Definisjon
Fluorescerende merking er prosessen med å binde fluorescerende fargestoffer til funksjonelle grupper som finnes i biomolekyler, slik at de kan visualiseres ved fluorescens imaging (nature.com). tilgjengeligheten av nye fluoroforer har dramatisk endret mulighetene for sensitiv deteksjon av biomolekyler og analyse av deres interaksjoner. Forbedrede fluorescerende fargestoffer muliggjør nå tidligere umulige studier av cellulære strukturer og cellulære prosesser. Fluorescerende etiketter gir mange fordeler, da de er svært følsomme selv ved lave konsentrasjoner, er stabile over lange perioder, og ikke forstyrrer funksjonen til målmolekylene. Målrettet avbildning av merkede celler gjør det mulig å spore dem in vitro og in vivo. Bruk av forskjellige fluoroforer i samme prøve kan også tillate samtidig observasjon av flere molekyler samtidig. De mest brukte fluoroforene Er Fluoresceinisotiocyanat (FITC), derivater av rhodamin (TRITC), kumarin og cyanin. Disse syntetiske organiske fargestoffer brukes til å merke biomolekyler som proteiner, peptider, antistoffer, nukleinsyrer, bakterier eller gjær. Naturlig forekommende fluorokromer, Som Grønt Fluorescerende Protein (GFP), kan også brukes til å merke levende celler genetisk.Fluorescerende proteinmerking gjør det mulig for forskere å undersøke konformasjonsdynamikken og molekylære interaksjoner av proteiner eller å spore bevegelsene deres for bedre å forstå deres biologiske funksjoner (Modesti M, 2011). For å få bedre innsikt i reseptor-ligandbinding, proteinstrukturer og enzymaktivitet, kan enkeltpeptider også merkes. Fluorokrommerkede antistoffer er mye brukt i biomedisinsk forskning for å oppdage antigener i immunfluorescensanalyser og er også viktige verktøy i immunodiagnostikk. For å sikre pålitelige resultater, bør fluoroforkonjugasjonen ikke forstyrre antigen-bindende egenskapene til antistoffet(Nath n et al, 2016).Fluorescensbaserte analyser spiller en viktig rolle i biofysiske studier av strukturen, funksjonen og dynamikken til nukleinsyrer. Nylige fremskritt innen merkingsmetoder og bildesystemer har tillatt direkte in vivo observasjon AV DNA og RNA, og deres interaksjoner med andre cellekomponenter. Levende celleavbildning av nukleinsyrer har åpnet nye veier for bedre forståelse av kromatinorganisasjon og genuttrykksregulering. (Dirks RW et al., 2018).
Komplekse polysakkarider, slik som heparin, er strukturelle komponenter i den ekstracellulære matrisen. Disse polysakkaridene er essensielle for cellulær adhesjon, migrasjon og vekst (Prigent-Richard S. et al, 1998). Noen forbindelser er også kjent for deres antikoagulerende, antitrombotiske, antiinflammatoriske, antivirale og antiangiogene egenskaper. Fluorescensbaserte metoder gjør det lettere å identifisere nye bioaktive polysakkarider og å karakterisere deres biologiske funksjoner(Roger O et al, 2002).Fluorescerende merking av lipider Cellulære lipider spiller en avgjørende rolle i cellen for energilagring, for dannelse av cellulære membraner og for intracellulære signalprosesser(Maekawa M. Og Fairn G, 2014). Den lipofile fargestoffet Nile red er mye brukt til å flekke intracellulære lipider for å analysere deres plassering og organisasjon (Greenspan P et al, 1985). Videre, for å studere lipiddynamikk, er spesifikk merking i levende celler også mulig (Schultz C et al, 2010).
Fluorescerende Merkingsteknikker
vanligvis brukte fluorescerende merkingsmetoder bruker kjemiske, enzymatiske, peptid/protein tag og genetiske merkingsteknikker (Sahoo H, 2012 , Toseland CP, 2013).Kjemisk merking teknikker: Fluoroforer dock til målet molekyler gjennom kjemisk modifikasjon(kovalent eller ikke-kovalent binding). Kjemiske merkingsmetoder har flere fordeler, da de er robuste, enkle å utføre og svært effektive med et bredt spekter av fluoroforer. De er mer egnet for in vitro-studier enn in vivo.Enzymatisk merking teknikker: Enzymatiske reaksjoner tillate rask, svært effektiv og selektiv merking in vivo og in vitro og kan brukes til å målrette proteiner eller hele celler. Men på grunn av den store størrelsen på etikettene, kan forstyrrelser med funksjonen til målmolekylene forekomme.Peptid/protein tag: en nylig utviklet, og svært lovende, teknikk tillater spesifikk og selektiv merking av proteiner gjennom inkorporering av korte fluorescerende koder som ikke forstyrrer folding eller funksjon av molekylet. Denne teknikken er også enkel å utføre og kan brukes til å undersøke forskjellige steder av enkeltproteiner avhengig av peptid tag spesifisitet.Genetisk merking: Genetisk merking kan oppnås ved hjelp av proteindomener, små peptider eller enkle aminosyrer som er merket med fluorescerende fargestoffer og kan spesifikt feste seg til steder langs kromosomer in vivo. Denne tilnærmingen tillater påvisning av kromosomale abnormiteter som slettinger eller duplisering.
Fluorescensbaserte Analyser
Fluorescensbaserte analyser stole på fluoroforers evne til å sende ut lys igjen etter eksponering for lyspartikler eller fotoner. Forskjellen i bølgelengde mellom eksitasjonslys og emisjonslys, det såkalte stokes-skiftet, kan detekteres i mikroskoper og bildesystemer. Hver fluorofor har et spesifikt stokes-skifte. Ulike analyser tillater forskere å lokalisere biomolekyler, observere dem i sanntid, undersøke samspillet og studere enzymatiske aktiviteter.
- Fluorescensmikroskopi
Fluorescensmikroskopi tillater identifisering av celler og cellekomponenter og overvåking av cellefysiologi med høy spesifisitet. Fluorescensmikroskopi skiller utsendt lys fra eksitasjon lys ved hjelp av optiske filtre. Bruken av to indikatorer tillater også samtidig observasjon av forskjellige biomolekyler samtidig. Mens konvensjonelle bildesystemer tillate en oppløsning på 200 til 300 nm på grunn av fysiske diffraksjon grenser, nye super-oppløsning fluorescens mikroskop SOM STED (stimulert utslipp uttømming) overvinne disse grensene og gi innsikt i nanoskala verden av molekyler(Sanderson MJ et al, 2014). - Flowcytometri
Flowcytometri er mye brukt i grunnforskning og klinisk praksis for å måle signalet fra spesifikke fluoroforer. Celler og partikler analyseres og til slutt sorteres i» sanntid » når de passerer gjennom lysstrålen av detektorer som kvantifiserer fluorescensen produsert av merkede antistoffer eller ligander. Disse markørene binder seg til bestemte molekyler på celleoverflaten eller inne i cellen, slik at de kan detekteres og kvantifiseres. Flere parametere som størrelse og volum kan måles på enkeltceller, og forskjellige celletyper kan isoleres og karakteriseres (Nolan JT Og Condello D, 2013). Flowcytometri finner bred anvendelse innen områder som immunologi, hematologi, transplantasjonsmedisin, onkologi og genetikk. - Fluorescens in situ hybridisering (FISH)
Fluorescens in situ hybridisering (FISH) tillater lokalisering av spesifikke DNA-sekvenser på kromosomer. Fluorescerende DNA-eller RNA-prober brukes til å hybridisere og identifisere komplementære mål-DNA-sekvenser. FISK har tradisjonelt blitt brukt til å kartlegge gener på kromosomer, for Eksempel Under Human Genome Project. I dag brukes fluorescens in situ hybridisering hovedsakelig til diagnostiske formål ved påvisning av kromosomale abnormiteter eller i analysen av kreftceller(O ‘ Connor C, 2008). - Fluorescens korrelasjonsspektroskopi (fcs)
Fluorescens korrelasjonsspektroskopi (FCS) tillater analyse av tidsmessige endringer i fluorescensintensiteten av fluorokromer, som er forårsaket av kjemiske, biologiske eller fysiske påvirkninger. FCS ble først introdusert for å undersøke samspillet mellom narkotika OG DNA og representerer nå et følsomt verktøy for å bestemme konsentrasjon og aggregeringsnivåer av proteiner, samt for å observere molekylære interaksjoner (Tian Y et al, 2011). - Mikroarrays
Mikroarrays tillater studiet av genuttrykk under forskjellige forhold. Tusenvis av gener kan undersøkes samtidig PÅ DNA-chips. Disse er mikroskopiske lysbilder trykt med små flekker som inneholder kjente DNA-sekvenser som selektivt kan binde seg til fluorescerende merkede mRNA / cDNA-molekyler. ETTER hybridisering blir DNA-brikken lest ut, og dataene brukes til å lage genuttrykksprofiler(Hoen PAC et al, 2003).
Fluorescerende Etikett: Live-Cell Imaging
den kinetiske observasjon av cellulære prosesser ved hjelp av time-lapse fluorescens mikroskopi har blitt en grunnleggende teknikk i cellebiologi, som live-cell imaging kan gi svært verdifull innsikt i cellevekst og transportmekanismer. En stor utfordring i time-lapse mikroskopi er å minimere fototoksiske effekter som følge av fotobleking. Lyseksponeringen ødelegger gradvis fluorescerende molekyler som fører til en reduksjon av fluorescenssignalet og til dannelsen av frie radikaler som kan skade cellene. Derfor er det avgjørende for metoden for levende celleavbildning å finne en balanse mellom å redusere lyseksponering så mye som mulig og få nyttige signaler for å observere cellene. Forskere trenger også å skape et fysiologisk miljø som tillater å nøye gjenskape in vivo dynamikk. (Ettinger Og Wittmann T, 2014).
PromoCell Fluorescerende Merking
tilgjengeligheten av nye fluoroforer har dramatisk endret mulighetene for sensitiv deteksjon av biomolekyler og analyse av deres interaksjoner. Forbedrede fluorescerende fargestoffer muliggjør nå tidligere umulige studier av cellulære strukturer og cellulære prosesser. PromoCell tilbyr et bredt spekter av fluoroforer av høy kvalitet for fluorescerende merking av ulike biomolekyler: proteinmerking, antistoffmerking ,nukleinsyremerking (DNA-merking, RNA-merking), samt komplette merkingssett og bruksklare fluorescerende konjugater.Våre Promofluorfarger er kostnadseffektive alternativer til velkjente, ledende fluoroforer og spenner bølgelengdespekteret fra blått til langt rødt. De viser en fremragende fluorescensintensitet og fotostabilitet, en sterk lysabsorpsjon, høy fluorescenskvantumutbytte og god vannløselighet og kan brukes til fluorescensmikroskopi, fluorescerende in situ hybridisering (FISH), fluorescenskorrelasjonsspektroskopi (FCS) og mikroarrays (protein, DNA). Noen av dem tilbyr et ekstra stort Stokes-skifte, noe som gjør dem ideelle for flerfarget merking eller flowcytometri-applikasjoner. Promofluorfarger er tilgjengelige f. eks. som nhs-estere, maleimider og amino-modifiserte etiketter klar for kovalent kobling eller som konjugater med biotin, falloidin og deoksynukleotider (dUTPs). Videre gir vi også Høy Kvalitet Protein& Antistoff Merking Kits med forskjellige PromoFluor fargestoffer.