Dobbel blokade AV CD47 og HER2 eliminerer radioresistente brystkreftceller

Cellelinjer

human brystkreft MCF-7, MDA-MB-231, BT474, BT549, SKBR3 cellelinjer, glioblastom U251 OG tykktarmskreft hct116 cellelinjer ble kjøpt fra ATCC. Mcf-7 -, MDA-MB-231 -, BT474 -, BT549-og U251-celler ble opprettholdt i DMEM-medium supplert med 10% FBS, OG SKBR3-celler opprettholdt I RPMI-1640-medium med 10% FBS. Hct116-celler ble opprettholdt I Mccoys 5a-Medium med 10% FBS. De radioresistente MCF7/C6-og mda-MB-231/C5-cellelinjene som ble klonet fra overlevende fraksjoner AV MCF7-og MDA-MB-231-celler etter gjentatt bestråling; her2-overuttrykkende brystkreftstamceller (HER2+/CD44+/CD24 – / lave BCSCs) ble isolert fra MCF7 / C626. Mus trippel-negativ brystkreft 4t1 celler ble opprettholdt I DMEM medium med 10% FBS. Humant monocytt THP-1 ble dyrket i ATCC-formulert rpmi-1640 medium supplert med 10% FBS, 15 mM HEPES, 4,5 g/l glukose og 2-merkaptoetanol til en endelig konsentrasjon på 0,05 mM.Mus Mφ RÅ 264.7 celler ble dyrket I DMEM medium med 10% FBS følgende MED ATCC kultur metode. Alle cellelinjer ble testet negativ mycoplasma-kontaminasjon Med MycoSensor PCR Assay kit (Agilent Technologies, Katalog # 302108).

Plasmider og reagenser

CD47 promoter-kontrollert luciferase vektor ble konstruert ved å klone DEN humane CD47 promoter region (-1554 nt) i pGL2-basisk plasmid Fra KpnI/Hind III steder. Slettingen av de antatte nf-kB-bindingsstedene (TGGAAGCT-764-757) ble utført ved bruk av et hurtigmutasjonssett (Stratagene, La Jolla, CA). Primersekvensene som brukes: 5 ′-GTGGTCGGGTACCTGCCCGCTCGCCCCTCGCGGGCTCTGCG-3′ (sense) and 5 ′-CGCAGAGCCCGCGAGGGGCGAGCGGGCAGGTACCCGACCAC-3′ (antisense).

pGL2-NF-κB-luc plasmid was constructed with the 3 NF-κB-binding sites: GTGGGTTCCC, TCGCCACTCCCC, and TGGAAAGTCCCC by blunt-end ligation. IMD-0354 (Catalog # I3159) and TNF-α (Catalog # T0157) were purchased from Sigma. The lentiCRISPR v2 vector was purchased from the Addgene plasmid repository (Catalog # 52961). Herceptin was obtained from the UC Davis Comprehensive Cancer Center Pharmacy as left-over medicine (Genentech, NDC 50242-132-01). Lapatinib (Katalog # S1028) ble kjøpt fra Selleckchem. Anti-CD47 (B6H12) antistoff FOR IHC, ICC og western blot ble kjøpt Fra Santa Cruz (Katalog # sc-12730). Anti-CD47-FITC for flowcytometri ble kjøpt fra BD Biosciences (Katalog # 556045). Anti-humant CD47 (B6H12) antistoff for fagocytose-analyse ble ekstrahert FRA b6h12. 2 hybridom(ATCC® HB-9771™). ANTI-mus CD47 antistoff for in vivo tumorinhibering ble ekstrahert FRA MIAP301 hybridom levert Av Dr. William Frazier (Washington University School Of Medicine). Anti-CD11b antistoff FOR IHC-farging ble kjøpt fra Invitrogen ( Katalog # MA5-17857). Mus monoklonalt anti-α-tubulin antistoff for western blot ble kjøpt Fra Sigma-Aldrich (Katalog # T6074). Mus monoklonalt anti-β-aktinantistoff for western blot ble kjøpt fra Sigma-Aldrich (Katalog # A5441). Anti-HER2 / ERBB2 (Katalog # 29d8) antistoff FOR IHC-farging og western blot ble kjøpt fra Cell Signaling Technology (Katalog # 2165). Anti-HER2-APC antistoff for flowcytometri analyse ble kjøpt FRA BD Biosciences (Katalog # 340554).

Immunoblotting

Proteiner fra celler eller tumorvev ble ekstrahert I RIPA lysisbuffer (Pierce) supplert med protease – og fosfatasehemmercocktail (Cellesignalering). Proteinkonsentrasjonen ble bestemt ved BRUK AV Bca-analysen (Pierce). Lysater ble deretter denaturert og prøver som inneholdt 30 µ proteiner ble utsatt for elektroforese i 10% sds-polyakrylamidgel, etterfulgt av overføring til polyvinylidendifluoridmembraner (Bio-Rad). Etter blokkering med 5% nonfat tørr melk ble membranen eksponert for det primære antistoffet og inkubert ved 4 °C over natten. Blott ble visualisert ved merking MED HRP-koblede sekundære antistoffer (Sigma-Aldrich) og inkubasjon med amersham ECL western blotting detection reagens (Katalog # RPN2106). Blots ble utviklet på En Konica SRX101A utvikler og kvantifisert Med ImageJ.

Flowcytometrianalyse

Innsamlede celler ble skyllet MED PBS inneholdende 0,5% BSA i PBS og cellepellets ble inkubert med fluorescensmerkede primære antistoffer ved 37 °C i 30 min, etterfulgt av vasking tre ganger med 0,5% BSA / PBS. Alle antistoffer ble titrert for å optimalisere tilstanden før de ble brukt på forsøket. Flowcytometry analyse ble utført VED HJELP AV FACS Canto II cytometer (BD) og påfølgende analyse ble utført Ved Hjelp Av FlowJo (Tree Star, Ashland, ELLER, USA) programvare. Gating strategiene var basert PÅ FSC og SSC egenskaper og ble satt opp for positive cellepopulasjoner I FITC, APC kanaler.Friske frosne HER2 positive og negative brystkreftvev ble levert av UC Davis Comprehensive Cancer Center Biorepository (IRB # 283665 og IRB # 218204) finansiert av UC Davis Comprehensive Cancer Center Support Grant (CCSG) tildelt Av National Cancer Institute (NCI P30CA093373) med all pasientinformasjon blokkert unntatt de diagnostiske resultatene. Ytterligere humane brystkreftpatologiske prøver, inkludert de unstained 4-µ tykke delene av formalin-fast paraffin-embedded (FFPE) parret primær brystkreft og tilbakevendende brystkreft, ble hentet fra department of pathology, Ohio State University MED irb-godkjenning (#2002H0089).

Immunhistokjemi (IHC)

Immunhistokjemisk farging ble gjort på 4-µ tykke ffpe vevsseksjoner. Kort sagt ble lysbildene deparaffinisert og rehydrert, og antigener ble hentet i 40 min i en citratbuffer (pH 6.1) ved 95 °C. Endogen peroksidaseaktivitet ble blokkert med 3% h2o2-oppløsning. Den primære antistoffinkubasjonen ble utført ved 4 °c over natten, etterfulgt Av Vectastain ABC-Settet (Vector Laboratories) VED RT i 30 minutter i henhold til produsentens instruksjoner. Reaksjonsproduktene ble påvist ved Bruk Av Peroksidasesubstrat Kit og counterstained med hematoxylin (Vector Laboratories). To eldre patologer hadde ansvaret for diagnosen klinikk brystkreft og evaluering av eksperimentelle svulster. CD47-uttrykket ble evaluert ved å bruke både fargeintensitet og prosentandel av fargede celler. Fargeintensiteten ble gradert som 0: negativ; 1: svak; 2: moderat; 3: sterk. Høyt uttrykk ble definert som sterk fargeintensitet i mer enn 25% av tumorcellene; medium uttrykk var moderat fargeintensitet i mer enn 25% av tumorcellene; lavt uttrykk var svak fargeintensitet i mer enn 25% av tumorcellene eller moderat farging i <25% av tumorcellene ved BRUK AV asco-CAP guidelines63 ble brukt til tolkning AV her2 immunhistokjemi (IHC), OG her2 proteinuttrykk ble scoret som negativ IHC 0 (ingen farging eller membranfarging som er ufullstendig og er svak/knapt merkbar og innenfor ≤10% av de invasive tumorcellene) eller negativ IHC 1+ (ufullstendig)membranfarging som er svak/knapt merkbar og innenfor >10% av de invasive tumorcellene); equivocal IHC 2+ (circumferential membranfarging som er ufullstendig og/eller svak/moderat og innenfor >10% av de invasive tumorcellene; og eller komplett og circumferential membranfarging som er intens og innenfor ≤10% av de invasive tumorcellene); Positiv IHC 3+ (circumferential membranfarging som er komplett, intens i mer enn 10% av de invasive tumorcellene). Hvis resultatene var tvetydige (2+), ble refleks testing utført ved bruk av in situ hybridisering (ISH). VED påvisning AV CD47-ekspresjon av in vivo-bestrålede svulster ble behandlede musesvulster fjernet og festet i 4% paraformaldehyd i PBS for 24 h. prøvene ble dehydrert med serie etanol (70%, 95% og 100%) for 48 h før de ble innebygd i paraffinoppløsningen (Polysciences).

Immunocytokjemi (ICC)

Celler ble sådd på runde dekkglass og vokst til 60-80% sammenløp, etterfulgt av skylling MED PBS, fiksering i 4% paraformaldehyd (pH 7,2) og permeabilisering med 0,1% Triton X-100 I PBS. Cellene ble deretter inkubert i en blokkeringsløsning i 15 minutter før inkubering med det primære antistoffet over natten ved 4 °C med fortynninger på 1:250. Celler ble inkubert MED TR – eller FITC-konjugerte sekundære antistoffer fortynnet 1: 1000 i blokkeringsløsningen i 1 h ved romtemperatur i mørket og analysert med konfokal mikroskopi.

Identifikasjon av strålingsassosierte antigenproteiner

C57/B6 mus ble brukt som immuniseringsverten med 5 × 106 MCF7/C6 celler i 0.1 ml volum injisert ved haleroten eller footpad per mus, etterfulgt av å øke med samme volum av celler på 14th dag. På 5–-7. dag etter den andre utfordringen ble musene euthanisert og serumet ble samlet for å oppdage antigenmolekyler uttrykt i radioresistente BC-celler. For å skille RAAPs fra ikke-spesifikke molekyler uttrykt i normale brystepitelceller og villtype MCF7-celler, ble det utført en pre-clean-prosedyre med råserumet ved hjelp av følgende trinn. To millioner HUMANE normale brystepitelceller MCF10A ble fremstilt i en oppløsning inneholdende 1 mm EDTA / PBS uten trypsin for å unngå å fordøye noen av de sensitive proteinene, etterfulgt av skylling med PBS to ganger. Cellene ble pelletert og deretter løsnet ved å trykke på bunnen av røret etterfulgt av å tilsette 1 ml anti-sera for mus og rotere ved 4 °C i 2 timer. blandingen ble deretter sentrifugert ved 9391 × g i 5 min ved 4 °C og supernatantene ble samlet, som ble gjentatt en gang. Den første rensede antiserum ble ytterligere rengjort ved inkubasjon MED VILLTYPE MCF7-celler ved hjelp av de samme prosedyrene og gjentatt seks ganger. Det endelige rensede antiserumet ble deretter testet av western blot mot proteinlysat FRA MCF10A-celler, MCF7-celler, MCF7/C6 og RD-BCSC-celler som ble sortert etter brystkreftstamcellemarkører HER2 + / CD44 + / CD24-samt aldehyd dehydrogenase (ALDH)64. CD47 og HER2 sammen med Andre RAAPs i RADIORESISTENTE BC-celler ble identifisert ved western blots eller ved immunoprecipitasjon av membranproteiner renset fra RD-BCSC-celler, og de eluerte fraksjonene ble analysert via LC / MS. de resulterende membranraaps ble gruppert med et antall proteiner og proteinfunksjonelle kategorier.

CRISPR redigering AV HER2 og CD47

sgrna ble designet etter instruksjon publisert Av Dr. Zhang Labs CRISPR design software (http://crispr.mit.edu) og den etablerte protokollen som er beskrevet i forrige publikasjon65. Fire Oligos ble utformet tilsvarende de humane sgrna ble syntetisert og klonet i lentiCRISPR v2 vektor etter Zhang Lab Gecko samlet bibliotek forsterkning protokollen. For å minimere muligheten for ikke-spesifikk målretting ble tre sgrna-oligoer av hvert målrettingsgen syntetisert og testet. SgRNA med den beste knockout effektiviteten bestemt av western blotting ble valgt for etterfølgende eksperimenter. Sgrna-sekvensene ble brukt for humane og musceller som følger:

hHer2gRNA_F: CACCGCGGCACAGACAGTGCGCGTC

hHer2gRNA_R: AAACGACGCGCACTGT CTGTGCCGC

hCD47gRNA_F: CACCGTAAATATAGATCCGGTGGTA

hCD47gRNA_R: AAACTACCAC CGGATCTATATTTAC

mHer2gRNA_ F: CACCGTGATGGCCCTCGCCCCTCGG

mHer2gRNA_ R: AAACCCGAGGGGCGAGGGCCATCAC

mCD47gRNA_F: CACCGCCCTTGCATCGTCCGTAATG

mCD47gRNA_R: AAACCATTACGGACGATGCAAGGGC

The lentiviral particles were generated using 293T cells following the protocol from Addgene. For gene editing, the isolated BCSC sphere cells or MCF7/C6 cells were trypsinized into single cells and plated 1. 2.5 × 105 cells/0.5 ml per well in the 12-well plates. Etter inkubering i 12 timer ble 1 ml virusholdig supernatant med 8 ng polybren tilsatt til cellene etterfulgt av inkubasjon i 6 timer. deretter ble 0,5 ml ekstra vanlig medium inneholdende 10% varmeinaktivert FBS tilsatt og videre dyrket for natten. Infeksjonsmediet ble erstattet med 2 ml ferskt medium med 10% FBS og dyrket i 72 timer. Celler ble sendt til 60 mm vevskulturretter og valgt ved dyrking i 0,3 µ / ml Puromysin i 1 uke, og knockout av det målrettede genet ble verifisert ved immunoblotting.

Luciferase assay

Celler ble transfisert med pGL2-basic-CD47 eller pGL2-basic-CD47-HRYVNF-kB eller pGL2-NF-kB luciferase reportere, og luciferase aktivitet ble målt Ved Luminometer (Promega, Madison, WI). For normalisering av reportertransfeksjonseffektiviteten ble den totale proteinkonsentrasjonen av lysater målt MED Bca Protein Assay kit (Pierce, Rockford, IL) med BSA som standard.

analyse Av Kromatinimmunoprecipitasjon (ChIP)

Celler ble kryssbundet med formaldehyd (1% endelig) i 10 minutter, vasket med iskald PBS og samlet i SDS lysisbuffer (1% SDS, 10 mM EDTA, 50 mM Tris, pH 8. 1). Kromatin ble skåret av sonikering, pre-cleared med protein G konjugerte agaroseperler og inkubert med anti-p65, anti-c-Rel eller normal IgG ved 4 C over natten. Etter at protein G ble tilsatt i 2 timer ved 4 °C, ble komplekset vasket på en sekvensiell måte med lav og høy salt immunkompleks vaskebuffere (0. 1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris-HCl pH 8.1 pluss 150 mM NaCl for lavt salt og 500 mM NaCl for høyt salt buffere) etterfulgt AV TE buffer (to ganger). Dna-transkripsjonsfaktorinteraksjonen ble reversert etter tilsetning av NaCl og inkubasjon ved 65 °c over natten. ETTER RNase a og Proteinase K ble DNA-fragmenter renset ved ekstraksjon av fenol / kloroform og etanolutfelling. DNAs ble renset OG brukt TIL PCR med primere som er spesifikke for genpromotor-regionen som omfatter nf-kB-bindingssteder. CD47 primere var:

5′-CGTGGACCAGGACACCTAGG-3′ (sense)

5′-AGGGAAGAGAACCGCATAGG-3′ (antisense)

The PCR amplification of the IκB promoter region (1134/902) was also included as positive. The primers for NF-κB-binding site in the IκB promoter were:

5′-TGTAGCACCCATTAGAAACACTTC-3′ (sense)

5′-TTCTTGTTCACTGACTTCCCAAT-3′ (antisense).

Preparation of anti-human and anti-mouse CD47 antibodies

Hybridoma for monoclonal mouse anti-human CD47 antibody (B6H12.2), IgG2b were obtained from ATCC. Monoklonalt rotte ANTI-mus CD47 IgG2a antistoff (MIAP301) og hybridom ble hentet fra Dr. William Frazier (Washington University School Of Medicine). Begge hybridomcellelinjene ble opprettholdt I IMDM-medium med 20% FBS. Antistoffer ble renset fra hybridom supernatant ved hjelp av protein G Harpiks Fra GenScript ( Katalog # L00209) etter produksjon standard prosedyrer. Prøvene ble deretter ytterligere konsentrert 10-20 ganger ved Hjelp Av Mikrosep sentrifugale enheter Fra Pall Life Sciences. Konsentrasjoner av renset IgG ble bestemt ved å måle absorbansen VED OD280.

Fagocytoseanalyse

Både Humane monocytt – thp1-celler og Mus Mφ Rå 264,7-celler (ATCC, TIB-71) ble opprettholdt i en 5% CO2-inkubator ved 37 °C66 ved en omtrentlig tetthet på 1 × 106/ml. Omtrent 0.8 × 106 celler/ml RÅ 264.5 celler eller 1 × 106 THP1 celler ble sådd på en 6-brønnsplate. ETTER 24 timer med inkubasjon BLE RÅ 264,7 celler aktivert ved behandling med 0,1 µ / ml lipopolysakkarid (LPS) i 24 timer. Monocytt THP1-celler ble differensiert Med Phorbol 12-myristat 13-acetat (PMA) (40 nM) i 48 timer. Aktiverte makrofager ble farget Med Dio ved endelig konsert 40 nM i et medium for 20 min etterfulgt av skylling tre ganger med medium. Kreftceller var merket med 1 µ DDAO (5 mM lagerløsning i DMSO lagret til -20 °C) i PBS ved 37 °C i 15 min og vasket med PBS inneholdende 1% FBS. DDAO-merkede målceller (1 × 106) ble tilsatt Til DIO-beiset Mφ og inkubert i et sluttvolum på 2 ml ved 37 °C i 2 timer. Etter inkuberingen ble Mφ og målceller høstet med TRE GANGER EDTA-PBS vask etterfulgt av 0,25% trypsinisering. Fagocytose ble vurdert ved å evaluere de dobbeltmerkede cellene (DIO+ / DDAO+), som representerer fagocytiserte brystkreftceller ved modne Mφ, via flowcytometri. FlowJo-programvaren ble brukt til analyse.

Klonogen overlevelsesanalyse

Klonogen overlevelsesanalyse ble utført etter stråling med eller uten behandling (Lapatinib, 10 µ for 72 timer; anti-CD47 antistoff 10 µ/ml over natten). De behandlede cellene ble dyrket i 10-14 dager og kolonier ble løst, farget Med Coomassie blå flekk. Kolonier som inneholder mer enn 50 celler ble regnet som overlevende kloner og normalisert til plating effektiviteten av hver humbug-behandlet tumorcellelinje.

gap-fylling rate assay

Gap-fylling kapasitet ble målt med 1 × 106 celler dyrket i hver av 6-brønnplater til 100% confluence etterfulgt av 24 t celle sult. Da ble gapet opprettet ved å skrape parabolen diagonalt med en steril pipettespiss. Cellene ble enten ubehandlet eller behandlet med 10 µ/ml IgG eller anti-CD47 antistoff i løpet av forsøket. Påfyllingskapasiteten ble overvåket i 72 timer og representative bilder ble tatt på dag 0 (skrapedag) og dag 3.

Tumordannelse

Celler ble siktet med 40 µ cellesiler (Katalog # 352340. Corning) og single-celle suspensjoner ble sådd i lav-vedlegg 60 mm Petriskåler med en tetthet på 1000 celler / ml. Cellene ble dyrket i serumfritt brystepitelial basal medium (MEBM), supplert Med B27 (Katalog # 17504-044. Livsteknologi), 20 ng/ml EGF (Katalog # 4022-500. Bio-visjon), 20 ng/ml grunnleggende-FGF (Katalog # 13256-029. Invitrogen), og 4 µ / ml heparin (Katalog # 80603-686 EMD MILLIPORE). Celler ble dyrket i 10 dager og svulstkuler ble talt under lysmikroskopi.

transwell invasjon analyse

Alikvoter (0. 4 ml) Av Matrigel (Katalog # 356231. BD Biovitenskap) ble fortynnet i overflatebehandlingsbuffer: 0,01 M Tris (pH 8,0), 0,7% NaCl til den endelige konsentrasjonen på 200-300 µ / ml. Om 100 µ ble lastet inn i det øvre kammeret av 24-brønn transwell (Katalog # 3422. Costar) og inkubert til 37 °C for gelering ca 1 h. Fjern forsiktig den gjenværende overflatebehandlingsbufferen fra den permeable støttemembranen uten å forstyrre laget, og legg deretter til celler (2,5 × 104/ml). Det nedre kammeret var fylt med 800 µ AV MEM media som inneholdt 5 µ / ml fibronektin ( Katalog # SC-29011. Santa Cruz). Transwell med forskjellig behandlede celler ble inkubert i 48 h og farget Med Diff-Quick Stain kit (Katalog # K7128. IMEB INC).

Fremstilling Av F (ab’)2 fragmenter

CD47 F (ab’)2 fragmenter ble produsert Ved papainharpiksspaltning Av IgG ved bruk Av Et f (ab’)2 preparasjonssett (Katalog # 786272. G-Bioscience) i henhold til produsentens anbefalinger og rapporterte prosedyre67. Etter papainfordøyelse ble Fab-fragmentet separert Fra ufordøyd IgG og Fc-regionen med Protein A Spin-Kolonnen fra Fab-Fragmenteringssettet. SPINOUT GT-600 avsaltingskolonner ble levert for å sikre at den første antistoffprøven var den optimale tilstanden For Fab-fragmentering, og det rensede ANTI-mus CD47 IgG ble samlet for in vivo musetumorbehandling.

Stråling AV BC-celler MED CRISPR-KO CD47 og/ELLER HER2

for in vivo− test av tumorinhiberingseffekt ved stråling med MANGELFULL CD47− og HER2− status, ble 5 × 105 4T1/C2− celler med CRISPR−knockout AV CD47 (CD47−/−), HER2 (HER2−/ -) ELLER dobbel (CD47 – / – /HER2 -/ -) implantert I brystfettputer AV BALB/c (n = 6 per gruppe). Tumorvekst ble vurdert ved å måle tumorvolumet hver 2. dag fra og med dag 7 til tumorvolumet nådde begrensningen. For å vurdere radiosensitiviteten til svulster med forskjellig STATUS CD47 OG HER2, ble lokal tumorstråling levert med 5 Gy til hver tumor ved dag 9 og tumorvekst ble målt annenhver dag til kontrolltumorene nådde maksimal begrensning.

RT av mus BC med anti-CD47-og / ELLER her2-behandling

for in vivo-tester av tumorinhibering med et enkelt CD47-antistoff i nærvær eller fravær av strålebehandling fulgte ANTI-CD47-behandling protokollen Av Willingham et al20 med noen modifikasjoner. Åtte uker gamle immunkompetente (BALB/c) hunnmus (Charles River Laboratories, Sacramento, USA) ble injisert med 1 × 105 musebryst 4t1 celler i 4.brystkjertler. Femti mikroliter PBS inneholdende 100 µ av kontroll IgG eller anti-CD47 F (ab’) fragmenter ble injisert i tumorstedet (dag 1) eller i tumorvevet (dag 15) og gjentatt annenhver dag til slutten av forsøkene. Tumorvolumer ble overvåket hver 5. dag. For strålebehandling, anti-CD47 eller stråling kombinert med ANTI-CD47 ble dyrene med 4t1 svulster tilfeldig delt inn i ulike behandlingsgrupper og en kontrollgruppe (5-10 mus per gruppe). Tumor lokal stråling startet når tumorvolumet når 200 mm3 MED GRAN (5 Gy / dag / tumor for fire fraksjoner ved bruk av mikrostråle IR kilde; total dose = 20 Gy) kombinert med tre ganger tumorinjeksjoner av ANTI-CD47 f (ab’). Radiosensitiviteten til de in vivo bestrålede svulstene med tilstedeværelse eller fravær av ANTI-CD47 F (ab’) ble evaluert ved å måle tumorvolum ved slutten av forsøkene. Dyrene ble avlivet når svulstene var ~1400 mm3 eller når dyrene syntes å være ubehagelig selv når svulsten var mindre enn 1400 mm3 for å overholde ucd IACUC forskrifter for bruk av virveldyr i forskning. Animal use and care protocol for in vivo strålebehandling ble godkjent av Institutional Animal Use and Care Committee ved University Of California Davis (IACUC 15315).

for in vivo-tester av tumorinhibering med doble antistoffer MOT CD47 OG HER2 i nærvær eller fravær av strålebehandling, ble åtte uker gamle immunkompetente (BALB/c) hunnmus (Charles River Laboratories, Sacramento, USA) injisert med 1 × 105 musebryst 4t1-celler i 4.brystkjertler. Når tumorvolumene nådde omtrent 200 mm3, ble musene tilfeldig delt inn i fire grupper (6 mus per gruppe). Pbs, IgG, anti-CD47 F (ab’) fragmenter (100 µ) eller Herceptin (5 mg/kg) ble injisert i tumorvev 4 timer før lokal strålebehandling (5 Gy per dag i 2 dager). Injiseringer ble utført og tumorstørrelser ble overvåket annenhver dag til slutten av forsøkene. Mus ble avlivet når svulstene var ~1400 mm3 eller når dyrene syntes å være ubehagelig selv når svulsten var mindre enn 1400 mm3 for å overholde ucd IACUC forskrifter for bruk av virveldyr i forskning. Animal use and care protocol for in vivo strålebehandling ble godkjent av Institutional Animal Use and Care Committee ved University Of California Davis (IACUC 15315).

Tumorinfiltrerte makrofager og makrofagfagocytose

gfp-uttrykkende musebrystkreft 4t1-celler ble implantert i 4. brystfettputer AV BALB / c-mus og behandling ble startet når svulster oppnådde ca. 200 mm3 ved tumorinjeksjon av 50 µ pbs inneholdende 100 µ Kontroll IgG, anti-CD47 F (ab’) fragmenter, Herceptin eller begge antistoffer annenhver dag tre ganger. Tumor lokal RT ble levert på dag 10 og 11 med 5 Gy / dag / tumor i to fraksjoner, total dose = 10 Gy, og forsøkene ble avsluttet 2 dager etter avsluttet antistoffbehandling. Tumorer ble ekstrahert og ffpe-seksjoner ble forberedt for immunfluorescensfarging for å følge standardprosedyren: lysbildene ble deparaffinisert og rehydrert, og antigener ble hentet for 40 min i en citratbuffer (pH 6.1) ved 95 °c. for å fjerne autofluorescens ble lysbildene socked i de-autofluorescensløsning (0.5 M CuSO4, 0.05 M NH4COOH I H2O) VED RT for 48 h, skyllet med vann 5 min 3times, deretter blokkert med 1:100 hest serum. Den primære antistoffinkubasjonen ble utført ved 4 °C over natten: anti-GFP (1:100; Dako), anti-CD11b (1: 100; Millipore); Etter vask ble lysbilder inkubert med 1:250 fortynnede fluorescerende konjugerte sekundære antistoffer (Rhodamin For CD11b, Alexa Fluor 488 FOR GFP) VED RT i 1 h og deretter montert Med Vectashield Antifade-løsning inneholdende DAPI (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA). Makrofagmediert fagocytose ble påvist med fluorescerende mikroskopi Ved Hjelp Av Axiovision software (Zeiss, Tyskland) og mikrofotografier ble kvantifisert Av ImageJ.

Statistisk analyse

alle eksperimentelle data hentet fra in vitro cellulære studier og dyreforsøk presenteres som gjennomsnittlig ± SE, analysert ved hjelp Av to-tailed Student t-test for to grupper eller ANOVA for flere grupper. Den statistiske signifikansen Av Kaplan-Meier overlevelseskurver ble vurdert Med En Mann-Whitney test. Antall uavhengige eksperimenter og replikater ble angitt i figurlegendene. P-verdier < 0,05 ble ansett å være signifikante og er angitt med stjerner som følger: * P < 0.05, * * P < 0,01, * * * P< 0,001, ****P< 0,0001.

Rapporteringssammendrag

Ytterligere informasjon om forskningsdesign er tilgjengelig I Nature Research Reporting Summary knyttet til denne artikkelen.