregnes ved hjelp av formelen:

Ppmer ble først justert ved Hjelp Av Smith-Waterman alignment algorithm63. Kortere motiver er polstret med bakgrunnsfrekvensverdier før justering. Hull i justeringen var ikke tillatt, og hver posisjon i justeringen ble scoret Med Pearson korrelasjon. Pearson-korrelasjonen ble deretter beregnet ved hjelp av optimal justering. Deretter ble sett med motiver som har PPMs med En Pearson-korrelasjon på 0,9 eller høyere fusjonert ved iterativt å tilpasse HVER PPM i settet, og deretter gjennomsnittlig nukleotidfrekvensene i hver posisjon.

vurdering av signifikans av motiv for TBA

p-Verdier for TBA ble beregnet ved hjelp av log-sannsynlighets ratio test. Hvert motiv ble fjernet fra settet med funksjoner som ble brukt til å trene en forstyrret TBA-modell (ved hjelp av fem ganger kryssvalidering). Vi brukte deretter den fulle modellen (med alle motiver) og den forstyrrede modellen for å beregne sannsynligheten for å observere binding på alle bindingssteder og bakgrunnssekvenser for en gitt monomer og alle bakgrunnsregioner. Forskjellen i sannsynligheten beregnet av hele modellen og den forstyrrede modellen ble deretter brukt til å utføre chi-squared test for hvert motiv. Chi-squared testen ble utført ved hjelp av scipy python package64.

Sammenligning med andre metoder

BaMM motif og gkm-SVM ble begge kjørt med standardparametere. Vi brukte den nyeste versjonen av større skala gkm-SVM, LS-GKM (kompilert fra kildekode lastet ned fra https://github.com/Dongwon-Lee/lsgkm på 8/25/16), og BaMM motif; v1. 0 lastet ned fra https://github.com/soedinglab/BaMMmotif39, 65. Begge modellene ble trent ved hjelp av fem ganger kryssvalidering. Modell ytelse ble scoret ved hjelp roc_auc_score og precision_score funksjoner fra metrics modul av sklearn.

Forutsi endringer I AP – 1-binding etter en times KLA-behandling

for å forutsi endringen i binding etter KLA-behandling, brukte vi motivvektene som ble lært for hvert av n-motivene (wn) ved EN TBA-modell trent på Kjøretøybehandlede data (Wveh = ) og EN TBA-modell trent på 1-h KLA-behandlede data (Wkla = ) for HVER AP-1-monomer. Den forventede endringen i bindingen for hver sekvens er da forskjellen mellom prikkproduktet av de standardiserte motivpoengene beregnet for sekvensen hvert av k-bindingsstedene (Sk=) med KLA-motivvektene og prikkproduktet av motivpoengene og Veh-motivvektene(Δ-veh, k = Wkla⋅Sk-Wveh⋅Sk). Forutsigelser ble gjort for alle genomiske loci som krysset med en topp for EN AV AP – 1-monomerer i enten kjøretøy-eller KLA-behandlingstilstanden.

Forutsi belastningsspesifikk binding med TBA

for å forutsi belastningsspesifikk binding brukte vi motivvektene som ble lært for hvert av n-motivene (wn) med EN tba-modell (W = ) for HVER AP-1-monomer ved HJELP AV c57bl/6j-dataene, og motivskårene beregnet for hver av k-bindingsstedene ved hjelp av genomisk sekvens FOR C57BL/6j og BALBc/J (SC57,k = , SBAL,k = ). Deretter beregnet vi forskjellen på motivpoengene FOR C57BL6 / J og BALBc / J (Dn = ) og standardiserte deretter skåredifferansene for hvert motiv på tvers av alle k-bindingsstedene som hadde en mutasjon når man sammenlignet BALBc / J MED C57BL / 6J, noe som ga standardiserte skåredifferanser for hvert bindingssted (Zn = standardisere (Dn)=). Til slutt gjorde vi en prediksjon for belastningsspesifikk binding ved å beregne prikkproduktet av motivvektene og den standardiserte forskjellen på motivscorene MELLOM C57BL6 / EiJ og BALBc / J for det kth muterte bindingsstedet(Δ 57-BAL = W⋅).

TBA-2strain modell trening

for hver genomisk loci som krysset med en topp for EN AV AP-1 monomerer, i ENTEN C57BL/6j eller BALBc/J, beregnet vi den høyeste log-odds score for hver av de n motiver som vil bli inkludert i modellen, ved hjelp av den genomiske sekvens fra begge stammer, noe som gir en to sett med motiv score for hver av de k bindingssteder (SC57, k =, SBAL, k =). Motiv kamper i begge retninger ble vurdert. Log-odds score mindre enn 0 ble satt til 0. Ved hjelp av motivpoengene beregner Vi den standardiserte forskjellen på motivpoengene over de to stammene som beskrevet i avsnittet ovenfor (Zn = ). Og så, funksjonene som brukes til å trene vår modell er en n ved k matrise av log-odds score standardisert over hver rad. Deretter beregnet vi log2-foldforholdet for antall ChIP-seq leser I C57BL / 6j sammenlignet Med BALBc / J for å representere omfanget av belastningsspesifikk binding. Ved å bruke denne funksjonsmatrisen, og sette log2-foldforholdet mellom bindingen mellom de to stammene som den avhengige variabelen, trente vi vekter for hvert motiv ved hjelp av lineær regresjon som implementert av Scikit-learn Python-pakken. Motif-vektene som er vist i analysen vår, er middelverdiene på tvers av fem runder med kryssvalidering, og bruker 80% av dataene for trening og 20% for testing i hver runde. Forutsigelser for belastningsspesifikk binding kan gjøres ved hjelp av de beregnede vektene etter prosedyren i forrige avsnitt.

ChIP protocol

Protein a og G Dynabeads 50/50 mix Fra Invitrogen er saksøkt For ChIP (10001d, 10003D). IP-blandingen består av 20 µ perler/2 µ antistoff per 2 millioner Cellebrikke. Antistoffer mot ap-1-familiemedlemmer ble valgt for målretting av ikke-konserverte regioner for å minimere potensialet for ikke-spesifikk binding. Antistoffer er oppført I Supplerende Tabell 3. Til klargjøring ble perler vasket med 2× 0,5% BSA-PBS, deretter ble perler–antistoff inkubert med 0,5% BSA–pbs i minst 1 time på rotator (4 °C). Vask 2× med 0.5% BSA-PBS, deretter resuspendert i fortynningsbuffer (1% Triton, 2 mM EDTA, 150 mM NaCl, 20 mM Tris–HCl (pH 7,4), 1× Proteasehemmere). Dobbel tverrbinding For ChIP: Media ble dekantert fra celler i 10 cm plater, vask en gang kort med PBS (RT). 20593) (fortynnet I DMSO ved 200 mM) / PBS (RT) ble brukt i 10 min. Deretter ble formaldehyd tilsatt til en endelig konsentrasjon på 1% i ytterligere 10 min. Reaksjonen ble slukket med 1: 10 1 M Tris pH 7,4 på is. Celler ble samlet og vasket to ganger med kalde PBS, spinning ved 1000 × g i 5 min. Kjerneisolering og sonikering: Resuspend cellepellets i 1 mL kjerneisolasjonsbuffer (50 mM Tris-pH 8,0, 60 mM KCl, 0,5% NP40) + PI OG inkuber på is i 10 min. Sentrifuge 2000 hryvnias g til 3 min ved 4 °C. Resuspend kjerner i 200 hryvnias fersk lysisbuffer (0,5% SDS, 10 mM EDTA, 0,5 mM EGTA, 50 mM Tris–HCl (pH 8)) + PI. Sonikering: Kjerner ble deretter sonikert (10 millioner celler) i 25 minutter I En Biorupter (innstillinger = 30 s = På, 30 s = Av, Medium) ved hjelp av tynne veggrør (Diagenode Cat # C30010010). Etter sonikering spinn maks hastighet i 10 min ved 4 °C. ChIP satt opp: Sonikert DNA ble fortynnet 5× med 800 Fortynningsbuffer (1% Triton, 2 mM EDTA, 150 mM NaCl, 20 mM Tris–HCl (pH 7,4), 1× proteasehemmere). En aliquot er fjernet for innspill prøver (5%). Prøver på ved 4 °C mens du roterer. Vasking: ChIP vaskes 1× med TSE i (20 Mm Tris–HCl pH 7,4, 150 mM NaCl, 0,1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA), 2× med TSE III (10 mM Tris–HCl pH 7,4, 250 mM LiCl, 1% IGEPAL, 1% deoksykolat, 1 mM EDTA), 1× MED TE + 0,1% Triton X-100, overfør til nytt rør og vask deretter et annet tid Med Te + 0,1% TRITON x-100. Elution: Eluder med 200 µ elueringsbuffer (1% SDS, 10 mM Tris pH 7,5) i 20 minutter VED RT, risting på virvelen eller en nutator eller rotator. De-tverrbinding: Legg til 10 µ av 5 M NaCl og inkuber på ved 65 °C (eller minst 8 h). Rydde opp prøver ved Hjelp Av Zymo ChIP DNA Ren Og Konsentrator. Eluert i 100 µ Ta 40 µL og gå videre til library prep-protokollen.

PolyA rna-isolasjon og fragmentering

rna-isolasjon: RNA ble isolert ved HJELP AV TRIZOL-reagens (Ambion cat# 15596018) OG DIRECT-ZOL rna mini-prep kit (cat# 11-330mb). Poly-A rna-isolasjon: Bruk 0.2 totalt RNA som utgangsmateriale for ideell kartleggingseffektivitet og minimal klonalitet. Samle 10 µ oligo (dT) (NEB cat# S1419S) perler per RNA-prøve. Perler ble vasket to ganger med 1× DTBB (20 Mm Tris-HCl pH 7,5, 1 M LiCl, 2 mM EDTA, 1% LDS, 0,1% Triton X-100). Perler ble resuspendert i 50 µ av 2× DTBB. 50 µ av perler ble blandet med 50 µ RNA og oppvarmet til 65 °C i 2 min. RNA-perler ble deretter inkubert i 10 min VED RT mens de roterte. RNA-perler ble deretter samlet på en magnet og vasket 1× hver med RNA WB1 (10 mM Tris-HCl pH 7,5, 0,12 M LiCl, 1 mM EDTA, 0,1% LDS, 0.1% Triton X-100) OG WB3 (10 mM Tris–HCl pH 7,5, 0,5 M LiCl, 1 mM EDTA). Legg til 50 µ Tris-HCl pH 7.5 og varme til 80 °C for 2 min å eluere. Samle RNA og utføre en Andre Oligo-dT perle samling. Etter vask den andre samlingen, i stedet for eluering var 1× med 1× første tråd buffer; 250 mM Tris–HCl (pH 8,3), 375 mM KCl, 15 mM MgCL2 (ThermoFisher ssiii kit Cat# 18080093). Fragmentering: legg deretter til 10 µ av 2× førstestrengsbuffer pluss 10 mM DTT og fragment-DNA ved 94 °C i 9 min. Samle perler på magnet og overfør eluat som inneholder fragmentert mRNA til en ny PCR-stripe. Skal gjenopprette 10 µ fragmentert RNA. Første strand syntese: Vi blandet fragmentert RNA med 0,5 µL tilfeldig primer (3 µg/µL) Liv Tech #48190-011, og 0,5 µL oligo-dT (50 µM fra SSIII kit), 1 µL dntp (10 mM Liv Tech, katt 18427088) og 0,5 µL SUPERase-I (ThermoFisher Katten#AM2696) og varme 50 °C i 1 min. Legg straks på is. Vi så lagt 5.8 µL ddH2O, 0.1 µL actinomycin (2 µg/µL Sigma katten#A1410), 1 µL DTT (100 mM Liv Tech katten# P2325), 0.2 µL av 1% Tween og 0,5 µL av Superscript III og inkuber 25 °C i 10 min, deretter 50 °C i 50 min. Perle rydde opp: Vi la til 36 µ Av RNACLEAN XP (Ampure XP) og blandet, inkuberer i 15 min på is. Perlene ble deretter samlet på en magnet og vasket 2× med 75% etanol. Kulene ble deretter lufttørket i 10 minutter og eluert med 10 µ nukleasefri H2O. Andre trådsyntese. 10 µL av cDNA/RNA ble blandet med 1,5 µL 10× Blå Buffer (Enzymatics katten# B0110L), 1 µL dUTP/dNTP mix (10 mM Affymetrix katten# 77330), 0.1 µL dUTP (100 mM Affymetrix katten# 77206), 0.2 μl RNase H (5 U/µL Enzymatics katten# Y9220L), 1 µL DNA polymerase I (10 U/µL Enzymatics katten#P7050L), 0.15 µL 1% Tween-20 og 1.05 µ nuklease-fritt vann. Reaksjonen ble inkubert ved 16 °C i 2,5 timer. Bead opprydding: DNA ble renset ved å tilsette 1 µ Seradyn 3 EDAC SpeedBeads (Thermo 6515-2105-050250) per reaksjon i 28 µ 20% PEG8000/2,5 M NaCl (13% sluttkonsentrasjon) og inkubering VED RT i 10 min. Perler ble deretter samlet på en magnet og vasket 2× med 80% etanol. Kulene ble lufttørket i 10 minutter og eluert i 40 µ av nukleasefritt vann. DNA er klar for bibliotek prep.

Bibliotek prep protokoll

dsdna end repair: vi blandet 40 µ AV DNA FRA ChIP-eller RNA-protokoller med 2,9 µ AV H2O, 0.5 µL 1% Tween-20, 5 µL 10× T4 ligase buffer (Enzymatics katten# L6030-HC-L), 1 µL dNTP mix (10 mM Affymetrix 77119), 0.3 µL T4 DNA pol (Enzymatics P7080L), 0.3 µL T4 PNK (Enzymatics Y9040L), 0.06 µL Klenow (Enzymatics P7060L) og inkubert i 30 min ved 20 °C. 1 µL av Seradyn 3 EDAC SpeedBeads (Thermo 6515-2105-050250) i 93 µL 20% PEG8000/2,5 M NaCl (13% siste) ble lagt til og inkubert i 10 min. Perle opprydding: Perler ble samlet på en magnet og vasket 2× med 80% etanol. Perlene ble lufttørket i 10 minutter og deretter eluert i 15 µ ddH2O. dA-Tailing. DNA ble blandet med 10.8 µL ddH2O, 0.3 µL 1% Tween-20, 3 µL Blå Buffer (Enzymatics katten# B0110L), 0.6 µL dATP (10 mM Tech 10216-018), 0.3 µL Klenow 3-5 Exo (Enzymatics P7010-LC-L) og inkubert i 30 min ved 37 °C. 55.8 µL 20% PEG8000/2,5 M NaCl (13% siste) ble lagt en inkubert i 10 min. Deretter perle rydde opp ble gjort. Perler ble eluert i 14 hryvnias. Y-form adapter ligering. Prøven ble blandet med 0,5 µ AV en bioo strekkodeadapter (BIOO Scientific cat# 514104), 15 µ hurtig Ligeringsbuffer(Enzymatics cat@ L603-LC-L), 0,33 µ 1% Tween – 20 og 0.5 µ t4 DNA-ligase HC (Enzymatics L6030-HC-L) og inkubert i 15 min VED RT. 7@L av 20% PEG8000/2,5 M NaCl ble tilsatt og inkubert i 10 min VED RT. Perle opprydding ble utført og perler ble eluert i 21 µ. 10 µ ble deretter brukt TIL PCR-forsterkning (14 sykluser) med iga-og IGB-primere(AATGATACGGCGACCACCGA, CAAGCAGAAGACGGCATACGA).

GRO-seq

Begynnende transkripsjon ble fanget opp av global nuclear run-on sequencing (gro-seq). Kjerner ble isolert fra TGEMs ved hjelp av hypotonisk lysis (10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 2 mM MgCl2, 3 mM CaCl2; 0.1% IGEPAL CA-630) og blits frosset I GRO-frysebuffer (50 mM Tris–HCl (pH 7,8), 5 mM MgCL2, 40% Glyserol). Run-on. 3-5 × 106 bmdm-kjerner ble kjørt på Med BrUTP-merkede Ntp–er med 3× NRO-buffer (15 Mm Tris-Cl (pH 8,0), 7,5 mM mgcl2, 1,5 mM DTT, 450 mM KCl, 0,3 U/µ AV SUPERase I, 1,5% Sarkosyl, 366 µ ATP, GTP (Roche), Br-UTP (Sigma 40 Aldrich) Og 1,2 µ CTP (Roche, for Å begrense kjørelengde TIL ~40 nukleotider)). Reaksjonene ble stoppet etter 5 min ved tilsetning av 500 µ Trizol ls reagens (Invitrogen), vortexed i 5 min og RNA ekstrahert og utfelt som beskrevet av produsenten. RNA-pellets ble resuspendert i 18 hryvnl ddH2O + 0,05% tween (dH2O + T) og 2 µ fragmenteringsblanding (100 mMZnCL2, 10 mM Tris-HCl (pH 7,5)), og deretter inkubert ved 70 °C i 15 min. Fragmenteringen ble stoppet ved tilsetning av 2,5 µ AV 100 mM EDTA. BrdU berikelse. Brdu-anrikning ble utført ved Bruk Av BrdU-antistoff (IIB5) og ac-perler (Santa Cruz, sc-32323 AC, lot # A0215 og # C1716). Perler ble vasket en gang med GRO-bindingsbuffer (0,25× saline-sodium-phosphate-EDTA buffer (SSPE), 0,05% (vol/vol) Tween, 37,5 mM NaCl, 1 mM EDTA) + 300 mM NaCl etterfulgt av tre vasker I GRO-bindingsbuffer og resuspendert som 25% (vol/vol) slurry med 0,1 U/µL SUPERase-in. For å fragmentere RNA ble det tilsatt 50 µ kald GRO-bindingsbuffer og 40 µ equilibrated BrdU-antistoffkuler og prøver ble langsomt rotert til 4 °C i 80 min. Perler ble deretter spunnet ned ved 1000 × g i 15 s, supernatant fjernet og perlene overført til En Millipore Ultrafree MC kolonne (UFC30HVNB; Millipore) i 2 × 200 hryvnias gro bindende buffer. IP-reaksjonen ble vasket to ganger med 400 µ GRO bindingsbuffer før RNA ble eluert ved inkubering i 200 µ Trizol LS (ThermoFisher) under mild omrøring i 3 min. Elueringen ble gjentatt en gang til, 120 µ dH2O + t tilsatt for å øke supernatanten og ekstrahert som beskrevet av produsenten. Slutt reparasjon og decapping: FOR slutt reparasjon og decapping ble RNA pellets oppløst i 8 µ TET (10 mM Tris–HCl (pH 7,5), 1 mM EDTA, 0,05% Tween 20) ved kraftig vortexing, oppvarmet til 70 °C i 2 min og plassert på is. Etter en rask spinn, 22 µL Repair master mix (3 µL 10× PNK-bufferen, kan du 15.5 μl dH2O + T, og 0,5 µL SUPERase-I RNase-Hemmer (10 U), 2 µL PNK (20U), 1 µL RppH (5U)) ble lagt, blandet og inkubert ved 37 °C i 1 time. For å phosphorylate 5’end, og 0,5 µL 100 mM ATP ble senere lagt til, og reaksjonene ble inkubert for ytterligere 45 min ved 37 °C (høy ATP-konsentrasjonen slukker RppH aktivitet). Etter endt reparasjon ble det tilsatt 2.5 µ 50 mM EDTA, reaksjonene ble blandet og deretter oppvarmet til 70 °C i 2 min før de ble plassert på is. En Annen BrdU-anrikning ble utført som beskrevet ovenfor. RNA-pellets ble oppløst i 2.75 µ tet + 0.25 µ Illumina TruSeq 3 ‘ Adapter (10 µ), oppvarmet til 70 °C i 2 min og plassert på is. 7 3’master blanding (4.75 µL 50% PEG8000, 1 µL 10× T4 RNA-ligase buffer, 0.25 µL SUPERase-I, 1 µL T4 RNA-Ligase 2 avkortet (200U; NEB) ble lagt, godt blandet og reaksjoner inkubert ved 20 °C for 1 h. Reaksjoner ble fortynnet med tillegg av 10 µL TET + 2 µL 50 mM EDTA, som varmes opp til 70 °C i 2 min, plassert på is og en tredje runde av BrUTP berikelse ble utført. RNA pellets ble overført TIL PCR strimler i løpet av 75% etanol vask og tørket. Prøver ble oppløst i 4 µ TET (10 mM Tris–HCl (pH 7,5), 0,1 mM EDTA, 0,05% Mellom 20) + 1 µ 10 µ revers transkripsjon (RT) primer. For å anneal RTprimer ble blandingen inkubert til 75 °C i 5 min, 37 °C i 15 min og 25 °C i 10 Min. For å ligate 5’ Illumina TruSeq adapter, 10 µL 5’master blanding (1.5 μl dH2O + 0.2% Tween 20, 0.25 µL denaturated 5’TruSeq-adapter (10 µM), 1.5 µL 10× T4 RNA-ligase buffer, 0.25 µL SUPERase-I, 0.2 µL 10 mM ATP, 5.8 µL 50% PEG8000, og 0,5 µL T4 RNA-ligase 1 (5U; NEB) ble lagt til og reaksjoner ble inkubert ved 25 °C for 1 h. Revers transkripsjon ble utført ved hjelp av Protoscript II (NEB) (4 µL 5× NEB FirstStrand buffer (NEB; E7421AA), 0.25 µL SUPERase-I, 0.75 µL Protoscript II (150U; NEB)) ved 50 °C for 1 h. Etter tillegg av 30 µL PCR master mix (25 µL 2× LongAmp Taq 2× Master Mix (NEB), 0.2 µL 100 µM forward primer, 2.8 µL 5 M betain og 2 µL 10 µM individuelle barcoding primer), blandinger ble forsterket (95 °C i 3 min, (95 °C i 60 s, 62 °C i 30 s, 72 °C i 15 s) x13, 72 °C i 3 min.). PCR-reaksjoner ble renset ved bruk av 1,5 volumer SpeedBeads (GE Healthcare) i 2,5 M NACL/20% PEG8000. Biblioteker ble størrelse valgt PÅ SIDE / TBE gels til 160-225 basepar. Gelskiver ble makulert ved å spinne gjennom et 0,5 mL perforert PCR-rør plassert på toppen av et 1,5 mL rør. 150 µ GEL EB (0,1% LDS, 1 M LiCl, 10 mM Tris–HCl (pH 7,8)) ble tilsatt og oppslemmingen inkuberes under omrøring over natten. For å rense eluert DNA ble 700 µ ZYMOGEN ChIP DNA-bindingsbuffer tilsatt i 1,5 mL røret som inneholdt den strimlede gelskiven og GEL EB, blandet ved pipettering og oppslemmingen overført Til En zymominielute-kolonne. Prøvene ble først spunnet til 1000 × g i 3 min, deretter 10 000×g i 30 s. Gjennomstrømmingen ble fjernet, og prøvene ble vasket med 200 µ Zymo WashBuffer (med EtOH). Gelrester ble fjernet ved å flikke og kolonner vasket ved tilsetning av en annen 200 µ Zymo WashBuffer (med EtOH). Gjennomstrømmingen ble fjernet, kolonner spunnet tørre ved sentrifugering ved 14 000 × g i 1 min og DNA eluert ved tilsetning av 20 µ forvarmet Sekvensering TET (10 Mm Tris-HCl (pH 8,0), 0,1 mM EDTA, 0,05% Tween 20). Biblioteker ble sekvensert.

Western blotting

Celler ble lysert Med Igepal lysisbuffer (50 Mm Tris pH 8,0, 150 mM NaCl, 0.5% Igepal) og proteinkonsentrasjoner ble bestemt Med BioRad protein assay reagens ved BRUK AV BSA som standard. Proteiner ble separert På NuPage 4-12% bis–Tris gradient gels (Invitrogen) og overført til en nitrocellulose membran (Amersham). Membraner ble blokkert i TBS med 0,1% Tween – 20 og 5% BSA. Membraner ble blottet med indikert primær over natten ved 4 °C. Pepperrot peroxidase-konjugerte sekundære antistoffer ble påvist VED BRUK AV ECL pluss western blotting detection system (Amersham).

Dyr og cellekultur

Tgemer ble samlet 3 dager etter injeksjon fra mannlige 8-ukers c57bl/6j–eller BALB/cJ-mus, og belagt med 20 × 106 celler per 15 cm Petriskål I DMEM pluss 10% FBS og 1× penicillin-streptomycin. En dag etter plating ble cellene supplert med friske medier og behandlet MED PBS (Veh) eller 100 ng / mL KLA i 1 time, og deretter direkte brukt til nedstrømsanalyser. iBMDM produseres ved infeksjon AV BMDM med et retrovirus som inneholder myc og Braf V600E66. De utødelige cellene vokser deretter ut over flere uker. Alle dyreforsøk ble utført i samsvar med de etiske standarder fastsatt Av University Of California, San Diego Institutional Annual Care And Use Committee (Iucac).

Lentivirus produksjon

plenguide ble modifisert for å inneholde En U6-bsmbi-spgRNA stillas og EN CMV promoter kjøring tagBFP2. 2 CRISPR guider ble satt inn for hvert mål via PCR forsterkning Med H1 promoter (bsmbi site / guide1 / scaffold / H1 promoter / guide 2 / bsmb1 site) for totalt 2 guider per virus (u6 og h1 drevet) (Supplerende Tabell 4). Viruset ble gjort med pVSVg / ppAX2 system. To dager etter transfeksjonen ble media samlet inn og sentrifugert ved 4 °C i 2 timer ved 20 000 hryvnias g. Cellepellet ble rekonstituert over natten ved 4 °C I OPTI-MEM og lagret ved -80 °C.

Produksjon AV CRISPR KO iBMDMs

KO iBMDMs ble produsert ved hjelp av lentiviral infeksjon. iBMDM-CAS9-IRES-EGFP ble infisert MED MOI 100, målt PÅ 293t-celler, Med Lentiblast (OZ biovitenskap) (5 µ hver reagens) I OPTI-MEM. Dette ble deretter sentrifugert ved 1300g for 1 h ved romtemperatur. Media ble deretter fjernet og celler ble supplert i benmargsmedier (30% L-celle, 20% FBS, 1% penicillin / streptomycin I DMEM) i 2 dager. Celler ble deretter sortert for infeksjon ved uttrykk for et transgen på viral sekvens (tagBFP2).

Rapporteringssammendrag

Ytterligere informasjon om eksperimentell design er tilgjengelig I Nature Research Reporting Summary knyttet til denne artikkelen.

Kode tilgjengelighet