Abstract
Microsporidia er obligate intracellulære eukaryote organismer som finnes i et bredt spekter av virveldyr og virvelløse verter. Encephalitozoon cuniculi finnes ofte hos tamkaniner og gnagere, og forekommer også hos hunder, andre hunder og primater, inkludert mennesker. DNA-sekvensering av ribosomale rna-gener har blitt brukt til å identifisere disse parasittene til et artsnivå og å definere e. cuniculi-stammer I, II OG III. Åtte nye hundisolater ble karakterisert Som E. cuniculi-stamme III ved bruk av molekylære metoder. Denne stammen har også blitt identifisert i isolater fra immunkompromitterte mennesker, noe som tyder på det zoonotiske potensialet til denne parasittarten. Langvarig microsporidial spore shedding fra asymptomatiske hunder er også rapportert.Encephalitozoon cuniculi er en obligat intracellulær protozoan av phylum Microspora og er en vanlig parasitt av tamkaniner og gnagere. Av og til har disse parasittene blitt rapportert hos andre verter, inkludert hunder, blårev (Alopex lagopus) og et lite antall andre ville rovdyr . Økende antall rapporter beskriver også klinisk sykdom hos mennesker forårsaket Av E. cuniculi, men kilden (e) til menneskelig infeksjon er ukjent .Historisk sett var parasittidentitet basert på morfologiske og noen ganger ultrastrukturelle egenskaper. Nylig har morfologisk liknende medlemmer Av Encephalitozoon-slekten blitt speciert ved bruk av immunologiske egenskaper og molekylær karakterisering av ribosomale RNA-gener . Isolater Av e. cuniculi har blitt videre delt som stammer I, II eller III, basert på antall repetisjoner av en 4-basesekvens (5 ‘- GTTT-3’) i den interne transkriberte spacer (ITS) – regionen av det ribosomale RNA-genet . To hund e. cuniculi isolater ble betegnet stamme III på grunnlag av tilstedeværelsen av 4 sekvensrepetisjoner . Deretter har ⩾4 humane isolater blitt identifisert SOM stamme III (isolater «Donovan» GenBank X98466, CDC:V282 og IPZ:MX-H5) og som stamme I i to rapporter Fra Europa . Denne studien utvider det arbeidet ved å identifisere 8 ekstra hundisolater Av E. cuniculi fra 4 utbrudd SOM stamme III. selv om ingen epidemiologiske data har direkte bekreftet overføring fra hund til menneske, tyder molekylære data på at hunder kan tjene som potensielle reservoarer av parasitter. I tillegg er langtidsspredning av sporer fra asymptomatiske hunder dokumentert, noe som ytterligere styrker sannsynligheten for zoonotisk overføring av parasitten.
Materialer og Metoder
Parasittisolater
kroppene til 7 valper fra 3 urelaterte kull og 1 hund ble sendt over 18 måneder Til Texas Veterinary Diagnostic Laboratory for postmortem evaluering. Dyrene var fra fire urelaterte kilder fra forskjellige regioner I Texas. En diagnose av encephalitozoonose ble gjort i hvert tilfelle på grunnlag av histologiske funn. Åtte parasittisolater ble etablert fra friske vev av dyrene: 5 isolater ble avledet fra hjerne-eller nyrevev av 5 til 7 uker Gamle Boston terrier valpekullmates (2 menn, 3 kvinner) som døde av nevrologisk sykdom (isolater 1-5, kull 1). Isolere 6 ble avledet fra hjernen til en 10 uker gammel mannlig Maltesisk terrier som var 1 av 4 kullmates (kull 2) som døde av nevrologisk sykdom. Isolate 7 ble avledet fra hjernen til en 10 uker gammel kvinnelig miniatyrpuddelvalp (kull 3) som døde av nevrologisk sykdom. Isolate 8 ble avledet fra nyren til en 18 måneder gammel kvinnelig miniatyrdachshund som døde av nyresvikt (tabell 1).
Oppsummering av hundens isolater karakterisert Som Encephalitozoon cuniculi stamme III ved molekylær analyse.
Oppsummering av hundens isolater karakterisert Som Encephalitozoon cuniculi stamme III ved molekylær analyse.
ved postmortem ble vev samlet aseptisk og homogenisert (Ti Broeck vevshomogenisator; Corning, Corning, NY) ved BRUK AV PBS, pH 7.2, pluss 2× antibiotika-antimykotisk løsning (Gibco, Gaithersburg, MD). Mikrosporidiale sporer ble renset fra vertsvevshomogenat ved hjelp av en tidligere beskrevet Perkoll tetthetsgradientmetode modifisert ved å endre sentrifugeringshastigheten til 600 g . Mikrosporidiene ble dyrket I rk-13-celler (ATCC CCL-37) ved BRUK AV rpmi 1640 medium supplert med 5% føtalt bovint serum og 2× antibiotisk-antimykotisk oppløsning (Gibco) som tidligere beskrevet . Parasittkultur og DNA-analyse ble gjort over flere måneder basert på mottak av de ulike case-prøvene, så muligheten for utilsiktet krysskontaminering var ubetydelig.
DNA-isolasjon
for isolater 1-6 og 8 ble parasitter dyrket i kortsiktig kultur for å generere tilstrekkelige sporer for molekylær karakterisering. For isolat 7 ble parasitter direkte renset fra fersk valp hjernevev FOR DNA-isolasjon. FOR de fleste isolatene ble DNA ekstrahert fra rensede sporer ved Hjelp Av Instagene Matrix (BioRad, Hercules, CA), etter produsentens protokoll for bakteriekulturer . For noe av det molekylære arbeidet med isolater 6 og 8 ble sporer behandlet som tidligere beskrevet , OG DNA ble ekstrahert fra sporer ved hjelp av en standard fenolkloroform ekstraksjonsmetode ved hjelp av et partisjoneringsgel-mikrofugerørsystem (light phase Lock Gel system; 5 Prime→3 Prime Produsent, Westchester, PA) for å optimalisere DNA-utvinning. DNA ble etanol utfelt, pelleten ble resuspendert I TE (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7,6), OG DNA-konsentrasjonen ble estimert ved Hjelp Av A260 : A280-forhold VED UV-spektrofotometri (Ultraspec Plus; Pharmacia, Piscataway, NJ). DNA ekstrahert fra vevskultur-avledede sporer Av Encephalitozoon hellem ble brukt som en positiv kontroll, og en reagens-bare negativ kontroll ble inkludert i alle ekstraksjons-og sekvenseringsreaksjoner.
DNA-partiell sekvensering og analyse av DET lille subenheten ribosomale DNA-genet (SSU rRNA)
en del av 5′ – enden AV SSU rRNA-genet fra hver av de 8 isolatene ble forsterket ved bruk av primerpar PMP1 og PMP2, som tidligere beskrevet . Polymerasekjedereaksjonen (PCR) for hvert isolat ble utført etter produsentens instruksjoner (GeneAmp PCR core reagents, N808-0009; Perkin-Elmer Cetus/Roche Molecular Systems, Branchburg, NJ). Forsterkningen ble gjort i en termisk syklus (PTC-200 Peltier; MJ Research, Watertown, MA). Etter innledende denaturering i 5 min ved 95°C ble Taq polymerase (0,5 U) lagt til hver 25-µ reaksjon. Prøvene gjennomgikk deretter 35 sykluser med denaturering (94 hryvnias C, 30 s), gløding (60 hryvnias C, 30 s) og forlengelse (72 hryvnias C, 1 min) etterfulgt av 10 minutter ved 72 hryvnias C for endelig forlengelse. Uinkorporerte nukleotider ble fjernet ved hjelp av kromatografikolonner (Micro Bio-Spin 30; BioRad). Prøvene ble holdt ved 4°C inntil de ble behandlet for automatisert sekvensering.
DNA-analyse AV ITS-regionen
en del AV ITS-regionen av det ribosomale RNA-genet i hvert isolat ble forsterket AV PCR med int530f og int580r-primerparet ved hjelp av forsterkningsmetodene beskrevet ovenfor. DET RESULTERENDE PCR-produktet ble sekvensert i en automatisert DNA-sequencer (modell 377; Perkin-Elmer Applied Biosystems / Roche Molecular Systems, Branchburg).PCR-forsterket DNA fra hvert isolat ble forsterket for automatisert sekvens med et kommersielt sett (ABI Prism Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready-Reaction Kit); Promega, Madison, WI) følger produsentens instruksjoner. Alle reaksjoner ble kjørt i en termocycler (MJ Research Minicycler). Prøvene gjennomgikk deretter 35 sykluser med denaturering (94 hryvnias C, 30 s), gløding (60 hryvnias C, 30 s) og forlengelse (72 hryvnias C, 1 min) etterfulgt av 10 minutter ved 72 hryvnias C for endelig forlengelse. Utvidelsesprodukter ble renset ved hjelp av kromatografikolonner( Micro Bio-Spin; BioRad), tørket i en vakuumsentrifuge (Savant Instruments, Holbrook, NY) og lagret ved -20°C til sekvensert i en automatisert sequencer (Perkin-Elmer 377 ABI Applied Biosystems).
ved bruk av justeringsprogramvare (Sequencher; Gen Codes, Ann Arbor, MI) ble konsensussekvenser av ∼265 baser oppnådd for en del AV SSU rRNA-genet for hvert parasittisolat. Disse sekvensene ble evaluert for homologi mot tidligere rapporterte Encephalitozoon-sekvenser i NCBI GenBank-databasen ved hjelp av et enkelt BLASTN-søk.
Dobbeltstrenget DNA heteroduplex mobilitetsanalyse
DNA fra isolat 6 ble forsterket AV PCR med primerparet int530f og int580r som tidligere beskrevet . DE PCR-forsterkede produktene ble analysert for generering av heteroduplekser og homoduplekser ved bruk av tidligere karakteriserte isolater Av E. cuniculi fra forskjellige verter.
Resultater
totalt 8 parasittisolater fra 4 separate kliniske utbrudd ble etablert i vevskultur. Både lysmikroskopiske egenskaper og in vitro vekstegenskaper av parasittene foreslo At de Var E. cuniculi, en microsporidian som tidligere ble rapportert hos hunder og andre verter. Delvis sekvensering av 5 ‘ enden AV HVERT isolats SSU rRNA-gen (GenBank AF144246–AF144253) bekreftet parasittenes identitet Som E. cuniculi, siden alle prøver viste 100% homologi med tidligere publiserte sekvenser (GenBank L39107dEZORGOA, L17072¦EZORGSMALL; X98470¦ECDSSRR2).Heteroduplex-analyse og sekvensering av dens region av det ribosomale RNA-genet karakteriserte videre alle hundeisolatene som stamme III, og bekreftet tidligere rapporter om subtile variasjoner blant e. cuniculi-isolater fra forskjellige gnagere, kaniner og menneskelige verter. Figur 1 illustrerer DNA homoduplex dannelse mellom hjørnetann isolere 6 og en tidligere karakterisert stamme III isolere samt heteroduplex dannelse mellom isolere 6 og de Andre e. cuniculi stammer.Figur 1
Heteroduplex mobilitetsanalyse som identifiserer Hundens Encephalitozoon cuniculi isolate (Ec) SOM stamme III. Baner: 1, baseparmarkører; 2 og 3, homoduplekser fra polymerasekjedereaksjon (PCR) amplikonum av parasitter fra valphjernen (BR) og nyrevev; 4-6, homoduplekser av hver e. cuniculi-stamme; 7 og 8, heteroduplexes dannet MELLOM PCR amplicons av parasitter fra valp nyre og e. cuniculi stammer I OG II (pil); 9 og 10, homoduplexes MELLOM PCR amplicons av parasitter fra valp nyre OG hjerne Og E. cuniculi stamme III, indikerer at DE er identiske I DNA-sekvens.Figur 1
Heteroduplex mobilitetsanalyse som identifiserer Hundens Encephalitozoon cuniculi isolate (Ec) SOM stamme III. Baner: 1, baseparmarkører; 2 og 3, homoduplekser fra polymerasekjedereaksjon (PCR) amplicon av parasitter fra valphjernen (BR) og nyre (KID) vev; 4-6, homoduplexes Av Hver e. cuniculi stamme; 7 og 8, heteroduplexes dannet MELLOM PCR amplicons av parasitter fra valp nyre og e. cuniculi stammer I OG II (pil); 9 og 10, homoduplexes MELLOM PCR amplicons av parasitter fra valp nyre OG hjerne og E. cuniculi stamme III, indikerer at DE er identiske I DNA-sekvens.
Diskusjon
den biologiske betydningen av flere stammer Av E. cuniculi har ennå ikke avklart; evnen til å skille mellom parasittstammer kan imidlertid gi et verktøy for å spore infeksjonskilder i epidemiologiske studier. Våre molekylære data identifiserer 8 microsporidian isolater fra hunder Som e. cuniculi stamme III enig med en tidligere studie som klassifiserte 2 hund isolater som stamme III . Kanin -, mus-og revisolater har blitt rapportert som stammer I ELLER II . Disse dataene tyder på at stamme III hovedsakelig kan være assosiert med hunder. Menneskelige isolater har blitt identifisert SOM stamme III PÅ Den Vestlige Halvkule og som stamme I I Europa . Selv om kilden (e) av menneskelig eksponering For E. cuniculi er ukjent, det er økende bevis på at dyr kan tjene som infeksjonsreservoarer, og det er mulighet for zoonotisk overføring av organismen mellom dyr og mennesker. Det er en interessant mulighet for at geografiske og kulturelle forskjeller i kjæledyrs eierskap kan spille en rolle i menneskelig eksponering, siden hunder er vanlige kjæledyr i Usa, mens kaniner ofte holdes som kjæledyr eller som mat i Sveits og Andre Europeiske land.
Undersøkelse av fekal – og urinprøver fra klinisk normale Bostonterrierforeldre og 1 valp fra kull 1 viste lave nivåer av sporeavgivelse for ⩾4 måneder etter kullmates dødsfall(isolater 1-5; upubliserte data). Denne observasjonen antyder videre en mulig mekanisme for direkte eller indirekte overføring av parasittene fra hunder til mennesker gjennom forurensning av lokaliserte miljøer med hunds urin og fekal utskillelse. Selv om ingen epidemiologisk studie har vurdert forholdet mellom kjæledyrs eierskap/eksponering og menneskelige mikrosporidiale infeksjoner, i et enkelt tilfelle hvor barn ble utsatt for valper med åpen encephalitozoonose, ser 1 av 3 barn serokonvertert . Ytterligere e. cuniculi isolater fra ulike verter må analyseres for å vurdere risikoen for å opprettholde potensielt infiserte kjæledyr i husholdningene til immunkompromitterte personer med høy risiko for mikrosporidiale infeksjoner.
Takk
Vi takker Texas Veterinary Medical Diagnostic Laboratory patologer Jay Hoffman, Joanne Mansell og Bruce Abbitt for å gi hundevev til denne studien.
.
.
,
,
(s.
–
,
.
,
,
, vol.
(s.
–
) – >
,
,
, et al.
,
,
, vol.
(s.
–
)
,
.
,
,
, vol.
s.
.
,
,
, vol.
(s.
–
)
, et al.
,
,
, vol.
(s.
–
,
.
,
,
, vol.
(s.
–
,
,
,
,
.
,
,
, vol.
(s.
–
,
.
,
,
, vol.
(s.
–
.
,
,
, vol.
(s.
–
) – >
,
,
. ,
,
2.utg.
.
,
,
, vol.
(s.
–
)
,
,
.
,
,
, vol.
(s.
–
) ,
Stewart.
,
,
, vol.
(s.
–
)
denne forskningen ble finansiert av grant AI-40232 Fra National Institutes Of Health.